CN113398234B - 一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药组合物技术领域,具体涉及一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物及其制备方法。该中药组合以甘松、党参、山药、川芎、丁香、姜半夏、白芍、莲房、天麻、芥子、绿豆、大枣、生姜、甘草中药原料按照一定的重量份数配比,煎煮后制成;经过实验证明,本发明中药组合物可以显著提高酒精代谢相关酶活性,抑制炎症因子的表达,从而达到显著醒酒护肝,改善急、慢性酒精中毒头晕、恶心、腹胀腹痛等症状的效果;另一方面,本发明中所采用的中药原料来源广泛、绿色安全,对机体基本没有毒副作用,且制备方法简单,使用方便,非常适用于临床中酒精中毒、肝损伤等疾病的防治。
Description
技术领域
本发明属于中药组合物技术领域。更具体地,涉及一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物及其制备方法。
背景技术
近年来,随着我国生活水平的提高,酒精消费逐年增加,同时,我国因过量摄入酒精引起的急性酒精中毒及急、慢性酒精摄入引起的相关疾病日益增多。酒精摄入人体后,主要通过胃粘膜(25%)和肠道(75%)吸收,大多数乙醇在肝脏实现内氧化代谢,乙醇先经肝代谢酶系统乙醇脱氢酶(ADH)转化为乙醛,再由乙醛脱氢酶(ALDH)催化氧化生成乙酸,最后分解为二氧化碳和水排出体外;当人体一次性大量摄入乙醇时,由于不能及时在肝脏氧化代谢,部分乙醇会通过酶或非酶系统产生大量氧自由基,引起脂质过氧化及氧化损伤,并刺激大量炎症因子释放,引发肝脏、脑、心脏等重要器官的炎性损害,造成急性酒精中毒,不但危害了患者的生命健康,且极易引发一系列的社会问题。
西医目前主要采用纳络酮治疗急性酒精中毒,该药物虽具有促清醒作用,但是在抑制酒精的胃肠吸收、加速酒精代谢、减少组织和细胞损伤及缓解患者诸多不适症状等方面无确切作用,且部分患者会遗留神经系统或者消化道病症,严重者还会诱发患者出现上消化道出血以及肝肾功能损伤等。中医方面主要是采用中药组合物来治疗急性酒精中毒,如中国专利申请CN104147173A公开了一种治疗急性酒精中毒的中药组合物,由大黄、葛根、山楂、茵陈、柴胡、扁豆、远志、酸枣仁按照一定的比例制成,具有排毒、解毒、健脾疏肝,养心安神之功,能有效解除急性酒精中毒及残存酒精对机体的延续损害效应;但是,该组合物只是对表面的不良反应有一定的改善,对于酒精造成的炎性损害的作用效果不明,作用效果有限;且作用机制也未可知,没有清楚的药理药效说明,极大地限制了其应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有西药对大部分酒精中毒的不适症状无确切作用,且容易造成多方面的不良反应;中药对于炎性损害的作用效果不明,作用效果有限,不清楚药理药效的缺陷和不足,提供一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物。
本发明的目的是提供一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物。
本发明另一目的是提供所述中药组合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述中药组合物在制备预防或治疗酒精中毒药物中的应用。
本发明另一目的是提供所述中药组合物在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松10~20份、党参6~15份、山药10~20份、川芎6~15份、丁香6~15份、姜半夏6~15份、白芍20~40份、莲房6~15份、天麻6~15份、芥子6~15份、绿豆30~50份、大枣3~9份、生姜3~9份、甘草3~9份。
急性酒精中毒属于中医学“酒毒、酒厥”的范畴,是指饮酒过量所引起的急性脏腑功能受损,会出现恶心呕吐、胁腹胀满、易怒易激、行走不稳或谵妄昏迷等症状,属中医常见急症。中医学认为,酒性湿热、味苦、有毒,酒可助湿生热、阻遏气机,轻则伤人脾胃,重则损人神气。本发明中药组合物以疏肝醒脾、护胃解毒为主,方中以党参、山药健脾护胃、补中益气,因胃为“水谷之海”,酒毒先入于胃而受之,而脾胃为气机升降之枢纽,脾升胃降为护肝驱毒之要;以绿豆之甘、寒清解胃中之酒热从小便出而不伤正;甘松理气醒脾,香温中降逆和胃,生姜温胃散寒,姜半夏降逆止呕;芥子豁痰利气、散结通络,以防酒热蕴结成痰阻塞息道,川芎、天麻活血平肝,以防酒毒及肝阳之盛上冲于脑;又因酒性湿热易伤于阴,故以白芍柔肝阴,莲房养胃阴;甘草、大枣护胃解毒和中,诸药合用共奏醒脾护肝解酒之效。
