CN113396326A - 用于分子诊断的设备和方法 - Google Patents

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理查德·克罗克特
艾伦·布莱克
迈克尔·卡尔伯格
约翰·卢弗
克里斯·克勒韦尔·尼
马修·弗林特·开普勒
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Nucleic Acid Co ltd
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Abstract

本公开涉及一种用于分子诊断的设备和方法。某些实施方式包括活塞，该活塞从与壳体的第一端部邻近的第一位置循环至与壳体的第二端部邻近的第二位置、并返回至与壳体的第一端部邻近的第一位置。在一些实施方式中，本公开涉及不包括活塞的用于分子诊断的装置、方法和系统。

Description

用于分子诊断的设备和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月19日提交的序列号为62/781,735的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请的全部内容通过参引并入本文。
技术领域
本公开涉及用于分子诊断的设备和方法。更具体地，本公开涉及通过可以提供即时诊断的便携式装置来执行分子诊断。
背景技术
分子诊断可以提供许多益处，包括疾病、紊乱或其他与遗传健康相关状况的早期检测。许多分子诊断技术基于对从生物样本(例如如本文公开的血液、唾液或其他物质)中提取和扩增的特定核酸、即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两者进行的检测和识别。因此，尽管分子诊断提供了许多益处，但典型的分子诊断设备复杂、昂贵、不便携、并且需要额外的设备和技术专家以进行样本准备、分析等。
尽管存在与典型装置相关联的障碍，但是分子诊断测试仍具有改善医疗保健服务、提高患者治疗效果和个性化患者护理的可能性。鉴于上述情况，存在对由适于即时使用的独立、便宜、易于使用、便携式装置提供的分子诊断的需要。
发明内容
简而言之，本公开提供了包括活塞的用于分子诊断的装置、方法和系统，其中，该活塞在两个或更多个位置之间移动以使流体在两个或更多个温度之间循环。在一些实施方式中，本公开提供了不包括活塞的用于分子诊断的装置、方法和系统。
某些实施方式包括用于进行分子诊断的设备，其中该设备包括：壳体，该壳体包括第一端部和第二端部；设置在壳体内的活塞；第一热源，该第一热源设置成靠近壳体的第一端部；以及致动器，该致动器配置成使活塞以循环的方式在第一位置与靠近壳体的第二端部的第二位置之间移动、并且返回至靠近壳体的第一端部的第一位置。在一些实施方式中，在使活塞于第一位置与第二位置之间循环多次之后，致动器可以在循环过程完成时使活塞停在第一位置或第二位置处。在特定实施方式中，流体的至少一部分在循环期间沿与活塞相反的方向移动。在某些实施方式中，检测模块在扩增期间实时检测来自分析物的响应。在特定实施方式中，检测模块在扩增循环内检测来自分析物的响应。在一些实施方式中，扩增循环具有可变长度。
一些实施方式还包括靠近壳体的第二端部的第二热源。在具体实施方式中，第一热源包括第一加热线圈，该第一加热线圈配置成当向第一加热线圈施加电流时使壳体的第一端部的温度增加；并且第二热源包括第二加热线圈，该第二加热线圈配置成当向第二加热线圈施加电流时使壳体的第二端部的温度增加。某些实施方式还包括配置成插入到壳体中的反应腔室插入件或筒。在特定实施方式中，反应腔室插入件在使用期间包含反应流体。在一些实施方式中，反应流体在使用期间(例如，当使用衬套、插入件或其他中间材料时)不接触活塞和壳体。在特定实施方式中，壳体包括配置成使核酸序列或多个核酸序列经由热循环而复制(即扩增)的流体。在某些实施方式中，核酸是DNA或RNA或XNA。
在特定实施方式中，活塞构造成当活塞处于第一位置时将流体的至少一部分引导至壳体的第二端部；并且活塞构造成当活塞处于第二位置时将流体的至少一部分引导至壳体的第一端部。在一些实施方式中，流体包含用于扩增或复制(例如，通过定性、定量或半定量的PCR、RT-PCR或其他热循环或等温技术)的试剂。在一些实施方式中，流体包含聚合酶链式反应(PCR)试剂，比如用于下述各者的试剂：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、不对称PCR、热启动PCR、甲基化特异性PCR、等位基因特异性PCR、组装PCR、对流PCR、拨出PCR(Dial-out PCR)、数字PCR、解旋酶依赖性扩增、硅型PCR、序列间特异性PCR、反向PCR、连接介导PCR、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增、纳米粒子辅助PCR、重叠延伸PCR、PAN-AC、RNA H依赖性PCR、单个特异性引物PCR、固相PCR、自杀式PCR、热不对称交错PCR、等温PCR、降落式PCR、通用快速步行PCR(universal fast walking PCR)、极限PCR、光子PCR、冷却PCR或热脉冲扩展PCR。特定实施方式还包括照射模块，该照射模块配置成对包含在流体中的一种或更多种分析物进行照射。某些实施方式还包括检测模块，该检测模块配置成对来自包含在流体中的一种或更多种分析物的响应进行检测。特定实施方式还包括控制器，该控制器配置成控制致动器和第一热源。特定的其他实施方式还包括配置成对多于一个的热源进行控制的控制器。
在一些实施方式中，控制器配置成：将第一热源控制成将靠近壳体的第一端部的流体加热至约85摄氏度与100摄氏度之间、比如85摄氏度与90摄氏度之间、或90摄氏度与99摄氏度之间的温度；并且将第二热源控制成将靠近壳体的第二端部的流体加热至约50摄氏度与75摄氏度之间、比如约55度与70度之间的温度；以及使活塞从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环约20个循环至60个循环、比如约25个循环至55个循环。在一些实施方式中，控制器配置成：将第一热源控制成将靠近壳体的第一端部的流体加热至约92摄氏度与98摄氏度之间的温度；并且将第二热源控制成将靠近壳体的第二端部的流体加热至约60摄氏度与65摄氏度之间的温度；以及使活塞从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环约30个循环至50个循环。在一些实施方式中，控制器配置成：将第一热源控制成将靠近壳体的第一端部的流体加热至约92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃的温度；以及将第二热源控制成将靠近壳体的第二端部的流体加热至约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃的温度；以及使活塞从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环约30个循环至35个循环、35个循环至40个循环、40个循环至45个循环或45个循环至50个循环。在特定实施方式中，致动器包括：至少一个线圈；以及设置在活塞内的磁性元件，其中，所述至少一个线圈配置成当向所述至少一个线圈施加电流时对磁性元件施加力。
在一些实施方式中，控制器配置成：对于一个或更多个循环而言将第一热源控制成将靠近壳体的第一端部的流体加热至90℃至99°之间的初始温度，并且随后对于前述一个或更多个循环而言加热至约78℃与98℃之间的平均温度，并且将第二热源控制成将靠近壳体的第二端部的流体的至少一部分加热至约34℃与75℃之间的平均温度并使活塞在第一位置与第二位置之间循环至少5个循环至10个循环。在一些实施方式中，活塞在第一位置与第二位置之间循环至少3个循环、比如4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个循环。在一些实施方式中，控制器配置成将第一热源控制成对于一个或更多个循环而言将靠近壳体的第一端部的流体加热至90℃至99℃之间的初始温度(例如90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃)，并且随后对上述一个或更多个循环而沿加热至约78℃与98℃之间(例如，约78℃与80℃之间、约80℃与85℃之间、约85℃与90℃之间、约90℃与95℃之间、或约95℃与98℃之间)的平均温度，并且将第二热源控制成将靠近壳体的第二端部的流体的至少一部分加热至约34℃与75℃之间(例如，约34℃与40℃之间、约40℃与45℃之间、约45℃与50℃之间，约50℃与55℃之间、约55℃与60℃之间、约60℃与65℃之间、65℃与70℃之间、或约70℃与75℃之间)的平均温度，并且使活塞在第一位置与第二位置之间循环至少5个循环至10个循环。在一些实施方式中，活塞在第一位置与第二位置之间循环至少3个循环，比如4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个循环。在一些实施方式中，温度范围可以基于目标核酸的组蛋白乙酰化或甲基化物来优化。在其他实施方式中，温度范围可以基于碱基配对动力学来优化，例如碱基对的GC含量或差异测序(Lorenz，聚合酶链式反应：Basic Protocol PlusTroubleshooting and Optimization Strategies(基本协议加故障排除和优化策略)，JVis Exp.2012；(63)：3998；Roux,Optimization and troubleshooting in PCR(PCR中的故障排除和优化),Cold Spring Harb Protoc.2009；Robertson JM,Walsh-Weller J.(1998)An Introduction to PCR Primer Design and Optimization of AmplificationReactions(PCR引物设计和扩增反应优化的介绍)。在：Lincoln PJ,Thomson J.(eds)Forensic DNA Profiling Protocols.Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法)，第98卷.Humana出版社，上述各者中的每一者通过参引并入本文)。
在某些实施方式中，致动器包括：第一线圈，该第一线圈靠近壳体的第一端部；第二线圈，该第二线圈靠近壳体的第二端部；以及设置在壳体内的第一磁性元件；以及设置在壳体内的第二磁性元件，其中：第一线圈配置成当向第一线圈施加电流时对第一磁性元件施加第一力；并且第二线圈配置成当向第二线圈施加电流时对第二磁性元件施加第二力。在一些实施方式中，不存在第二磁性元件，并且第一线圈和第二线圈可以配置成对设置于活塞内或联接至活塞的第一磁性元件施加第一力和第二力。在其他实施方式中，不存在第二磁性线圈，并且第一磁性线圈可以对可以设置于活塞内或联接至活塞的第一磁性元件施加第一力，或者替代性地，例如通过反转H桥或类似电磁元件的极性而对第一磁性元件和第二磁性元件施加第一力。在其他实施方式中，从线圈或多个线圈施加的力可以作用在壳体内的下述元件上，这些元件由多于两个的部分形成，例如在活塞包括多个部段或颗粒的情况下。在特定实施方式中，第一线圈配置成当向第一线圈施加电流时使壳体的第一端部的温度增加；并且第二线圈配置成当向第二线圈施加电流时使壳体的第二端部的温度增加。在某些实施方式中，温度可以通过减少或中断电流来修改(例如，降低)。一些实施方式还包括与壳体流体连通的输入端口。在特定实施方式中，输入端口包括配置成推进样本的收集活塞、杆组件或柱塞。在某些实施方式中，壳体包含冻干微丸。在其他实施方式中，有时与柱塞相配合地采用压力差比如部分真空或完全真空来推进样本。在其他实施方式中，设备包含允许残留空气逸出腔室的阀或特征。在一些方面，杆组件或柱塞旋转、跟随螺杆路径、或者由机械联动装置的凸轮轴或其他部件致动以将旋转运动转换为滑动路径或线性路径。在一些实施方式中，致动器包括一个或更多个元件，例如压电发动机、斯特林发动机(Stirling engine)、由镍钛诺、镍钛合金(例如肌肉线)制成的记忆线、致动器线或细线，并且致动器配置成在向元件施加电流时或对元件施加温度梯度时对元件施加第一力。