优选地,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松12~18份、党参8~12份、山药12~18份、川芎8~12份、丁香8~12份、姜半夏8~12份、白芍25~35份、莲房8~12份、天麻8~12份、芥子8~12份、绿豆30~45份、大枣4~6份、生姜4~6份、甘草4~6份。
更优选地,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松15份、党参10份、山药15份、川芎10份、丁香10份、姜半夏10份、白芍30份、莲房10份、天麻10份、芥子10份、绿豆45份、大枣5份、生姜5份、甘草5份。
另外的,本发明还提供了所述中药组合物的制备方法,包括以下步骤:
按照重量份称取原料,加入水煎煮1~3次,每次煎煮不少于30min,过滤,合并滤液,浓缩至生药量0.3~5g/ml,即得。
另外的,本发明还提供了所述中药组合物在制备预防或治疗酒精中毒药物中的应用。
进一步地,所述酒精中毒为急性酒精中毒或慢性酒精中毒。
更进一步地,所述中药组合物提高乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶或超氧化物歧化酶的活性,提高谷胱甘肽的含量。
进一步地,所述中药组合物降低丙二醛、一氧化氮、血清天门冬氨酸氨基转移酶或丙氨酸氨基转移酶的含量。
更进一步地,所述中药组合物抑制炎症因子TNFα、IL-1β或NF-kB mRNA的表达,促进抗氧化因子Nrf-2mRNA的表达。
另外的,本发明还提供了所述中药组合物在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。
本发明具有以下有益效果:
本发明以甘松、党参、山药、川芎、丁香、姜半夏、白芍等中药原料按照一定的重量份数配比,煎煮后制成的组合物经过实验证明,本发明中药组合物可以显著提高酒精代谢相关酶活性,抑制炎症因子的表达,从而达到显著醒酒护肝,改善急、慢性酒精中毒头晕、恶心、腹胀腹痛等症状的效果;另一方面,本发明中所采用的中药原料来源广泛、绿色安全,对机体基本没有毒副作用,且制备方法简单,使用方便,非常适用于临床中酒精中毒、肝损伤等疾病的防治。
附图说明
图1为实施例1本发明中药组合物有效剂量组合预防性给药时对急性酒精中毒小鼠醉酒时间、醒酒时间和肝脏指数的影响。
图2为实施例2本发明中药组合物有效剂量组合事后给药时对急性酒精中毒小鼠醉酒时间、醒酒时间和肝脏指数的影响。
图3为实施例3本发明中药组合物事前事后两次给药时对急性酒精中毒小鼠醉酒时间和醒酒时间的影响。
图4为实施例3本发明中药组合物事前事后两次给药时对急性酒精中毒小鼠肝组织乙醇脱氢酶(ADH)及乙醛脱氢酶(ALDH)的影响。
图5为实施例3本发明中药组合物事前事后两次给药时对急性酒精中毒小鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响。
图6为实施例3本发明中药组合物事前事后两次给药时对急性酒精中毒小鼠肝组织丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、肝脏指数的影响。
图7为实施例3本发明中药组合物事前事后两次给药时各组小鼠肝组织苏木素-伊红染色图。
图8为实施例4本发明中药组合物事后用药时对急性酒精中毒小鼠醉酒时间和醒酒时间的影响。
图9为实施例4本发明中药组合物事后用药时对急性酒精中毒小鼠肝组织乙醇脱氢酶(ADH)及乙醛脱氢酶(ALDH)的影响。
图10为实施例4本发明中药组合物事后用药时对急性酒精中毒小鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响。
图11为实施例4本发明中药组合物事后用药时对急性酒精中毒小鼠肝组织丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、肝脏指数的影响。
图12为实施例4本发明中药组合物事后用药时各组小鼠肝组织苏木素-伊红染色图。
图13为实施例5本发明中药组合物事前事后两次给药时对急性酒精中毒小鼠肝组织中IL-1β、NF-kB、TNFα、和Nrf-2mRNA的表达的影响。
图14为实施例5本发明中药组合物事后用药时对急性酒精中毒小鼠肝组织中IL-1β、NF-kB、TNFα、和Nrf-2mRNA的表达的影响。
图15为实施例6本发明中药组合物对严重醉酒患者相关症状评分的影响。