在特定实施方式中，活塞具有外径；壳体或腔室具有内径；并且活塞的外径与壳体的内径的比率在0.90与0.999之间。在一些实施方式中，活塞的外径与壳体的内径的比率在0.90与0.91之间、0.91与0.92之间、0.93与0.94之间、0.94与0.95之间、0.95与0.96之间、0.96与0.97之间，在0.97与0.98之间、或0.98与0.999之间。在一些实施方式中，活塞包括可以允许流体通过的通道。在特定实施方式中，通道是中央毛细通道，通道的直径可以为0.3mm至2mm。在一些实施方式中，通道的直径小于约0.2mm，或为约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm或更大。在某些实施方式中，通道是中央毛细通道，通道具有1mm的直径，但可选地为在下端部上通过经由大容量注射模制能够实现的最小实际而界定的直径，例如0.2mm。在一些实施方式中，活塞的直径容许低精度，使得可以使用批量生产的注射模制技术。具体地，在一些实施方式中，壳体内径的公差是正负1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20密耳或更多。在一些实施方式中，活塞外径的公差是正负1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20密耳或更多。
具体实施方式包括一种使流体热循环以复制(即扩增)核酸序列或多个核酸序列的方法，该方法包括：使设置在壳体内的活塞从壳体的第一端部移动至壳体的的第二端部，其中，壳体内设置有流体，并且其中，流体包括用于复制核酸的组分；使壳体内的流体的至少一部分从壳体的第二端部移位至壳体的第一端部；将流体的温度控制在第一平均温度范围处持续第一时间段；使活塞从壳体的第二端部移动至壳体的第一端部；使壳体内的与活塞的位置相反的流体从壳体的第二端部移位至壳体的第一端部；以及将流体的温度控制至第二平均温度范围持续第二时间段。
在该方法的某些实施方式中，活塞包括通道；并且使壳体内的流体从壳体的第二端部移位至壳体的第一端部包括将流体的至少一部分引导通过通道。在特定实施方式中，活塞中的通道是中央通道。在一些实施方式中，使设置在壳体(在本文中有时称为腔室或缸体)内的活塞从壳体的第一端部移动至壳体的第二端部包括向线圈施加电流并对设置于壳体内的磁性元件施加力。在特定实施方式中，线圈是靠近壳体的第一端部的第一线圈；磁性元件是设置在活塞与壳体的第一端部之间的第一磁性元件；并且使设置在壳体内的活塞从壳体的第二端部移动至壳体的第一端包括向位于壳体的第二端部附近的第二线圈施加电流并对设置于活塞与壳体的第二端部之间的第二磁性元件施加力。
在该方法的某些实施方式中，将流体的温度控制在第一温度范围处持续第一时间段包括向靠近壳体的第一端部的第一加热线圈施加电流；并且将流体的温度控制在第二温度范围处持续第二时间段包括向靠近壳体的第二端部的第二加热线圈施加电流。第一温度范围可以在约90摄氏度与100摄氏度之间(例如，约90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃)并且第二温度范围在约50摄氏度与75摄氏度之间(例如，约50℃至55℃、约55℃与60℃之间、约60℃与65℃之间、约65℃与70℃之间、或约70℃与75℃之间)；第一时间段小于2秒、或者在约2秒与10秒之间(例如，2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒或10秒)；并且第二时间段小于5秒、或者在约5秒与15秒之间(例如，5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒或15秒)。第一温度范围在约92摄氏度与98摄氏度之间，并且第二温度范围在约60摄氏度与65摄氏度之间；第一时间段小于2秒、或小于2秒、或小于2秒、或者在约4秒与6秒之间(或者在一些实施方式中为6秒至10秒、10秒至15秒、15秒至20秒、20秒至25秒、25秒至30秒或更长)；并且第二时间段在约8秒与12秒之间(或者在一些实施方式中为4秒至8秒、12秒至15秒、15秒至20秒、20秒至25秒、25秒至30秒或更长)。在一些实施方式中，活塞从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环约2个循环至15个循环、20个循环至60个循环(例如，约20个循环至25个循环、约25个循环至30个循环、约30个循环至35个循环、约35个循环至40个循环、约40个循环至45个循环、约45个循环至50个循环、约50个循环至55个循环及约55个循环至60个循环)。在该方法的特定实施方式中，活塞从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环约30个循环至50个循环。
具体实施方式包括分析生物样本的方法，该方法包括：将生物样本放置于上述(或本文中以其他方式描述的)诊断设备内；使生物样本裂解；将试剂引至生物样本；操作诊断设备以使经裂解的生物样本热循环，其中，诊断设备包括：壳体，该壳体包括第一端部和第二端部；设置在壳体内的活塞；靠近壳体第一端部的第一热源；靠近壳体第二端部的第二热源；以及致动器，该致动器配置成使活塞在靠近壳体的第一端部的第一位置移动至靠近壳体的第二端部的第二位置并且返回至靠近壳体的第一端部的第一位置。在某些实施方式中，试剂包括用于使生物样本中的核酸复制的试剂。
在该方法的具体实施方式中，操作诊断设备以使生物样本热循环包括：使设置在壳体内的活塞从壳体的第一端部朝向壳体的第二端部移动；使与活塞位置的相反的生物样本和试剂的至少一部分从壳体的第二端部朝向壳体的第一端部移位；使设置在壳体内的活塞从壳体的第二端部朝向壳体的第一端部移动；以及使生物样本和试剂的至少一部分从壳体的第一端部朝向壳体的第二端部移位；使设置在壳体内的活塞从壳体的第一端部朝向壳体的第二端部移动；以及使生物样本和试剂的至少一部分从壳体的第二端部朝向壳体的第一端部移位，其中：壳体的第一端部被控制至在第一平均温度范围内的温度；并且壳体的第二端部被控制至在第二平均温度范围内的温度。
在该方法的某些实施方式中，活塞包括通道；使壳体内的流体从壳体的第二端部移位至壳体的第一端部包括引导流体的至少一部分沿第一方向通过通道；并且使壳体内的流体的至少一部分从壳体的第一端部移位至壳体的第二端部包括引导流体的至少一部分沿与第一方向不同的第二方向通过通道。在特定实施方式中，活塞中的通道是中央通道。在一些实施方式中，使设置在壳体内的活塞从壳体的第一端部朝向壳体的第二端部移动包括向线圈施加电流并对设置于壳体内的磁性元件施加力。
在该方法的具体实施方式中，线圈是靠近壳体的第一端部的第一线圈；磁性元件为第一磁性元件，该第一磁性元件设置在活塞和壳体的第一端部内或活塞与壳体的第一端部之间；并且使设置在壳体内的活塞从壳体的第二端部朝向壳体的第一端部移动包括向靠近壳体的第二端部的第二线圈施加电流并对设置于活塞和壳体的第二端部内或活塞与壳体的第二端部之间的第二磁性元件施加力。在某些实施方式中，控制壳体的第一端部的温度包括向靠近壳体的第一端部的第一加热线圈施加电流；控制壳体第二端部的温度包括向靠近壳体的第二端部的第二加热线圈施加电流。
在该方法的特定实施方式中，第一温度范围足以将生物样本和试剂加热至约90摄氏度与100摄氏度之间(例如，约90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃)的第一样本平均温度；第二平均温度范围足以将生物样本和试剂加热至约34摄氏度与75摄氏度之间(例如，约34℃至40℃、约40℃至45℃、约50℃至55℃、约55℃与60℃之间、约60℃与65℃之间、约65℃与70℃之间、或约70℃与75℃之间)的第二样本平均温度；生物样本和试剂的至少一部分在第一样本温度附近保持约2至10秒(例如，3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒或10秒)的时间；并且生物样本和试剂在第二样本平均温度处保持约5至15秒(例如，5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒或15秒)的时间。在一些实施方式中，生物样本和试剂从第一样本平均温度至第二样本平均温度并返回至第一样本平均温度循环约20个循环至60个循环(例如，约20个循环至25个循环、25个循环至30个循环、约30个至35个循环、约35个循环至40个循环、约40个循环至45个循环、约个45循环至50个循环、约50个循环至55个循环以及约55个循环至60个循环)。
在该方法的特定实施方式中，第一温度范围足以将生物样本和试剂加热至约92摄氏度与98摄氏度之间的第一样本平均温度；第二平均温度范围足以将生物样本和试剂加热至约60摄氏度与65摄氏度之间的第二样本平均温度；生物样本和试剂的至少一部分在第一样本温度处保持约4秒至6秒的时间(或在一些实施方式中，6秒至10秒、10秒至15秒、15秒至20秒、20秒至25秒，25秒至30秒或更长时间)；并且生物样本和试剂在第二样本平均温度处保持约8秒至12秒的时间(或在一些实施方式中，4秒至8秒、12秒至15秒、15秒至20秒、20秒至25秒、25秒至30秒或更长时间)。在一些实施方式中，生物样本和试剂从第一样本平均温度至第二样本平均温度并返回至第一样本平均温度循环约30个循环至50个循环。
特定实施方式包括分析生物样本的方法，其中，该方法包括：将生物样本放置在诊断设备内；将限定体积的生物样本与限定体积的流体组合以产生限定体积的生物样本流体混合物；以及操作诊断设备以使生物样本流体混合物热循环，其中，诊断设备包括：壳体，该壳体包括活塞腔室；设置在活塞腔室内的活塞；靠近活塞腔室的第一热源；以及致动器，该致动器配置成使活塞在靠近第一热源的第一位置与远离第一热源的第二位置之间移动。
在一些实施方式中，壳体包括第一端部和第二端部；活塞的第一位置靠近壳体的第一端部；并且活塞的第二位置靠近壳体的第二端部。在特定实施方式中，在将生物样本放置在诊断设备内之前不对放置在诊断设备内的生物样本的体积进行测量。在某些实施方式中，流体包含聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。在特定实施方式中，流体包含裂解剂和/或稀释剂。在一些实施方式中，通过压差将限定体积的生物样本引入限定体积的流体。在特定实施方式中，限定体积的流体处于比限定体积的生物样本高的压力。
在某些实施方式中，限定体积的流体处于比限定体积的生物样本低的压力。在特定实施方式中，限定体积的流体经由用户提供的手动动力被引入限定体积的生物样本。在一些实施方式中，限定体积的流体在没有电力的情况下被引入限定体积的流体。在特定实施方式中，限定体积的生物样本在没有电力的情况下被引入限定体积的流体。在某些情况下，限定体积的生物样本通过带螺纹部件的旋转被引入限定体积的流体。在特定实施方式中，诊断设备包括收集腔室；并且将生物样本放置在诊断设备内包括在收集腔室中咳出。在一些实施方式中，诊断设备包括收集腔室；并且将生物样本放置在诊断设备中包括将拭子放置在收集腔室中。在特定实施方式中，拭子包含稀释液。
某些实施方式包括一种设备，该设备包括：壳体，该壳体包括活塞腔室；位于活塞腔室中的活塞；靠近活塞腔室的第一热源；致动器，该致动器配置成使活塞在靠近第一热源的第一位置与远离第一热源的第二位置之间移动；以及联接至壳体的杆组件，其中：杆组件包括样本腔室和流体腔室；样本腔室在杆组件处于第一位置时与活塞腔室流体连通；流体腔室在杆组件处于第二位置时与活塞腔室流体连通；并且样本腔室和流体腔室在杆组件处于第三位置时不与活塞腔室流体连通。
在特定实施方式中，壳体包括第一端部和第二端部；活塞的第一位置靠近壳体的第一端部；并且活塞的第二位置靠近壳体的第二端部。在一些实施方式中，活塞腔室处于真空。具体实施方式还包括配置为收集生物样本的收集腔室。某些实施方式还包括配置成对收集腔室中的生物样本进行检测的传感器。在特定实施方式中，传感器是光学传感器。在一些实施方式中，传感器检测电导率的变化。在特定实施方式中，设备在传感器检测到收集腔室中的生物样本时使杆组件自动地移动。在某些实施方式中，杆组件以螺纹的方式联接至壳体。在特定实施方式中，通过使杆组件的至少一部分旋转，杆组件可以从第一位置移动至第二位置和第三位置。
具体实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室包含配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米。在一些实施方式中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于1.0厘米，或更具体地小于或等于0.5厘米。在特定实施方式中，分析物结合至腔室的表面。在一些实施方式中，设备包括从光源至腔室的光路径，并且光路径小于或等于2.0厘米。在特定实施方式中，光路径小于或等于1.0厘米，或更具体地小于或等于0.5厘米。
在某些实施方式中，光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间，或更具体地在0.005％与0.0125％之间。在一些实施方式中，光源配置成在没有准直透镜的情况下照射流体。在特定实施方式中，光检测器配置成在没有准直透镜的情况下检测光。在特定实施方式中，该设备不包括准直透镜。在特定实施方式中，光源配置成在没有二向色镜的情况下照射流体。在某些实施方式中，光源配置成在没有镜子的情况下照射流体。在一些实施方式中，光检测器配置成对来自包含在流体中的分析物的信号光进行检测；光检测器配置成在不存在信号光时检测背景光；并且信号光与背景光的比率为至少1.5:1。在特定实施方式中，信号光与背景光的比率为至少2:1、或至少5:1、或至少100:1或至少1000:1。在某些实施方式中，光检测器配置成响应于由光检测器检测到的光而产生电流。
在特定实施方式中，由光检测器产生的电流包括响应于信号光的信号电流；由光检测器产生的电流包括响应于背景光的暗电流；并且信号电流与背景电流的比率为至少1.5:1。在一些实施方式中，信号电流与背景电流的比率为至少2:1、或至少5:1、或至少100:1。在具体实施方式中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)，并且在具体实施方式中，DNA是细菌DNA和/或病原性DNA。在某些实施方式中，核酸是核糖核酸(RNA)。在特定实施方式中，流体包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。一些实施方式还包括设置在腔室内的活塞。在特定实施方式中：腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环的方式从靠近腔室的第一端部的第一位置移动至靠近腔室的第二端部的第二位置并返回至靠近腔室的第一端部的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
在某些实施方式中，活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
特定实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该流体配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间。在一些实施方式中，检测器的光学效率在0.005％与0.0125％之间。在具体实施方式中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米；并且光源配置成在没有准直透镜的情况下照射流体。在某些实施方式中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于1.0厘米，或更具体地小于或等于0.5厘米。在特定实施方式中，光源配置成在没有准直透镜和二向色镜的情况下照射流体。
在一些实施方式中：光检测器配置成对来自包含在流体中的分析物的信号光进行检测；光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1，或至少2:1，或至少5:1，或至少100:1，或至少1000:1。在特定实施方式中，光检测器配置成响应于由光检测器检测到的光而产生电流。在某些实施方式中，由光检测器产生的电流包括响应于信号光的信号电流；由光检测器产生的电流包括响应背景光的暗电流；并且信号电流与背景电流的比率为至少1.5:1，或至少2:1，或至少5:1，或至少100:1。在具体实施方式中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)，并且在具体实施方式中，DNA是细菌DNA和/或病原性DNA。在一些实施方式中，核酸是核糖核酸(RNA)。
在具体实施方式中，流体包含聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。某些实施方式还包括设置在腔室内的活塞。在特定实施方式中，腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环方式从位于腔室第一端部附近的第一位置移动至位于腔室的第二端部附近的第二位置并返回至位于腔室的第一端部附近的第一位置；活塞配置成在活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端；并且活塞配置成在活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
具体实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：光检测器配置成对来自流体中所含分析物的信号光进行检测；光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1；光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射流体；腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环方式从位于腔室的第一端部附近的第一位置移动至位于腔室的第二端部附近的第二位置并返回至位于腔室的第一端部附近的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
某些实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中：光检测器配置成对来自包含在流体中的分析物的信号光进行检测；光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1；光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射流体；腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环的方式从位于腔室的第一端部附近的第一位置移动至位于腔室的第二端部附近的第二位置并返回至位于腔室的第一端部附近的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
特定实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：光检测器配置成对来自包含在流体中的分析物的信号光进行检测；光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1；光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射流体；腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环的方式从靠近腔室第一端部的第一位置移动至靠近腔室的第二端部的第二位置并返回至靠近腔室的第一端部的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
具体实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：光检测器配置成对来自流体中包含的分析物的信号光进行检测；光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1；光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环方式从位于腔室的第一端部附近的第一位置移动至位于腔室的第二端部附近的第二位置并返回至位于腔室的第一端部附近的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
特定实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室容纳配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；并且光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射流体。腔室包括第一端部和第二端部；该设备包括致动器，该致动器配置成使活塞以循环的方式从位于腔室的第一端部附近的第一位置移动至位于腔室的第二端部附近的第二位置并返回至位于腔室的第一端部附近的第一位置；活塞配置成当活塞处于第一位置时将流体引导至腔室的第二端部；并且活塞配置成当活塞处于第二位置时将流体引导至腔室的第一端部。
具体实施方式包括一种设备，该设备包括：腔室，该腔室包含配置成使核酸经由热循环而扩增的流体；光源，该光源配置成对包含在流体中的分析物进行照射；以及光检测器，其中，光源与腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：光检测器配置成对来自包含在流体中的分析物的信号光进行检测。光检测器配置成当不存在信号光时检测背景光；信号光与背景光的比率为至少1.5:1；光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；并且光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射流体。
某些实施方式包括样本收集装置，其中，样本收集装置配置成：接纳可变体积的生物样本，并且在单个用户激活步骤中将可变体积的生物样本以固定比例稀释成固定体积的经稀释的生物样本；以及将经稀释的生物样本转移至配置成用于聚合酶链式反应(PCR)的压力容器中。
特定实施方式包括配置成执行聚合酶链式反应(PCR)的设备，其中，该设备包括活塞。某些实施方式包括配置成执行聚合酶链式反应(PCR)的设备，其中，该设备包括置换器活塞。一些实施方式包括其中活塞与至少一种聚合酶链式反应(PCR)试剂物理接触的设备。特定实施方式包括这样的设备，该设备包括与至少一种聚合酶链式反应(PCR)试剂物理接触的置换器活塞。在具体实施方式中，该设备配置成接纳生物样本，并且在单个用户激活步骤中，在不需要机械泵或螺线管的情况下执行样本准备、热循环聚合酶链式反应(PCR)扩增以及检测。
某些实施方式包括配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测的光学系统，其中，光学系统在检测荧光信号之前没有经过辐射测量校准。具体实施方式包括一种光学系统，该光学系统配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中，该光学系统不包括二向色镜。一些实施方式包括配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测的光学系统，其中，该光学系统不包括准直透镜。具体实施方式包括配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测的光学系统，其中，该光学系统的光学效率小于0.3％。
某些实施方式包括配置成在不使用浮点数学函数的情况下对聚合酶链式反应(PCR)产物执行半定量检测的设备。特定实施方式包括配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号执行检测的设备，其中：该设备执行与相对荧光基线的比较；并且该设备在检测荧光信号之前没有经过辐射测量校准。一些实施方式包括配置成在少于5分钟内检测核酸的设备。具体实施方式包括配置成在少于10分钟内检测核酸的设备。某些实施方式包括配置成在少于15分钟内检测核酸的设备。
特定实施方式包括检测核酸序列的方法，其中，该方法包括：将样本接纳到PCR装置中，其中，该PCR装置使用未经辐射测量校准的光学器件或活塞；以及使用PCR装置通过以下方式确定样本是否包括核酸序列：用能够用于结合至核酸序列的一种或更多种标记剂来处理样本；用光源照射样本；对标记剂发出的荧光进行测量；以及基于该测量来确定样本是否包括核酸序列。