其中,与模型组相比较,a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001,d:P<0.0001;与模型组相比较,***:P<0.001,**:P<0.01,*:P<0.05。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松20g、党参15g、山药20g、川芎15g、丁香15g、姜半夏15g、白芍40g、莲房15g、天麻15g、芥子15g、绿豆45g、大枣5g、生姜5g、甘草5g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水1000毫升,煎煮60分钟,6层纱布过滤药液,再加水500毫升,复煎30分钟,将2次药液混合后,分别浓缩为生药1g/mL、2g/mL和4g/mL三种不同浓度药液,4℃保存备用。
实验试剂:56度红星二锅头(北京红星股份有限公司);美他多辛(浙江震元药业)。
实验动物:2月龄SPF级昆明小鼠60只,雌雄各半,体重25±2g,购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034],饲养于广州中医药大学实验动物中心[SYXK(粤)2018-0001],常规喂养,自由饮水。
2、实验方法
(1)分组及事前干预
将60只昆明小鼠随机分为6组:正常组,模型组,中药组合物低剂量组(10g/Kg),中药组合物中剂量组(20g/Kg),中药组合物高剂量组(40g/Kg),阳性药组(美他多辛500mg/Kg);中药组合物各组及阳性药组予上述剂量药物以20mL/Kg体积灌胃1次,正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃。
(2)建立急性酒精中毒小鼠模型
事前给药干预0.5h后,除外正常组,其余各组均采用56度食用白酒一次性灌胃(每千克体重予13.25mL乙醇)构建急性酒精中毒小鼠模型,正常对照组及模型组予等体积0.9%生理盐水灌胃。
(3)观察与取材
持续观察记录小鼠醉酒率、死亡率、醉酒时间(从清醒到翻正反射消失的时间)和醒酒时间(从醉酒到翻正反射回复的时间);于酒精灌胃4h后脱颈椎处死小鼠,解剖腹腔分离完整小鼠肝组织并称重。
3、实验结果
实验结果参见表1~2和图1。
表1实施例1小鼠醉酒率和死亡率(n=10)
组别 | 醉酒数/只 | 醉酒率/% | 死亡数/只 | 死亡率/% |
模型组 | 10 | 100 | 2 | 20 |
中药低剂量组 | 10 | 100 | 0 | 0 |
中药中剂量组 | 8 | 80 | 0 | 0 |
中药高剂量组 | 7 | 70<sup>a</sup> | 0 | 0 |
美他多辛组 | 9 | 90 | 0 | 0 |
费希尔精确检验:与模型组相比较,aP<0.05。
表2实施例1小鼠醉酒时间、醒酒时间和肝脏指数(n=10)
组别 | 醉酒时间/min | 醒酒时间/min | 肝脏指数/% |
正常组 | - | - | 4.4±0.36<sup>d</sup> |
模型组 | 20.6±6.42 | 296.1±21.58 | 5.09±0.45 |
中药低剂量组 | 30.7±8.22 | 161.9±25.75<sup>d</sup> | 4.52±0.36<sup>c</sup> |
中药中剂量组 | 76.9±15.64<sup>d</sup> | 129.7±25.01<sup>d</sup> | 4.35±0.26<sup>d</sup> |
中药高剂量组 | 80.8±12.59<sup>d</sup> | 37.3±10.53<sup>d</sup> | 4.46±0.19<sup>c</sup> |
美他多辛组 | 39.1±7.56<sup>b</sup> | 124.2±13.64<sup>d</sup> | 4.48±0.25<sup>c</sup> |
One-way ANOVA data分析:与模型组相比较,bP<0.01,cP<0.001,dP<0.0001。
采用本发明中药组合物以有效范围剂量分别以高(40g/Kg)、中(20g/Kg)、低(10g/Kg)三个浓度于小鼠酒精灌胃前给药,可显著降低醉酒率,减少小鼠死亡率,并能有效延长急性酒精中毒小鼠醉酒时间,缩短醒酒时间;此外,与模型组相比较,本发明中药组合物给药组肝脏指数明显下降。上述结果表明,本发明中药组合物有效范围剂量具有显著解酒、促醒和护肝作用。
实施例2
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松10g、党参6g、山药10g、川芎6g、丁香6g、姜半夏6g、白芍20g、莲房6g、天麻6g、芥子6g、绿豆30g、大枣5g、生姜5g、甘草5g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水1000毫升,煎煮60分钟,6层纱布过滤药液,再加水500毫升,复煎30分钟,将2次药液混合后分别浓缩为生药1g/mL、2g/mL和4g/mL三种不同浓度药液,4℃保存备用。