在一些实施方式中，核酸序列与感染疾病相关联。在具体实施方式中，核酸序列与遗传缺陷相关联。在某些实施方式中，核酸序列与血型相关联。在特定实施方式中，核酸序列与基因疗法治疗的目标相关联。在一些实施方式中，核酸序列与脑震荡相关联。在具体实施方式中，样本收集自生物体，并且核酸序列与生物体的物种的种群相关联，该方法包括：基于确定样本是否包括核酸序列来确定生物体是否在该种群中。
在某些实施方式中，生物体是非人类动物并且种群是非人类动物的特定品种。在特定实施方式中，样本与患者相关联，并且其中，确定样本是否包括核酸序列包括对关于患者所收集的生物统计数据进行分析。在一些实施方式中，样本与刑事调查相关联。在具体实施方式中，核酸序列与刑事调查的嫌疑人相关联。在某些实施方式中，样本与身份不明的人相关联。在特定实施方式中，样本与特定环境相关联，并且其中，核酸序列与特定环境的入侵物种相关联。在一些实施方式中，确定样本是否包括核酸序列由PCR装置在不与远程装置通信的情况系下执行。具体实施方式还包括将确定的结果传递至远程装置。在某些实施方式中，PCR装置包括小于32千字节(kB)的内部存储器。在特定实施方式中，PCR装置包括小于16千字节(kB)的内部存储器，或更具体地小于8千字节(kB)的内部存储器。在一些实施方式中，PCR装置在确定样本是否包括核酸序列时不接收来自外部源的电力。在特定实施方式中，样本和试剂容纳在一次性筒内。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应该理解的是，尽管指示了本发明构思的优选变型，但是详细说明和具体示例仅通过说明的方式给出，因为通过该详细描述，本发明的范围内的各种变型和改型对于本领域技术人员将变得明显。
除非本文中以其他方式限定，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或试验中可以使用与本文所述的方法、装置或材料类似或等同的任何方法、装置或材料，但现在将对示例性方法、装置和材料进行描述。
尽管已经参考本发明的具体实施方式对本发明进行了详细描述，但是这些实施方式仅是说明性的，并且并不限制本发明。文中中对本发明的说明性实施方式的描述、包括摘要和发明内容中的描述并不意在是穷举的或将本发明限制于文中所公开的精确形式(并且特别地，在摘要或发明内容中包含的任何特定实施方式、特征或功能并非意在将本发明的范围限制于这些实施方式、特征或功能)。准确地说，该描述旨在描述说明性实施方式、特征和功能，以便为本领域普通技术人员提供上下文以理解本发明，而不将本发明限制为任何具体描述的实施方式、特征或功能，包括在摘要或发明内容中描述的任何这种实施方式特征或功能。尽管出于说明性的目的在本文中描述了本发明的具体实施方式和用于本发明的示例，但如本领域技术人员将认识和理解到的，在本发明的范围内的各种改型是可能的。如所指出的，可以根据本发明的说明性实施方式的前述描述对本发明进行这些改型，并且这些改型将被包括在本发明的精神和范围内。因此，尽管已经参考本发明的具体实施方式对本发明进行了详细描述，但需多改型、各种改变和替换的范围意在落入前述公开内容中，并且应当理解的是，在某些情况下，在不脱离如阐述的本发明的范围和精神的情况下，本发明的实施方式的一些特征将在不相应使用其他特征的情况下使用。此外，本发明的各种特征和实施方式包含可以在本文所述的特定实施方式中未描述的组合和排列中使用的方面，但是相关领域的技术人员将认识并且理解到这样的组合或排列在本发明的精神和范围内。因此，可以做出许多改型以将特定的情况或材料适配于本发明的教示。本文引用的所有专利、专利申请和出版物的全部公开内容在此通过参引并入本文，某种程度上述全部公开内容与本文中阐述的本公开内容一致。
在整个本说明书中对“一个实施方式”、“实施方式”、“一些实施方式”、“特定实施方式”、“具体实施方式”或类似术语的引用意味着结合实施方式所描述的特定特征、结构、或特性被包括在至少一个实施方式中，并且不一定存在于所有实施方式中。因此，贯穿本说明书在各个地方相应出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”或类似术语不一定指代相同的实施方式。此外，任何特定实施方式的特定特征、结构或特性可以在一个或更多个其他实施方式中以任何合适的方式组合。应当理解的是，鉴于本文中的教示，本文中所描述和说明的实施方式的其他变化和改型是可能的，并且被认为是本发明的精神和范围的一部分。无论是否特别注明为非限制性示例，描述示例的语言、包括“比如”、“包括”、“其他实例”、“仅是示例性的”、“诸如”、“例如”、“等”，“举例”、“和”、“类似物”以及类似的术语被理解为非限制性的。
本公开的各部分的名称和标题仅为方便起见并且不应影响本公开的任何方面的范围或解释。
应当理解的是，关于本文中所描述的一个实施方式所讨论的部件和/或参数的变化可以结合到本文中所描述的其他实施方式中。在非限制性示例中，关于一个实施方式所讨论的不同温度、压力、时间、循环数目、比率、体积、尺寸、电流、电压、荧光、亮度和/或距离等的范围和相关等级也可以结合到本文中公开的其他实施方式中。此外，关于一个实施方式所讨论的部件的不同构型，包括非限制性示例比如活塞、腔室、缸体、探针、传感器、电源、检测器、裂解和/或试剂等的不同构型也可以结合到本文中公开的其他实施方式中。
在本文中的描述中，提供了许多具体细节、例如部件和/或方法的示例，以提供对本发明实施方式的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，可以在没有具体细节中的一个或更多个具体细节的情况下，或者利用其他设备、系统、组件、方法、部件、材料、部分和/或类似物来实践实施方式。在其他情况下，公知的结构、部件、系统、材料或操作没有被具体示出或详细描述以避免混淆本发明的实施方式的各方面。尽管可以通过使用特定实施方式来说明本发明，但这不是并且也不将本发明限制为任何特定实施方式，并且本领域普通技术人员将认识到附加实施方式是容易理解的并且是本发明的一部分。
本文中讨论的实施方式的至少一部分可以使用通信地联接至网络(例如，因特网)、另一计算机的计算机来实施，或在独立计算机中的计算机来实施，或作为物联网(IoT)装置(即，可以在物联网的[即，作为物联网的一部分]上运行的智能装置)的计算机来实施。如本领域技术人员所知，适合的计算机可以可选地包括处理器或中央处理单元(“CPU”)、至少一个只读存储器(“ROM”)、至少一个随机存取存储器或易失性存储器(“RAM”)、至少一个非易失性存储器例如闪存或硬盘驱动器(“HD”)、以及一个或更多个输入/输出(“I/O”)装置。I/O装置可以包括键盘、监控器、LCD屏幕、输入按钮或其他执行器、打印机、内部传感器、电子指针装置(例如，鼠标、轨迹球、样式件、触摸板等)等，其中，内部传感器与装置的物理状态、位置、活动、历史、磁场或其他方面相关。
ROM、RAM和HD是用于存储计算机可执行指令的存储器，这些计算机可执行指令能够由CPU执行或能够编译或解释为能够由CPU执行。适合的计算机可执行指令可以驻留在计算机可读介质(例如，ROM、RAM和/或HD)、硬件电路或类似物或其任何组合上。在本公开中，术语“计算机可读介质”不限于ROM、RAM和HD并且可以包括可由处理器读取的任何类型的数据存储介质。例如，计算机可读介质可以指数据筒、数据备份磁带、软盘、闪存模块或驱动器、光学数据存储驱动器、CD-ROM、ROM、RAM、HD或类似物。实现本文中公开的一些实施方式的软件可以包括可以驻留在非暂态性计算机可读介质(例如，磁盘、CD-ROM、存储器等)上的计算机可执行指令。替代性地，计算机可执行指令可以作为软件代码部件存储在直接存取存储装置阵列、磁带、软盘、光存储装置或其他适当的计算机可读介质或存储设备上。
任何适合的编程语言(例如C、Assembler、Perl、Python、Java、PHP、Ruby、Swift、Cobol)可以用于实现本文描述的本发明实施方式的例程、方法或程序，包括定制脚本。可以使用其他软件/硬件/网络架构。例如，软件工具和定制脚本可以在一个计算机上实现或在网络中或跨网络的两个或更多个计算机之间共享/分布。实现实施方式的计算机之间的通信可以使用符合已知的网络协议的任何电子、光学、射频信号或其他合适的通信方法和工具来实现。此外，除非另有特别说明，否则附图/图中的任何信号箭头应仅被视为示例性而非限制性的。基于本文提供的公开和教示，本领域普通技术人员将理解实施本发明的其他方式和/或方法。
本发明的方法、组合物、套件和系统中的任一者的任何实施方式可以由所描述的步骤和/或特征组成或者基本上由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包括/包含/含有/具有所描述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由......组成”和“基本上由......组成”可以替代上面列举的任何开放式连接动词，以改变原本将使用开放式连接动词的给定权利要求的范围。
在权利要求中术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代性方案是相互排斥的，但是本公开内容支持指代仅替代性方案和“和/或”的限定。
贯穿本申请，术语“约”、“大致上”或“大约”用于指示：数值包括用来确定该数值的装置、方法的误差标准偏差以及正负偏差百分之十(10％)的公差。
如本文中所使用的，术语“靠近”、“附近”、“靠近”、“设置在......附近”用于指示两个实体在空间上和邻近度方面是相关的。
如本文中所使用的，术语“使扩增”、“扩增”、“使复制”、“复制”和相关术语在核酸的背景下使用时，是指增加相同或相似核酸或核酸序列或相关化合物的量或浓度。
如本文中所使用的，“控制”温度用于指示对元件或多个元件进行主动调节以试图维持装置的一些部分的近似温度范围，或允许通过被动或调节热损失的设计元件至环境或其他元件的热损失，使得达到或试图达到近似的温度范围。
如本文中所使用的，“相反”用于指示在与第一方向的一般净向量不同、正交或相反的平均方向上。
如本文中所使用的，当提及流体的运动或作用在流体上时，应理解这包括流体的一部分的运动或作用在流体的一部分上，或流体的子集的运动或作用在流体的子集上。
遵循存在已久的专利法，除非特别说明，否则当权利要求或说明书中与词语“包括”结合使用时，词语“一”和“一种”表示一个或更多个。
如本文中中所使用的，术语“包括”、“包括有”、“包含”、“包含有”、“具有”、“含有”或其任何其他变型旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括元件列表的过程、产品、物品或设备不一定仅限于那些元件，而是可以包括未明确列出的或该过程、方法、物件或设备固有的其他元件。
此外，除非另有说明，否则本文中所使用的术语“或”通常意指“和/或”。例如，满足条件A或B是指下述各者中的任一者：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且A和B都为真(或存在)。如本文中所使用的，包括随后的权利要求，除非在其他权利要求中明确指出(即，引用“一”或“一种”清楚地表示仅单数或仅复数)，否则前面带有“一”或“一种”(以及当先行基础为“一”或“一种”时的“所述”)的术语包括此类术语的单数和复数两者。此外，如在本文中的描述中使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在......中”的含义包括“在......中”和“在......上”。
如本文中所使用的，“患者”或“受试者”包括(无论是否存活)哺乳动物生物体，比如人类和非人类哺乳动物，例如但不限于啮齿动物、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物、伴侣动物比如狗和猫以及牲畜例如羊、牛、马等、以及非哺乳动物比如鸟类、爬行动物、鱼类、昆虫、甲壳类动物、蜘蛛、棘皮动物、蠕虫、软体动物、海绵类动物，以及其他带有核酸的生命比如细菌、病毒、真菌、原生动物、古细菌、染色体等植物生命。因此，例如，尽管所描述的实施方式说明了本方法在人类中的使用，但本领域技术人员将容易地认识到这些方法和组合物也可应用于兽医学以及在本文中描述的其他动物和其他类型的生物体。
如本文中所使用的，术语“活塞”、“多个活塞”和相关术语包括以大致线性的方式或借助于机械联动效应运动沿着这种路径从第一位置移动至第二位置(并且可能返回至第一位置)的块体。该块体可以是置换器活塞，该置换器活塞是用于使流体从一个位置移动至另一个位置的活塞。在某些实施方式中，该块体可以是固体、一体式部件，或者可以包括多个部件，包括例如具有相似或不同形状的多个盘状件、多面体件或涂覆颗粒。