实验试剂:56度红星二锅头(北京红星股份有限公司);美他多辛(浙江震元药业)。
实验动物:2月龄SPF级昆明小鼠60只,雌雄各半,体重25±2g,购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034],饲养于广州中医药大学实验动物中心[SYXK(粤)2018-0001],常规喂养,自由饮水。
2、试验方法
(1)分组及建立急性酒精中毒小鼠模型
将60只昆明小鼠随机分为6组:正常组,模型组,中药组合物低剂量组(10g/Kg),中药组合物中剂量组(20g/Kg),中药组合物高剂量组(40g/Kg),阳性药组(美他多辛500mg/Kg);除外正常组,其余各组均采用56度食用白酒一次性灌胃(每千克体重予13.25mL乙醇)构建急性酒精中毒小鼠模型,正常对照组及模型组予等体积0.9%生理盐水灌胃。
(2)事后干预
给酒后立即以中药组合物各组及阳性药组分别予对应剂量及药物以20mL/Kg体积灌胃1次,正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃。
(3)观察与取材
持续观察记录小鼠醉酒率、死亡率、醉酒时间(从清醒到翻正反射消失的时间)和醒酒时间(从醉酒到翻正反射回复的时间);于酒精灌胃4h后脱颈椎处死小鼠,解剖腹腔分离完整小鼠肝组织并称重。
3、实验结果
实验结果参见表3~4和图2。
表1实施例2小鼠醉酒率和死亡率(n=10)
组别 | 醉酒数/只 | 醉酒率/% | 死亡数/只 | 死亡率/% |
模型组 | 10 | 100 | 2 | 20 |
中药低剂量组 | 10 | 100 | 0 | 0 |
中药中剂量组 | 9 | 90 | 0 | 0 |
中药高剂量组 | 8 | 80 | 0 | 0 |
美他多辛组 | 9 | 90 | 0 | 0 |
费希尔精确检验:与模型组相比较,aP<0.05。
表2实施例2小鼠醉酒时间、醒酒时间和肝脏指数(n=10)
组别 | 醉酒时间/min | 醒酒时间/min | 肝脏指数/% |
正常组 | - | - | 4.4±0.4<sup>d</sup> |
模型组 | 18.7±5.85 | 287.6±24.72 | 5.07±0.31 |
中药低剂量组 | 24.6±5.43 | 145.2±19.51<sup>d</sup> | 4.71±0.33<sup>a</sup> |
中药中剂量组 | 59.5±10.41<sup>d</sup> | 121.2±15.75<sup>d</sup> | 4.5±0.24<sup>c</sup> |
中药高剂量组 | 60.4±8.37<sup>d</sup> | 36.3±8.51<sup>d</sup> | 4.42±0.26<sup>d</sup> |
美他多辛组 | 39.7±7.55<sup>d</sup> | 117.3±13.78<sup>d</sup> | 4.38±0.28<sup>d</sup> |
One-way ANOVA data分析:与模型组相比较,aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001,dP<0.0001。
采用本发明中药组合物以有效范围剂量分别高(40g/Kg)、中(20g/Kg)、低(10g/Kg)三个浓度于小鼠酒精灌胃后给药,可显著降低醉酒率,减少小鼠死亡率,并能有效缩短酒精中毒小鼠醒酒时间,虽预防醉酒的作用不如是实施例1,但能有效缩短醒酒时间,有更好的促醒作用;此外,与模型组相比较,本发明中药组合物给药组肝脏指数明显下降。上述结果表明,本发明中药组合物有效范围剂量事后给药亦具有显著解酒、促醒和护肝作用。
实施例3
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松15g、党参10g、山药15g、川芎10g、丁香10g、姜半夏10g、白芍30g、莲房10g、天麻10g、芥子10g、绿豆50g、大枣5g、生姜5g、甘草10g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水1000毫升,煎煮60分钟,6层纱布过滤药液,再加水500毫升,复煎30分钟,将2次药液混合后分别浓缩为生药0.5g/mL、1g/mL和2g/mL三种不同浓度药液,4℃保存备用。
实验试剂:56度红星二锅头(北京红星股份有限公司);美他多辛(浙江震元药业);苏木素-伊红(H-E)染液、4%多聚甲醛(广州友田生物科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司);乙醇脱氢酶(ADH)测定试剂盒、乙醛脱氢酶(ALDH)活性测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒、丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、一氧化氮(NO)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司);
实验动物:2月龄SPF级昆明小鼠36只,雌雄各半,体重25±2g,购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034],饲养于广州中医药大学实验动物中心[SYXK(粤)2018-0001],常规喂养,自由饮水。
2、实验方法
(1)分组及事前干预
将72只昆明小鼠随机分为6组:正常组,模型组,中药组合物低剂量组(5g/Kg),中药组合物中剂量组(10g/Kg),中药组合物高剂量组(20g/Kg),阳性药组(美他多辛500mg/Kg);中药组合物各组及阳性药组予上述剂量药物以20mL/Kg体积灌胃1次,正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃。
(2)建立急性酒精中毒小鼠模型
事前给药干预5小时后,除外正常组,其余各组均采用56度食用白酒一次性灌胃(每千克体重予13.25mL乙醇)构建急性酒精中毒小鼠模型,正常对照组及模型组予等体积0.9%生理盐水灌胃。
(3)事后干预
酒精灌胃30分钟后,中药组合物各组及阳性药组予(1)中所述剂量药物以20mL/Kg体积灌胃1次,正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃。
(4)观察与取材
持续观察记录小鼠醉酒率、死亡率、醉酒时间(从清醒到翻正反射消失的时间)和醒酒时间(从醉酒到翻正反射回复的时间);于酒精灌胃5h后脱颈椎处死小鼠,摘眼球取血,解剖腹腔分离完整小鼠肝组织并称重,用0.9%生理盐水清洁肝脏组织,于肝左叶门静脉旁0.5cm左右处取材数块,分别浸泡于4%多聚甲醛溶液、TRIzol RNA分离液及原样-80℃冻存;采集的血液于4℃静置2h,6000rpm/4℃/6min离心后分装血清,-80℃保存。
(5)肝组织及血清各项指标测定
称取适量肝组织加入0.9%生理盐水,冰上匀浆制备成10%肝组织匀浆,采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白样本浓度;采用相应的试剂盒测定肝组织乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)等含量;采用相应的试剂盒测定血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量;计算肝脏指数;
(6)肝脏病理切片及苏木素-伊红染色
肝组织于4%多聚甲醛中固定24~48h后依次脱水、透明、浸蜡、包埋;将蜡块于包埋组织最大横截面处切成厚4um的薄片,于39℃温水摊片,50℃烤片;脱蜡至水后,按顺序将切片置于苏木素溶液染色15~20min,流水冲净苏木素,0.5%盐酸酒精溶液分化2~8s,蒸馏水3~10s,PBS中反蓝1~2min,70%酒精中脱水1~2min,伊红醇溶液染色3~10s,95%酒精3~10s,脱水、透明后用中性树胶封片。
3、实验结果
实验结果参见图3~7。
采用本发明中药组合物以优选用量分别高(20g/Kg)、中(10g/Kg)、低(5g/Kg)三个浓度于小鼠酒精灌胃前、后各给药1次,可有效延长急性酒精中毒小鼠醉酒时间,缩短醒酒时间;
中药组合物高中低剂量组小鼠肝组织乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量均显著高于模型组(P<0.05);中药组合物高中低剂量组小鼠肝组织丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量及血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量显著低于模型组(P<0.05);
此外,小鼠肝组织病理切片显示,模型组小鼠肝组织中肝索排列不规则,肝血窦扩张充血,部分肝细胞胞浆疏松染,并伴有炎细胞浸润;给药组小鼠肝细胞排列相对整齐,肝血窦扩张充血相对减轻,肝细胞胞浆疏松淡染及炎细胞浸润相对较少。