如本文中所使用的，术语“稀释流体”和相关术语包括与另一种物质(例如流体或固体)混合以稀释物质浓度的任何流体。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中呈现的具体实施方式的详细描述参照这些附图中的一者或更多者，可以更好地理解本发明。本专利或申请文件可能包含至少一张着色附图。带有着色附图的本专利或专利申请出版物的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1是根据本公开的第一示例性实施方式的设备的部分分解立体图。
图2是图1的实施方式的部分分解前视图。
图3是图1的实施方式的部分分解俯视图。
图4是示出了图1的实施方式的活塞处于第一位置的示意图。
图5是示出了图1的实施方式的活塞处于第二位置的示意图。
图6是根据本公开的示例性实施方式的具有反应腔室插入件的设备的示意性俯视图。
图7是配置成用于与图6的实施方式一起使用的样本加载装置的示意性侧视图。
图8是图6的实施方式在使用期间的示意性侧视图。
图9是图6的实施方式在使用期间的示意性仰视图。
图10是根据本公开的示例性实施方式在不需要活塞的情况下的设备的示意性侧视图。
图11是图10的实施方式的示意性仰视图。
图12是根据本公开的第二示例性实施方式的设备的侧视图。
图13是图12的实施方式的俯视图。
图14是图12的实施方式的部分分解立体图。
图15是图12的实施方式中的用于样本装载和进入的部件的分解立体图。
图16至图26示出了图12的实施方式中的用于样本装载和进入的部件处于不同位置的截面图。
图27是图12的实施方式中的用在样本检测中的部件的分解图。
图28是处于基部-筒构型的图12的实施方式的分解图。
图29是图29的实施方式的组装图。
图30是描绘了检测腔室内的任意两个表面之间的光交换的示意图。
图31是根据本公开的示例性实施方式的检测腔室的非连续光线轨迹建模的示意图。
图32示出了根据本公开的示例性实施方式的各种腔室填装构型的示意性端视图。
图33示出了在每个腔室中设置有活塞的根据图32的腔室填装构型的示意性立体图。
图34示出了位于本公开的示例性实施方式与替代装置之间的化脓性链球菌DNA区段的比较扩增。
图35是示出了使用TaqMan探针和本公开的示例性实施方式的化脓性链球菌DNA区段的装置上检测的图表。
图36是联接至智能电话或平板电脑的实施方式的分解立体图。
具体实施方式
本公开的示例性实施方式包括用于检测核酸和执行分子诊断的设备和方法。下面参照附图中包括的附图讨论特定实施方式。为了清楚起见，在附图的以下讨论中提及的每个元件可能没有在每个附图中用附图标记进行标记。
首先参照图1至图3，分别以部分分解立体图、前视图和俯视图示出了用于进行分子诊断的设备100。在该实施方式中，设备100包括具有中央通道145的活塞140，活塞140设置在具有第一端部151和第二端部152的壳体150内。在所示实施方式(以及本文中描述和/或示出的其他类似实施方式)中，活塞140是置换器活塞的示例。此外，设备100包括位于第一端部151附近的第一热源110和位于第二端部152附近的可选的第二热源120。
在所示的实施方式中，设备100还包括致动器160，致动器160构造成使活塞140在靠近壳体150的第一端部151的第一位置与靠近壳体150的第二端部152的第二位置之间循环。在图1至图3中示出的视图中，以分解图示出了第一热源110和致动器160的第一部分，同时以组装图示出了热源120和致动器160的第二部分。应当理解的是，图中所示的部件仅仅是一个实施方式的示例，并且其他实施方式可以包括部件的不同组合。
在图示的实施方式中，设备100包括支承控制器195的基部190、第一支承构件191、第二支承构件192以及位于支承构件之间的间隔构件193和194。端盖117和127分别经由联接构件198和199联接至支承构件191和192。如附图的分解部分中所示的，设备100包括具有致动线圈165和加热线圈115的缸体113。如下文进一步详细解释的，致动线圈165可以用于提供电磁脉冲以将活塞140定位在壳体150内，同时加热线圈115可以用于将壳体150内的流体加热至期望温度。尽管致动线圈165和加热线圈115在所示实施方式中被示出且描述为单独的线圈，但其他实施方式可以包括执行致动功能和加热功能的单个线圈。设备100还包括照射模块133和检测模块135。尽管对附图的讨论将主要涉及在第一端部151附近的分解部分中所示的部件，但应当理解的是，设备100包括在端部152附近的大体等同部件，除非另有说明。
设备100可以通过将活塞140插入壳体150来组装，壳体150然后可以经由端部152插入到端盖127中。磁性元件163然后可以插入到壳体150中，并且端盖117通过在部件之间提供密封的密封构件119而联接至壳体150的第一端部151。磁性元件的形状可以变化，如环、盘或作为粉末在制造期间混合到活塞的聚合物中、以及复合物，其中，稀土磁体由于稀土磁体具有优选的化学性质和每单位质量的场强度而优于铁磁体，磁性元件优选地为镀铬或以其他方式涂覆的磁体，并且更优选地为嵌置在聚合物中的磁体以防止试剂的化学抑制，比如涉及裂解、提取、检测、并且特别是扩增的那些化学抑制，并且降低操作期间机械转移的风险。可选的实施方式是使用maxels(或通过3D打印或赋予可设计磁场的其他模式并入的磁性单元，例如参见通过参引并入本文的美国专利9105384)。磁铁也可以是固定的或感应的(例如在使用涂覆颗粒的活塞的实施方式中)，并且磁体也可以通过在各位置处包括固定磁铁使得在活塞的全行程时它们施加闩锁力以在适用的加热循环步骤期间将活塞被动地保持就位而作为节能特征被结合。该实施方式也在其中设备的取向可以在使用期间改变的情况下是有用的。
缸体113插入端盖117中并且支承构件191联接至基部190以及间隔构件193和194。用于设备100的部件的组装顺序不需要按照上述顺序，并且可以利用其他组装顺序。此外，其他实施方式可以将图1至图3中所示的作为单独部件的某些元件组合成单个部件。
首先将呈现设备100的操作的概述，随后对特定方面进行更详细论述。在设备100的操作期间，生物样本170被引入壳体150的样本端口155中以进行分析。在某些实施方式中，壳体150可以容纳适用于样本170的分子诊断的缓冲液172和试剂173，样本170的分子诊断包括样本准备(例如，样本稀释、裂解、提取、纯化或其他分离技术)和扩增或复制(例如，通过定性PCR、定量PCR或半定量PCR、RT-PCR或其他热循环或等温技术)以及检测(例如，水解探针或分子信标)。在某些实施方式中，试剂173和/或缓冲液172可以是冻干微丸。尽管装置的某些实施方式，比如活塞模型优选地与热循环扩增技术结合地使用，但是该装置也能够以等温方式进行扩增。
另外参照图4和图5，示出了靠近壳体150的第一端部151的第一位置和靠近壳体150的第二端部152的第二位置的活塞140的示意图。在设备100的操作期间，可以使包括准备好的样本170、缓冲液172和/或试剂173的反应流体175热循环以使反应流体的组分(例如核酸)扩增或复制以进行进一步分析。如下文进一步详细解释的，控制器195(图1至图3中所示)可以控制流动通过致动线圈165和第二致动线圈185的电流以使活塞140在靠近第一端部151的第一位置与靠近第二端部152的第二位置之间循环。此外，控制器195可以控制流动通过加热线圈115和第二加热线圈125的电流以控制壳体150的第一端部151和第二端部152的温度。在示例性实施方式中，电力可以经由电池、USB电源或交流电源(例如典型的电插座)供应至设备100，其中，USB电源连接至任何使能设备(enabled device)比如计算机、智能电话、平板电脑、太阳能电池或光伏电池。在其他实施方式中，电力可以经由无线充电机构或交流电源(例如典型的电插座)供应至设备100，其中，无线充电机构连接至任何使能设备比如计算机、智能电话、平板电脑、太阳能电池或光伏电池。
在所示的实施方式中，致动器160可以经由位于壳体150的端部151附近的致动线圈165对磁性元件163施加电磁力。在所图示的实施方式中，致动器160在设备100的靠近壳体150的第二端部152的组装部分中包括第二致动线圈185和磁性元件167(位于活塞140与第二端部152之间并且在图1至图3中不可见)。应当理解的是，其他实施方式可以包括不同数目的致动线圈、加热线圈和磁性元件。此外，线圈的安置可以改变，以根据需要允许线性加速或其他行为，并且加热功能和运动功能可以单独地或串联地执行，其中，可选的极性开关通过H桥来使所包括的部件的数目和复杂性最小化。在一些实施方式中，H桥可以消除对专用磁性线圈以及其他磁性元件的需要，并且取而代之的是向第一端部151和第二端部162提供直流电流，其中，第一加热线圈115和第二加热线圈125用作为第一加热源110和第二加热源120。在一些实施方式中，另一磁性元件的尺寸和间距被调节成使得磁性元件与磁性线圈在径向上的接近度不多于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.75mm、1mm、2mm、3mm或更大。
可以采用额外的运动模式，包括重力、向心、杠杆、凸轮轴或手动运动，但为了部件和动力的精确度和效率，电磁运动在所示的实施方式中是优选的。
第一热源110包括绕缸体113卷绕的加热线圈115。通过加热线圈115的电流使缸体113和包括壳体150的第一端部151在内的附近部件的温度增加。在特定实施方式中，缸体113可以由金属或具有高传热系数的其他适合的材料形成。在特定实施方式中，缸体113可以由铝形成。因此，来自缸体113的热将被有效地传递至壳体150以及壳体150的靠近第一端部151的容纳物(例如反应流体175)。
现在返回参照图1至图5，控制器195还可以通过控制流动通过致动线圈165和第二致动线圈185(也在图4和图5中示出，在图1至图3的端盖127内的组件中不可见)的电流来控制活塞140在壳体150内的位置。活塞140最初被示出为在图4中处于第一端部151附近的第一位置。在该位置中，反应流体175位于壳体150的第二端部152附近。控制器195可以控制流动通过线圈165的电流，从而产生作用在磁性元件163上的电磁力。当电流沿一个方向流动通过线圈165时，将对磁性元件163施加排斥磁性元件163的电磁力。磁性元件163又使活塞140朝向壳体150的第二端部152移动。被示出为处于该位置的活塞140的示意图在图5中示出。如图5中所示，当活塞140朝向第二端部152移动时，壳体150中的反应流体175将移位，使得反应流体175位于壳体150的第一端部151附近。在所示的实施方式中，通道145是中央毛细通道，该中央毛细通道提供用以使反应流体175在活塞140于图4和图5中所示的第一位置与第二位置之间循环时在第一端部151与第二端部152之间流动的路径。在某些实施方式中，活塞140可以包括额外的通道或其他特征以允许反应流体175的移位。例如，在一些实施方式中，活塞140和壳体150的直径可以适当地定尺寸成当活塞从第一端部151附近的第一位置移动至第二端部152附近的第二位置时提供用于反应流体175的围绕活塞140的期望的流动路径。活塞140还可以在外部直径上包括通道以允许反应流体175流动。
控制器195还可以将活塞140朝向第一端部151往回引导至图4中所示的位置，使得壳体150中的反应流体175移位至壳体150的第二端部152附近。为了使活塞140从图5中所示的位置移动至图4中所示的第二位置，控制器195可以停止电流流动通过致动线圈165以停止经由致动线圈165作用在磁性元件163上的磁力。在某些实施方式中，控制器195可以使流动通过致动线圈165的电流反向以经由致动线圈165产生吸引磁性元件163的磁力。此外，控制器195可以向壳体150的第二端部152附近的第二致动线圈185施加电流。这可以产生对位于活塞140与第二端部152之间的第二磁性元件167排斥的电磁力。第二磁性元件167又使活塞140朝向壳体150的第一端部151移动，从而使反应流体175移位至第二端部152附近。
因此，控制器195可以如上所述通过控制电流至加热线圈和致动线圈的流动来控制活塞140的位置以及壳体150的第一端部151和第二端部152处的温度。应当理解的是，附图中所示的热源110和120以及致动器160的构型仅仅是一个实施方式的示例。其他实施方式可以包括不同的构型，包括例如电阻器或聚酰亚胺加热器和/或线性致动器。反应流体175因此可以从第一温度范围(例如第一端部151所保持的温度)循环至第二温度范围(例如第二端部152所保持的温度)以便使反应流体的组分扩增或复制。在一些实施方式中，包括例如某些PCR处理和RT-PCR处理，反应流体175可以在反应流体175位于第一端部151附近时保持在约92℃至98℃的温度处，并且在反应流体175位于第二端部152附近时保持在约60℃至65℃的温度处。