上述结果表明,本发明中药组合物预防性给药对酒精中毒有明显的预防作用,可以有效延长急性酒精中毒小鼠醉酒时间,缩短醒酒时间,能增加乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的活性,加速速乙醇代谢,同时减少脂质过氧化,增加抗氧化因子活性,对乙醇所致的急性肝脏损伤及氧化损伤有显著的保护作用。
实施例4
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松15g、党参10g、山药15g、川芎10g、丁香10g、姜半夏10g、白芍30g、莲房10g、天麻10g、芥子10g、绿豆45g、大枣5g、生姜5g、甘草5g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水1000毫升,煎煮60分钟,6层纱布过滤药液,再加水500毫升,复煎30分钟,将2次药液混合后分别浓缩为生药1g/mL、2g/mL和4g/mL三种不同浓度药液,4℃保存备用。
实验试剂:56度红星二锅头(北京红星股份有限公司);美他多辛(浙江震元药业);苏木素-伊红(H-E)染液、4%多聚甲醛(广州友田生物科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司);乙醇脱氢酶(ADH)测定试剂盒、乙醛脱氢酶(ALDH)活性测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒、丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、一氧化氮(NO)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司);
实验动物:2月龄SPF级昆明小鼠36只,雌雄各半,体重25±2g,购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034],饲养于广州中医药大学实验动物中心[SYXK(粤)2018-0001],常规喂养,自由饮水。
2、实验方法
(1)分组及建立急性酒精中毒小鼠模型
将36只昆明小鼠随机分为6组:正常组,模型组,中药组合物低剂量组(10g/Kg),中药组合物中剂量组(20g/Kg),中药组合物高剂量组(40g/Kg),阳性药组(美他多辛500mg/Kg);除外正常组,其余各组均采用56度食用白酒一次性灌胃(每千克体重予13.25mL乙醇)构建急性酒精中毒小鼠模型,正常对照组及模型组予等体积0.9%生理盐水灌胃。
(2)事后干预
给酒后立即以中药组合物及阳性药组分别予对应剂量及药物以20mL/Kg体积灌胃1次,正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃。
(3)观察与取材
持续观察记录小鼠醉酒率、死亡率、醉酒时间(从清醒到翻正反射消失的时间)和醒酒时间(从醉酒到翻正反射回复的时间);于酒精灌胃4h后脱颈椎处死小鼠,摘眼球取血,解剖腹腔分离完整小鼠肝组织并称重,用0.9%生理盐水清洁肝脏组织,于肝左叶门静脉旁0.5cm左右处取材数块,分别浸泡于4%多聚甲醛溶液、TRIzol RNA分离液及原样-80℃冻存;采集的血液于4℃静置2h,6000rpm/4℃/6min离心后分装血清,-80℃保存。
(4)肝组织及血清各项指标测定
称取适量肝组织加入0.9%生理盐水,冰上匀浆制备成10%肝组织匀浆,采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白样本浓度;采用相应的试剂盒测定肝组织乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)等含量;采用相应的试剂盒测定血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量;计算肝脏指数;
(5)肝脏病理切片及苏木素-伊红染色
肝组织于4%多聚甲醛中固定24~48h后依次脱水、透明、浸蜡、包埋;将蜡块于包埋组织最大横截面处切成厚4um的薄片,于39℃温水摊片,50℃烤片;脱蜡至水后,按顺序将切片置于苏木素溶液染色15~20min,流水冲净苏木素,0.5%盐酸酒精溶液分化2~8s,蒸馏水3~10s,PBS中反蓝1~2min,70%酒精中脱水1~2min,伊红醇溶液染色3~10s,95%酒精3~10s,脱水、透明后用中性树胶封片。
3、实验结果
实验结果参见图8~12。
采用本发明中药组合物优选用量,以高(40g/Kg)、中(20g/Kg)、低(10g/Kg)三个浓度于小鼠酒精灌胃后0.5h内灌胃给药,可有效缩短醒酒时间,减轻急性酒精中毒所致的肝损伤和氧化损伤。
中药组合物高中低剂量组小鼠肝组织乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)活性均显著高于模型组(P<0.05),表明本发明中药组合物饮酒后给药可加速乙醇氧化代谢,有显著的解酒作用;中药组合物高中低剂量组小鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量均显著高于模型组(P<0.05),表明本发明中药组合物饮酒后给药增加抗氧化因子活性,对乙醇所致的氧化损伤有显著的保护作用;中药组合物高中低剂量组小鼠肝组织丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量及血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量显著低于模型组(P<0.05),表明本发明中药组合物饮酒后给药可抑制大量乙醇摄入所致的肝脏损伤,同时减少脂质过氧化,对乙醇所致的急性肝损伤和氧化损伤有显著的保护作用。
此外,小鼠肝组织病理切片显示,模型组小鼠肝组织肝血窦扩张充血,伴有大量炎细胞浸润;给药组小鼠肝细胞排列相对整齐,肝血窦扩张充血相对减轻,炎细胞浸润相对较少。
上述结果表明本发明中药组合物事后给药可以对酒精中毒所致的急性肝损伤有明显的保护作用。
实施例5
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松15g、党参10g、山药15g、川芎10g、丁香10g、姜半夏10g、白芍30g、莲房10g、天麻10g、芥子10g、绿豆45g、大枣5g、生姜5g、甘草5g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水1000毫升,煎煮60分钟,6层纱布过滤药液,再加水500毫升,复煎30分钟,将2次药液混合后分别浓缩为生药1g/mL、2g/mL和4g/mL三种不同浓度药液,4℃保存备用。
定量PCR引物:运用美国ABI Primer Express 3.0软件设计,由金唯智生物技术有限公司(苏州)合成,具体见表5。
表5定量PCR引物列表
实验试剂:TRIzol RNA分离试剂(Thermo Fisher,美国);SYBR Green Real timePCR Master Mix(TAKARA,日本);RevertAid Reverse Transcrip tase(Thermo Fisher,美国)。
2、实验方法
(1)将实施例1(事前干预)、实施例2(事后干预)中急性酒精中毒小鼠,于酒精灌胃4h后脱颈椎处死,解剖腹腔于肝左叶门静脉旁0.5cm左右处取肝组织约50mg浸泡于500μLTRIzol RNA分离液中,-80℃保存,并在取材后2周内于冰上匀浆制,备成肝组织匀浆液。
(2)实时荧光定量RT-PCR用Trizol法提取小鼠肝组织总RNA,以GAPDH为内参基因,检测白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、核因子kB(nuclear factor kB,NFkB)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、核转录因子红系2相关因子2(nuclearfactor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)mRNA表达;取组织总RNA 2μL按ThermoScientific公司的RevertAid Reverse Transcriptase说明将其逆转录为cDNA;将逆转录后的cDNA做10倍稀释,以GAPDH为内参基因,取等量cDNA(2μL)进行染料法PCR反应:反应条件为95℃预变性30s;95℃5s,60℃30s,40个循环;溶解曲线95℃15s,60℃30s,95℃15s;统计时以目的基因与内参基因之比值作为最终相对定量值。
3、实验结果
实验结果参见图13~14。
实验结果显示,与模型组相比较,本发明中药组合物在饮酒前或饮酒后给药对肝组织炎症相关因子TNFα、IL-1β和NF-kB mRNA的表达具有显著的抑制作用(P<0.05),并对显著增加了抗氧化因子Nrf-2mRNA的表达(P<0.05)。由此可知,本发明中药组合物在饮酒前或饮酒后给药对急性酒精中毒所致的肝损伤和氧化损伤有一定的预防保护作用,其作用机制可能是通过抑制NF-KB信号通路和激活Nrf2信号通路,减少脂质过氧化,增加抗氧化因子活性实现的。
实施例6
1、实验材料