在某些实施方式中，设备100可以使活塞140和反应流体175从第一位置至第二位置并返回至第一位置循环大约15个循环至60个循环、或优选地循环大约30个循环至50个循环。因此，反应流体175可以从约92℃至98℃至约50℃至65℃、特别地约60℃至65℃循环约30次至50次。在使用PCR处理的某些实施方式中，反应流体最初保持在约92℃至98℃处持续约2分钟至5分钟，然后在持续大约3秒至30秒(或更特别地大约3秒至15秒、或甚至更特别地大约5秒)的约92℃至98℃与持续大约5秒至30秒(或更特别地大约5秒至15秒、或甚至更特别地约10秒)的约60℃至75℃之间循环约30个循环至50个循环。在使用RT-PCR处理的某些实施方式中，反应流体最初可以保持在约34℃至60℃(或更特别地约45℃至55℃或甚至更特别地约50℃)，然后保持在约92℃至98℃处(或者可选地，对于不存在基因组DNA的目标而言更低，在这种情况下，优选的温度与引物-目标序列的溶解温度相对应)持续大约2分钟至5分钟。然后反应流体可以在持续大约3秒至30秒(或更特别地约5秒至15秒、或甚至更特别地约5秒)的约92℃至98℃的第一温度范围与持续大约5秒至30秒(或更特别约5秒至15秒、或甚至更特别约10秒)的约50℃至65℃、特别地约60℃至65℃的第二温度范围之间循环约30个循环至50个循环，或者为对从业者来说是明显的其他热循环模式。在某些实施方式中，反应流体在持续特定时间段内的较高温度范围与持续特定时间段的较低温度范围之间循环而不在特定温度范围处持续初始时间段。
在某些实施方式中，控制器195可以包括具有计算机处理器、计算机可读介质和必要硬件(例如电气开关、电压互感器、调节器等)的印刷电路板，该印刷电路板配置成执行用以自动地操作设备100的步骤。例如，控制器195可以包括在用户启动操作时(例如通过按压启动按钮)使活塞140自动定位并且对第一端部151和第二端部152的温度(并且因此为反应流体175在如下所述反应流体175通过活塞140移位时的温度)进行控制所需的部件。
在所示的实施方式中，控制器195可以通过控制流动通过加热线圈115的电流来控制壳体150的容纳物在第一端部151附近的温度。控制器195还可以通过控制流动通过绕第二缸体(在端盖127中的组件内不可见)卷绕的第二加热线圈125(在图4和图5中所示，在图1至图3的端盖127内的组件中不可见)的电流来控制壳体150在第二端部152附近的温度。例如，第一端部151(或壳体150内的流体在第一端部151附近)的温度可以被测量并且作为输入提供给控制器195。如果测量的温度低于目标温度(例如存储在控制器195中的设定点，则控制器195可以增加电流至加热线圈115的流动。如果所测量的温度高于目标温度，则控制器195可以减少电流至加热线圈115的流动。控制器195可以类似地控制温度第二端部152(或壳体150内的流体在第二端部152附近)的温度。
在另一实施方式中，首先参照参照图12至图15，示出了用于进行分子诊断的设备200。该实施方式的若干方面以与先前描述的实施方式大体等同的方式操作。图12至图15中所示的实施方式还包括下述部件：所述部件用以提供样本的进入以及将样本与在分析物的扩增和检测中使用的稀释流体、缓冲液和/或试剂的混合。在该实施方式中，设备200包括具有第一端部151和第二端部152的壳体150、以及可选的壳体热断路器(thermal break)23。经过第一加热线圈(为了清楚起见在图中于热源110内未示出)的电流为第一热源110提供电阻热，并且经过第二加热线圈(为了清楚起见在图中于热源120内未示出)的电流可选地为第二热源120提供电阻热。电力可以由保持在一个或更多个电池保持器297中的一个或更多个电池296提供。
在该实施方式中，活塞140包括活塞热断路器242、磁性元件163和活塞盖241。在所示实施方式中，磁性元件163包括小环形磁铁，不过如别处所述，还有将容易显然在活塞140内包括磁性元件的许多另外的实施方式。在该实施方式中，磁性元件163作为单独的部件位于活塞盖241与活塞热断路器242之间，不过如别处所述，活塞140可以通过使用注射模制、压配合、摩擦焊接或任何其他类似的适合技术形成为单件。也可以使用胶来构造活塞140，不过这些由于某些化学元素、比如环氧树脂会负面地影响化学反应而不是优选的。
活塞140位于壳体150内，其中，壳体的第一端部由进入壳体274定界。进入壳体274可以由各种材料比如聚合物(例如聚甲醛树脂)或金属(例如铝)、或其组合来形成，包括薄涂层、适形涂层、旋转涂层、浸渍涂层、膜涂层、真空沉积涂层、喷溅沉积涂层和其他类型的方法。如图15中所示，进入壳体274可以包含进入柱塞或杆组件275，进入柱塞或杆组件275包括各种腔室和密封构件以允许生物样本170的适当混合或分级。在该特定实施方式中，杆组件275可以包含进入样本腔室279。此外，杆组件275可以包括经由稀释通道281流体连通的上部进入稀释腔室277和下部进入稀释腔室278，但是在其他实施方式中，可以使用单个稀释腔室。在该实施方式中，进入杆组件275还包括密封构件280。在某些实施方式中，密封构件280可以根据需要包括或结合有O形环或其他部件以改善或影响部件腔室、包括对水合作用或化学物质膨胀或反应的那些部件腔室的分离。稀释腔室277和278以及样本腔室279的容积由进入杆组件275和进入壳体274的尺寸决定。例如，密封构件280之间的距离、以及进入杆组件275和进入壳体274的直径可以选择成用以确定每个腔室的所需容积。
进入壳体274还可以包括各种轮廓以辅助生物样本、裂解物或其他反应流体和试剂的混合或分级。在该特定实施方式中，进入壳体274包括上部进入旁路282和下部进入旁路283。如下文更充分地讨论的，上部进入旁路282和下部进入旁路283可以选择性地将进入壳体274内的腔室(例如样本腔室279和稀释腔室277和278)置于与活塞腔室157流体连通。在特定实施方式中，进入杆组件275的位置可以将样本腔室279和/或稀释腔室277和278置于与活塞腔室157流体连通。具体地，密封构件280的位置可以允许或限制活塞腔室157与样本腔室279和稀释腔室277和278或外部大气压之间的流体连通。
稀释腔室278和277可以填充有稀释流体。在一些实施方式中，反应的贮存稳定组分(例如盐)可以存在于稀释流体中，而稳定性较小的组分(例如蛋白质)可以存在于与稀释流体分离的冻干组分、例如冻干微丸527中。这实现了长期储存模式而不需要冷藏和较宽的储存温度范围。在一些实施方式中，设备的非冷藏保质期可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、48个月、60个月或更长时间。在其他实施方式中，上述时间点中的每个时间点处的效力损失(或有效化学作用比率)小于1％、3％、5％、10％、20％、25％、35％、50％或更大。在一些实施方式中，自稳定设备的可接受的储存温度范围可以包括小于10℃、10℃至15℃、15℃至25℃、25℃至35℃、35℃至45℃、45℃至55℃、55℃至65℃或更高。
根据所需的稀释，稀释腔室与进入样本腔室279的相对容积可以调节。在该特定实施方式中，进入样本腔室与稀释腔室中的稀释流体的比率具有1:10的比率。进入样本腔室与稀释腔室中的稀释流体的比率可以具有在约1:1至1:5之间、约1:5至1:10之间、约1:10至1:15之间、约1:15至1:25之间、约1:25至1:50之间或约1:50到1:100之间的比率。使生物样本稀释具有使PCR抑制剂稀释并且使生物样本粘度降低的作用。因此，该比率可以根据特定的组织基质或被分析的生物样本类型来调节。使用包含非层流流动并产生流体湍流的设计影响进入的混合功能。湍流可以借助于通道、微凹体、涡旋脱落、流体速度的变化、文丘里效应和对从业者而言将明显的其他流体机械效应来实现。
样本采集
在特定实施方式中，样本170可以包括生物样本、原始样本或基质，包括例如唾液、粘液、眼泪、头发、指甲、毛囊、痰、粘液质、口腔、鼻或鼻咽拭子、泪液、发炎性分泌物(rheum)、血、全血、血浆、血清、尿液、尿道液、包皮垢、精液、阴道分泌物、母乳、初乳、耳垢、皮脂、伤口样本、脓液、皮肤刮屑、肿瘤、囊肿、粪便、脑脊液、心包液、淋巴液、滑液、胆汁、胃液、食糜、乳糜、羊水、恶露、胎盘、玻璃体、房水、来自植物的材料、动物、细菌、病毒、真菌、古细菌、昆虫、染色体、原生动物和其他带有核酸的生命，以及比如水、空气或土壤的环境源，以及对从业者而言将明显的其他源。
样本可以在从生物源获得时或在预处理以修改样本的特性后直接使用。例如，这种预处理可以包括从血液制备血浆或稀释粘性流体。预处理方法还可以包括但不限于过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、离心、冷冻、冻干、浓缩、扩增、核酸片段化、干扰组分的灭活、试剂的添加或裂解。在一些实施方式中，样本包含全细胞(例如来自受试者的全细胞、来自病原体[例如细菌病原体]的全细胞)。在一些实施方式中，样本可能已经经受或者可能没有经受下述各者中的一者或更多者：声波降解法、超声波降解法、传统裂解试剂、离液剂和/或其他传统裂解试剂。在一些实施方式中，样本可以与去污剂和/或蛋白酶比如蛋白酶K接触以进行裂解。样本可以经受热比如70℃、80℃、90℃或更高温度。
在某些实施方式中，用户可以向样本端口155或与样本端口155联接的收集腔室或痰盂257咳出。在特定实施方式中，用户可以使用下述拭子：该拭子含有使生物样本稀释(例如，以大于2:1、3:1、5:1的比率或更具体地在一些实施方式中以10:1的比率)的液体稀释液或载体流体。在某些实施方式中，拭子是人造丝、聚酯、棉、尼龙或其他天然或合成纤维。在一些实施方式中，拭子可以被絮凝或增强以提高生物标本的吸收或快速洗脱。在某些实施方式中，稀释流体可以存在于拭子中和/或存在于壳体150中。在特定实施方式中，稀释(载体)流体包括：NP-40，0.05％至0.5％；Tween-20，0.05％至0.5％；EDTA，0.5mM至5mM；和Tris-HCl(或替代性地，双-三丙烷、磷酸钠、三醋酸酯、或从业者已知的其他适合的缓冲液组分。例如，参见通过参引并入本文的Mohan，A guide for the prepare and use ofbuffers in biosystems(生物系统中缓冲液的制备和使用指南)，Calbiochem，2003，pH7.5(pH可以被调节以适合测定和组织基质，但通常具有7.0至10.5的优选pH范围)，5mM至50mM。可以使用其他去污剂，例如Sarkosyl、Triton X-100、Triton X-114、Tween 80、Brij-35、Brij-58和十二烷基硫酸钠。在其他实施方式中，代替化学裂解或者附加于化学裂解地可以使用基于热的裂解。在具体实施方式中，生物标本可以与如别处讨论的稀释剂可选地结合或者与如本文中讨论的去污剂可选地结合而被加热(例如，被加热至80℃至95℃范围内的温度)。对于缺乏PCR材料抑制剂的简单细菌样本，单独的热裂解就足以裂解细胞。
在一些实施方式中，全血可以收集在管中，所述管为比如含有抗凝剂(例如，肝素锂)、螯合剂(例如，EDTA)、核酸酶和/或蛋白酶抑制剂的收集管。样本可以通过离心被分离成血浆部分和血清部分，或者可以作为未分级或未分离成其组分部分的全血进行分析。可以使用含有硅凝胶的血清分离管(SST)，当硅凝胶被离心时，硅凝胶在血沉棕黄层的顶部形成一层，从而允许更有效地移除血浆以用于测试和相关目的。样本可以与氯化铵、碳酸氢钠和EDTA一起培育。尿液可以与EDTA一起收集在管中。样本可以与离液剂(例如硫氰酸胍)、EDTA、去污剂(例如Triton X-100或SDS)、蛋白酶和/或缓冲液(例如Tris-HCl)(Zainabadi等人，PLoS One.2019；14(2)：e0210813；Kulinski等人，Biomed Microdevices.2009年6月；11(3)：671-678)接触。可以收集精液样本并且与裂解缓冲液(例如Tris-HCl、氯化钠和氯化镁)一起培育。样本可以进一步与TRIzol和蛋白酶、氯仿和柠檬酸钠接触以进行核酸的提取(Darbandi等人，Middle East Fertitility Society Journal(中东生育学会杂志)，23(3)：216-219，2018年)。在其他实施方式中，精液样本可以与含有三(2-羧乙基)膦(TCEP)的硫氰酸胍裂解缓冲液接触(Wu等人，Biotechniques(生物技术).2014；58(6)：293-300)。皮肤样本可以储存在Tris-HCl、EDTA和Tween中。可以使用氨执行裂解，然后中和，并且用乙酸盐析出蛋白质(Sildorova等人，Experimental Dermatology，2011)。病毒样本和细菌样本可以使用诸如Tris-HCl、溶菌酶、EDTA和其他去污剂(例如Triton X-100)的试剂进行化学裂解(Kajiuara等人，J Biomol Tech，26(4)：118-124，2015)。