一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物:甘松15g、党参10g、山药15g、川芎10g、丁香10g、姜半夏10g、白芍30g、莲房10g、天麻10g、芥子10g、绿豆30g、大枣5g、生姜5g、甘草5g(以上药材均由广东省中医院(芳村分院)中药房提供);按照重量称取上述中药,加水煎煮2次,每次加水量以漫过药物为度,每次煎煮30min以上,每次煎出一碗药汁(约200~400ml),将两次煎煮所得混合,分二次服用。
2、病例选择及方法
选择饮白酒度数大于等于42度,饮酒量3h内大于200ml且出现头晕、走路不稳,呕吐、狂躁或抑郁表现、意识不清等严重醉酒症状者6例,年龄40~55岁之间,且平时正常工作、活动,无各系统严重疾病,无乙肝、肝硬化、肿瘤、严重胃溃疡病等特殊疾病。
分组及用药方案:6例分为A、B组,每组3例;A、B组身体状况及年龄无显著性差异,其中A组在饮酒结束后2小时内,饮中药一次,3小时候再饮一次;B组饮酒结束后2小时内喝浓绿茶约300ml,3小时候再饮一次浓绿茶300ml。
观察指标:主要观察二次用药完毕后3小时时的症状,包括头晕、恶心呕吐、腹胀腹痛、精神神志情况,并进行症状评分,每个症状均分为“严重”、“中等”、“轻微”,其中“严重”为6~10分,“中等”为3~5分,“轻微”为1~2分。
统计分析方法:因病例较少,因此仅以均数大小比较。
4、实验结果
表6中药组合物对严重醉酒患者相关症状评分的影响
组别 | 头晕(评分) | 恶心呕吐(评分) | 腹胀腹痛(评分) | 精神神志(评分) |
A组 | 1.67±0.47 | 1.33±0.47 | 1.0±0 | 1.67±0.47 |
B组 | 5.67±0.94 | 4.67±0.47 | 8.67±0.47 | 6±0.82 |
实验结果参见表6和图15,观察结果显示,服用两次本发明中药组合物3小时后的严重醉酒者较饮两次绿浓茶的严重醉酒者头晕、恶心、腹胀腹痛、精神神志症状积分显著降低,显示了本发明中药组合物对严重醉酒者有较好的解酒作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有显著醒酒护肝作用的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松10~20份、党参6~15份、山药10~20份、川芎6~15份、丁香6~15份、姜半夏6~15份、白芍20~40份、莲房6~15份、天麻6~15份、芥子6~15份、绿豆30~50份、大枣3~9份、生姜3~9份、甘草3~9份。
2.根据权利要求1所述中药组合物,其特征在于,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松12~18份、党参8~12份、山药12~18份、川芎8~12份、丁香8~12份、姜半夏8~12份、白芍25~35份、莲房8~12份、天麻8~12份、芥子8~12份、绿豆30~45份、大枣4~6份、生姜4~6份、甘草4~6份。
3.根据权利要求2所述中药组合物,其特征在于,所述中药组合物主要由以下重量份的原料制成:甘松15份、党参10份、山药15份、川芎10份、丁香10份、姜半夏10份、白芍30份、莲房10份、天麻10份、芥子10份、绿豆45份、大枣5份、生姜5份、甘草5份。
4.权利要求1~3任一所述中药组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
按照重量份称取原料,加入水煎煮1~3次,每次煎煮不少于30min,过滤,合并滤液,浓缩至生药量0.3~5g/ml,即得。
5.权利要求1~3任一所述中药组合物在制备预防或治疗酒精中毒药物中的应用,其特征在于,所述酒精中毒为急性酒精中毒。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述中药组合物提高乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶或超氧化物歧化酶的活性,提高谷胱甘肽的含量。
7.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述中药组合物降低丙二醛、一氧化氮、血清天门冬氨酸氨基转移酶或丙氨酸氨基转移酶的含量。
8.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述中药组合物抑制炎症因子TNFα、IL-1β或NF-kB mRNA的表达,促进抗氧化因子Nrf-2mRNA的表达。
9.权利要求1~3任一所述中药组合物在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用,其特征在于,所述肝损伤由急性酒精中毒引起。
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