样本进入
样本进入可以以各种不同的方式来执行。在设备200中所示的一个特定实施方式中，样本可以经由用于推进杆组件的带螺纹联接件被引入。在该实施方式中，进入杆组件275可以一种或更多种运动、包括单一的单向线性运动相对于进入壳体274移动，以产生多种有益结果。在某些实施方式中，进入杆组件275可以经由部件之间的联接件(包括带螺纹联接件)、包括例如进入壳体274与进入盖276之间的带螺纹联接件而相对于进入壳体274移动。例如，进入盖276可以相对于进入壳体274旋转，使得带螺纹部分271使进入壳体274(和进入杆组件275)相对于进入盖276移动。
现在参照图16至图26，示出了设备200中的用于样本装载和进入的部件在不同位置的截面图。图16至图21示出了在组装或制造过程(例如，通常在设备200交付给最终用户之前执行的过程)期间处于不同位置的进入壳体274和进入杆组件275。图22至图26示出了在装载样本以通过设备200进行分析期间(例如，在样本分析之前通常由用户执行的过程)处于不同位置的进入壳体274和进入杆组件275。为了清楚起见，不是所有元件在图中都用附图标记来标记。
如图16中所示，进入杆组件275最初定位在进入壳体274内，使得样本端口155与下部进入旁路283流体连通。在图16中所示的位置中，下部进入旁路283提供与活塞腔室157的流体连通(例如下部进入旁路283没有被密封构件280密封)。因此，真空源291可以联接至样本端口155并且施加真空使得活塞腔室157被置于真空下。在图17中，进入杆组件275在进入壳体274内被推进(例如，经由盖276的旋转)，使得样本端口155与下部稀释腔室278流体连通。同样，真空源291可以联接至样本端口155，使得下部稀释腔室278被置于真空下。在该实施方式中，稀释通道281提供上部稀释腔室277与下部稀释腔室278之间的流体连通。因此，上部稀释腔室277和下部稀释腔室278两者在该阶段都被置于真空下。
现在参照图18，进入杆组件275被定位成使得样本输入端口155和样本腔室279与下部进入稀释腔室278之间的密封构件280对准。在该阶段处，真空源291可以被从样本端口155移除并且稀释流体源292可以联接至样本端口155。在图19中，进入杆组件275被进一步推进，使得样本端口155与下部进入稀释腔室278(以及经由稀释通道281与上部进入稀释腔室277)流体连通。下部进入稀释腔室278和上部进入稀释腔室277然后可以被填充有稀释流体并且稀释流体源被从样本端口155移除。
如图20中所示，进入杆组件275从先前位置收回，使得样本端口155与样本腔室279流体连通。真空源291然后可以联接至样本端口155，使得样本腔室279被置于真空下。现在参照图21所示，进入杆组件275可以进一步收回，使得样本端口155被置于进入杆组件275的端部处的密封构件280之间。在该位置中，设备200使在样本腔室279上保持真空，同时下部进入稀释腔室278和上部进入稀释腔室277填充有稀释流体。设备200现在处于可以交付给最终用户准备使用的构型。最终用户现在可以将样本流体放置在收集腔室257(如图14中所示)中。
在样本流体被放置在收集腔室257中之后，用户可以操纵设备200(例如通过旋转进入盖276)以将进入杆组件275置于图22中所示的位置。在该位置中，进入杆组件275被定位成使得样本端口155与样本腔室279(样本腔室279先前被置于真空下)流体连通。因此，来自收集腔室257的样本流体的一部分可以通过样本端口155被吸入样本腔室279中。
如图24中所示，进入杆组件275被进一步推进，使得密封构件280不再将下部进入旁路283相对于样本腔室279密封。在该位置中，下部进入旁路283提供样本腔室279与先前被置于真空下的活塞腔室157之间的流体连通。因此，容纳在样本腔室279中的限定体积的样本材料被吸入活塞腔室157中。随着进入杆组件275被进一步推进至图25中所示的位置，下部稀释腔室278(和经由稀释通道281的上部稀释腔室277)经由下部旁路283与活塞腔室157流体连通。因此，容纳在下部稀释腔室278和上部稀释腔室277内的限定体积的稀释流体被吸入先前被置于真空下的活塞腔室157中。上部稀释腔室277和下部稀释腔室278以及样本腔室279的先前容纳物因此被组合以在活塞腔室157中形成生物样本流体混合物。上部旁路282现在定位在杆组件275的最后的密封构件280的上方，从而允许大气与上部稀释腔室278流体连通(并且借助于稀释通道281与下部稀释腔室278流体连通)。这允许活塞腔室157中的任何残余真空吸入存在的剩余流体，从而填充具有正确容积(由活塞腔室157的尺寸限定)并且处于正确大气压力下(借助于上部进入旁路282与大气压的连通)的活塞腔室157。
进入杆组件275然后可以被进一步推进至图26所示的位置(包括全部或部分地由活塞腔室157中的残余真空)，使得密封构件280(或者，可选地为可以存在于进入杆组件275的表面与进入壳体274的内壁之间的接合部处的O形环，为清楚起见而未示出该O形环)对进入旁路283进行密封。活塞腔室157现在被密封并且不再与下部稀释腔室278、上部稀释腔室277或样本腔室279流体连通。活塞腔室157中的生物样本流体混合物现在可以进行复制和分析，如下面更详细地描述的。
由设备200提供的样本进入构型提供了许多操作优势。例如，进入杆组件275包括样本腔室279和稀释腔室277和278，样本腔室279和稀释腔室277和278中的每一者为基于密封构件280、进入壳体274和活塞腔室157的构型的已知容积部。上部进入稀释腔室277和下部进入稀释腔室278容纳基于样本腔室279的容积与所需生物样本尺寸成期望比率的稀释流体。在一个特定实施方式中，样本尺寸设定在样本腔室279的50μL容积处，但其他生物样本尺寸比如1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL也是可能的。此外，在样本目标浓度低或需要提高灵敏度的情况下，可以使用更大体积的样本(例如100μL、250μL、500μL、1mL或更多)。这可以可选地与本领域通常使用的浓缩方法结合。在实践中，生物样本尺寸的下限由受关注的特定分析物的浓度(例如检测极限)设定成使得：样本中存在的最小数目的目标与所采用的测定的灵敏度的至少下限相对应(例如，能够通过为特定实施方式选择的扩增、裂解或检测技术检测的复制品的数目)。该下限体积还应考虑到其中稀释剂-样本混合物将驻留的实施方式的在反应的扩增或检测部分之外的任何部分。例如，在该实施方式中，扩增部分将在第一端部上通过杆组件的面定界，使得与扩增部分连通的容积将包括在反应的扩增部分中，但是进入壳体与进入杆组件或柱塞元件之间的腔室将在扩增部分之外。
值得注意的是，在壳体内使用真空或部分真空用于通过在稀释液-样本混合物流体与真空连通(例如，在破坏进入杆组件的密封或运动)时将这种混合物吸入到扩增部分中而最大程度地减少未反应的稀释液-样本混合物流体，正如一系列过量的稀释剂将稀释剂-样本混合物朝向扩增部分驱逐。在一些实施方式中，进入杆组件275在进入壳体274内的运动用于收集原始生物样本、限定用于扩增化学的该样本的体积、将样本与稀释流体混合并对压力容器进行密封。在一些实施方式中，压力容器可以保持高于基线压力1个、2个、3个、4个、5个或更多个大气压的压力。在一些实施方式中，结构部件由聚合物制成。在一些实施方式中，聚合物被注射模制。
在该特定实施方式中，进入壳体274和活塞腔室157的部分被抽真空，从而形成真空或部分真空(在本文中可互换地指代)。为了便于设备200的长期储存，可以结合有一个或更多个密封件以维持真空。密封件可以由聚合物(包括热条密封)、膜、蜡、流体或其他方式制成，并且密封件可以通过机械(例如柳叶刀)、热、电、动力、振动或其他方式被破坏。单独的密封件(包括各种类型的密封件组合)可以根据需要用于设备200的多个部分，例如用于进入壳体274与活塞腔室157之间、进入样本腔室279与相邻腔室(在该特定实施方式中，为稀释腔室277和278与活塞腔室157)之间的接合处。
在该实施方式中，在进入样本腔室279中也存在真空。随着进入杆组件275在进入壳体274内前进，样本端口155与经抽真空的进入样本腔室279对准，从而将生物样本170以指定的体积吸入到进入样本腔室中，该指定的体积与该腔室的体积和存在的真空百分比的乘积相对应。
样本端口可以与收集腔室(例如痰盂)257连通以用于咳出(如本实施方式中所示)或者样本端口可以使用拭子(包括絮凝的拭子)、吸收剂或芯吸条、浸量尺、触笔、毛细管、滴剂、组织样本、小瓶、管、杯子、针、琼脂或其他样本收集方式。该装置可以可选地包括收集腔室盖258和收集腔室背部259，如图14中所示的。
随着进入杆组件275继续在进入壳体274内前进，进入样本腔室279与下部进入旁路283建立连通。下部进入旁路283此时与扩增部分连通，扩增部分也包含真空或部分真空。作用是将存在于进入样本腔室279中的生物样本170的一部分朝向活塞腔室157吸入，在活塞腔室157中可以执行扩增和检测功能。进入杆275在进入壳体274内的继续推进使下部进入稀释腔室278与下部进入旁路283以及进入样本腔室279连通。扩增部分中的真空将来自进入样本腔室279的剩余的生物样本170以及来自进入稀释腔室的一定量的稀释剂进行抽吸，该一定量的稀释剂与扩增部分的体积和扩增部分的真空百分比的乘积相等，减去由扩增部分的容纳物占据的任何体积，该容纳物可以非限制性地包括，活塞140、缓冲液172、试剂173、反应流体或反应混合物、密封件和其他结构元件，这些其他结构元件包括倾向于引起容纳物的湍流和混合的凹凸部或间断部。
如前所述，在一些实施方式中，稀释通道281形成上部进入稀释腔室277与下部进入稀释腔室278之间的连通。环境大气压力与上部进入稀释腔室277之间的连通由上部进入旁路282建立，上部进入旁路282(随着进入杆组件275相对于进入壳体274前进)允许外部大气将稀释剂的流体柱驱逐到上部进入稀释腔室277中。以这种方式，进入杆组件275相对于进入壳体274的单一线性运动接受可变量的原始生物样本(但大于进入样本腔室279所期望和设定的最小生物样本尺寸)，并且借助于其动作而使加入预定体积的生物样本，将预定体积的生物样本以预定比率与稀释剂混合，并将该混合物转移到预定体积的扩增部分中。使用真空或部分真空用于使扩增腔室中存在的气相流体、包括空气最小化。
尽管示出了一个特定实施方式，但是进入杆组件275相对于进入壳体274的推进可以以各种模式来实现。当前实施方式结合了螺纹联接件，但是也可以使用各种机构和方法将样本引入用于扩增和检测的腔室中。例如，某些实施方式可以包括滑块、凸轮轴、变比率齿轮、变比率螺钉、弹簧，包括捕获弹簧以及压缩弹簧、伸展弹簧、叶片弹簧、锥形弹簧、盘式弹簧、扭转弹簧和恒力弹簧、真空辅助或真空动力推进、手动，并且也可以使用对于从业者而言明显的其他方式。在一些实施方式中，发生扩增和检测的反应腔室能够包含高于表压力的0.5atm、1atm、1.5atm、2atm、2.5atm、3atm、4atm、5atm或更多。在加热期间使用真空或借助于排气产生真空的实施方式中，反应腔室能够在10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％、99％或更大的真空度处起作用。在某些其他实施方式中，压力容器由聚合物构成。在其他实施方式中，压力容器由金属构成。在某些其他实施方式中，压力容器由金属和聚合物构成。
在某些实施方式中，设备200可以经由传感器256(例如通过电检测或光学检测)对收集腔室257中样本的存在进行检测，并且使得样本的一部分能够自动进入样本腔室279中并最终进入活塞腔室157。
扩增/复制
在样本腔室279和稀释腔室277和278的容纳物已经转移至活塞腔室157之后，可以操作设备200以对制备的样本混合物中的受关注的分析物进行扩增(例如复制)和检测。在某些实施方式中，活塞腔室157的容纳物的扩增/复制可以通过利用热循环的聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来执行。
如本文中所使用的，在描述本发明的扩增作用时可以使用术语PCR，但从业者将理解的是这些扩增技术包括不是严格的聚合酶链式反应的那些扩增技术，包括等温扩增技术以及可以利用各种类型的PCR中的一种或更多种PCR的那些扩增技术、所述各种类型的PCR比如为聚合酶链式反应(PCR)试剂，比如为用于下述各者的试剂：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、不对称PCR、热启动PCR、甲基化特异性PCR、等位基因特异性PCR、组装PCR、对流PCR、拨出PCR、数字PCR、解旋酶依赖性扩增、硅型PCR、序列间特异性PCR、反向PCR、连接介导PCR、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增、纳米粒子辅助PCR、重叠延伸PCR、PAN-AC、RNA H依赖性PCR、单个特异性引物PCR、固相PCR、自杀式PCR、热不对称交错PCR、等温PCR、降落式PCR、通用快速步行PCR、极限PCR、光子PCR、冷却PCR或热脉冲扩展PCR。
巢式PCR可以用于减小由于意外引物结合位点的扩增而造成的产品中的污染物。在两次连续的PCR运行中使用两组引物用，第二组旨在扩增第一次运行产物内的二次目标。反向PCR可以用于在仅已知一种内部序列时允许PCR比如鉴定各种基因组插入物的侧位序列。这可能在由核酸内切酶切割之前涉及一系列消化和自连接，从而在未知序列的任一端部处产生已知序列。(Rahman等人，AKMMC J,4(1):30-36,2013)。RT-PCR可以用于对来自细胞或组织RNA文库的已知序列进行扩增、分离或鉴定。不对称PCR可以用于优先地将单链原始DNA扩增为更多的其他链。对于所选择的链，可以使用大量过量的引物来进行PCR。被称为线性指数PCR(Linear-After-The-Exponential-PCR，LATE-PCR)的对该过程的修改可以使用比过量引物高的熔融温度(Tm)，以在限制性引物浓度降低中间反应时保持反应效率。定量PCR可以用于快速测量PCR产物的数量(例如，实时)，因此定量PCR是用于定量地测量DNA、cDNA或RNA的起始量的间接方法。降落式PCR可以用于在循环之间通过降低退火温度来减少非特异性引物退火。等位基因特异性PCR可以用作基于单核苷酸多态性(SNP)(DNA中的单碱基差异)的诊断技术或克隆技术。热启动PCR可以用于在PCR的初始设置阶段期间减少非特异性扩增。这可以通过在加入聚合酶之前将反应组分加热至变性温度(例如，95℃)或通过将结合的抑制剂包含到热稳定聚合酶中来执行。反向PCR可以用于对基因组插入物周围的侧位序列进行鉴定。反向PCR可能涉及一系列DNA消化和自连接，从而导致在未知序列的任一端部处产生已知序列。连接介导PCR可以使用连接至受关注的DNA的小DNA链和退火至DNA链的多个引物；连接介导PCR可以用于DNA测序、基因组行走和DNA足迹。微型引物PCR可以使用热稳定聚合酶(S-Tbr)，该热稳定聚合酶可以从如9或10个核苷酸一样短的短引物延伸。该方法允许PCR靶向较小的引物结合区域，并且可以用于扩增保存的DNA序列，比如16S(或真核18S)rRNA基因。甲基化特异PCR(MSP)可以用于检测基因组DNA中CpG岛的甲基化。可以使用的其他类型的PCR包括极限PCR、光子PCR、冷PCR、纳米粒子PCR和热脉冲延伸PCR。
本文公开的实施方式可以使用适合于扩增模式的一个或更多个温度区。例如，可以采用用于等温模式的单个区、用于PCR的两个区域，或用于下述各者的更多个区：多个温度区，包括例如针对三个温度PCR；或特殊目的、比如用于冻干组分的结合剂的起始或初始解离或逆转录酶进行作用以允许进行TR-PCR。在其他实施方式中可以使用多于三个的温度区，包括4个温度区、5个温度区、6个温度区、包括7个温度区、8个温度区、8个温度区或更多个温度区。
在示例性实施方式中可能的等温扩增方法的示例包括基于核酸序列的扩增(NASBA/3SR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、基于链侵入的扩增(SIBA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、Toehold介导的等温扩增、切刻酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、转录介导扩增、RNA技术的信号介导扩增、等温多重置换扩增、单引物等温扩增、环状解旋酶依赖性扩增、交叉引发扩增等。这些技术分别总结在以下来源中，这些来源通过参引并入本文：
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:A Novel Isothermal DNA AmplificationTechnology Demonstrating High Specificity and Sensitivity for a SingleMolecule of Target Analyte(基于链侵袭的扩增
Figure BDA0003189920900000382
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用于对受关注的目标、例如包括抗体在内的蛋白质进行检测的其他扩增方法通过使用通过参引并入本文的比如邻位连接技术(PLA)是可能的(由Weibrecht I,LeuchowiusKJ,ClaussonCM,Conze T,Jarvius M,Howell WM,Kamali-Moghaddam M,
Figure BDA0003189920900000383
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热源
热循环可以用各种不同的热源来完成。尽管在所示实施方式中描述了经过第一加热线圈的电流，但其他实施方式可以利用不同的技术。例如，在其他实施方式中，热源可以使用电阻、电磁感应、绝热、微波、放射性同位素、声波、摩擦、化学、地热、用户/体热或太阳能加热方法。如果基于电力热源可以使用电池、电插座、电池和电插座两者、或其他电源比如无线充电源或USB电源，这些无线充电源或USB电源连接至任何使能装置，比如计算机、智能手机、平板电脑、太阳能电池或光伏电池。在一些实施方式中，加热线圈可以通过将细碎粉末状或液化的金属比如铝、铜、黑色金属或各种合金、包括镍、钛和其他(或其他导体比如石墨或导电墨水)与呈液体或颗粒形式的聚合物一起混合而由导电聚合物代替，以产生导电第一端部或导电第二端部或导电第一端部和导电第二端部两者，导电第一端部或导电第二端部具有高电阻并且可以代替加热线圈或附加于加热线圈地用作电阻加热器。在其他实施方式中，加热线圈可以包含一个或更多个并联线圈。在一些实施方式中，这些并联线圈可以用于冗余。在其他实施方式中，这些并联线圈可以用于分配实现特定电阻所需的绕组数目。
热控制
热源可以通过热桥直接地加热反应流体，或者可以对会将热传递至反应流体的辅助材料比如蜡、油或水性流体进行加热。该传递可以是间接的，或者可以与反应流体混合，从而扩大体积。金属氧化物、环氧树脂和其他化合物会在化学或物理上抑制PCR、或降低效率，而具有较低反应性材料的涂层比如铬、替代性聚合物或保形涂层可以减轻该抑制，同时保持其他优先属性比如热导率曲线、或物理硬度。
以类似的方式，上述方法可以用于热调节，包括冷却或调制散热。这可以采用主动或被动方法比如珀耳帖、绝热、化学、风扇或空气循环器、以及特定几何形状、或环境暴露控制、散热器暴露、液体或相变冷却、纳米管或热管。
在一些实施方式中，装置使用热电偶或电阻温度检测器(RTD)来感测装置部件的温度。在某些实施方式中，装置使用热敏电阻代替热电偶或电阻温度检测器(RTD)来感测装置部件的温度。在一些实施方式中，热敏电阻会由于热敏电阻的低成本、快的响应时间以及每摄氏度变化的电阻较大变化而是优选的。热敏电阻在一些实施方式中的使用是可行的，因为装置的绝对精度要求低并且能够使用相对而非绝对的原始导电值来计算如本文别处所述的温度。这些装置可以批量地以若干模式进行校准，从而无需单独校准每个装置。在一些实施方式中，可以通过计算两个或更多个温度数据点的斜率来获得温度曲线的线性近似。在一些实施方式中，该关系可以通过3个、4个、5个或更多个温度数据点来计算，并且曲线与线性函数相比可能更高阶，比如移动平均、多项式、指数、对数或其他数学变换。在一些实施方式中，对数据点的曲线的回归可以用于借助于最小二乘法或其他合适的方法来确认曲线拟合。在一些实施方式中，装置可以批量升高至预定温度，例如25℃、65℃和95℃，并且每个装置上的热敏电阻的校准数据可以存储在非易失性存储器中。在一些实施方式中，热敏电阻自校准软件可以仅在校准阶段期间驻留在装置上。在其他实施方式中，热敏电阻可以在校准阶段之后保留。在一些实施方式中，批次内的校准的可变性程度可以是1％、2％、3％、5％、10％或更多。在一些实施方式中，曲线拟合的R2线性回归值可以小于0.75、0.8、0.9、0.95或0.99。这种高的可变性允许装置以较低的价格点来制造。
循环控制
在设计这些装置时，使扩增所需的时间最小化是有益的。这可以通过若干方法来实现，包括减少循环数目、减少循环持续时间、减少循环间停留时间、或者优化控制系统逻辑，包括温度和流体循环控制。
循环数目可以通过利用更灵敏的反应、实施下述化学裂解来减少：该化学裂解产生更完全的裂解、更好的目标回收、更少的核酸降解或更好的包括优先的核酸保存。严格的温度控制有助于减少循环数目，从而减少温度变化次数、缩小所采用材料的工作温度范围，并且又允许当实际反应腔室条件接近其理想情况时的更完整的PCR活动。在一些实施方式中，温度变化率可以小于或等于1℃/s、大于1℃/s、2℃/s、3℃/s、5℃/s、10℃/s、15℃/s或20℃/s。在其他实施方式中，特别是具有小于50μL、25μL、15μL、10μL、5μL、3μL、1μL或更小的反应的实施方式中，温度变化率可以大于25℃/s、35℃/s、50℃/s、60℃/s、70℃/s、80℃/s、90℃/s或更大。如本文别处所述，如果获得某些结果(比如对照值与实验值之间的足够分辨率)，也可以通过使算法优化以提前终止扩增来减少循环数目。在某些实施方式中，还可以基于环境温度来调节温度变化时间，环境温度可以用装置传感器检测。例如，在环境温度为0℃的情况下，使温度增加的变化时间将大于环境温度为40℃的情况下的变化时间。相反，使温度降低所需的时间在环境温度为0℃时将减少，而在环境温度为40℃时将增加。对传导的热传递和对流的热传递以及辐射的热传递进行补偿的方法对于从业者来说将是明显的。
在本文所述的一些实施方式中，该装置允许任何特定PCR循环的持续时间的长度可变，而不是如传统PCR中的情况下的时间那样固定。因为在一些实施方式中，反应容器包含荧光或比色探针，并且因为该装置的设计在一些实施方式中允许在扩增过程期间实时地对这些探针进行检测，所以扩增反应的状态不仅可以如通过传统PCR可能的那样以循环间(inter-cycle)方式来评估，而且还可以以循环内(intracycle)方式来评估，其中，检测系统的低延迟和设计允许在一个或更多个通道上以短间隔的方式进行重复的荧光测量，并且可以使用瞬时荧光的计算、瞬时荧光的斜率，并且瞬时荧光的斜率的变化率来确定已完成或尚未完成的PCR半循环(包括延伸)的比率(参见通过参引并入本文的Rutledge,RG,(2004)Nucleic Acids Research(核酸研究),第32卷,第22期，以及Liu,W.和Saint,DA(2002)Validation of a Quantitative Method For Realtime PCR kinetics(实时PCR动力学定量方法的验证).Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理研究通讯),294,347–353.)。在一些实施方式中，测量的间隔可以小于5毫秒、10毫秒、15毫秒、20毫秒、25毫秒、30毫秒、40毫秒、50毫秒、75毫秒、100毫秒、150毫秒、200毫秒、300毫秒、500毫秒或更大。
在其他实施方式中，可以使用S形曲线拟合。在一些实施方式中，四个参数S型函数Fc＝Fb+Fmax/(1+e-(C-C 1/2 /k))可以在不需要标准曲线的情况下用于建立实时PCR曲线，其中，Fc是循环C的荧光，Fb是基线荧光，Fmax是所测量的最大荧光，并且k是斜率。在一些实施方式中，PCR可以是半定量或定量的。在一些实施方式中，循环间Δk可以用于确定指数阶段与平台阶段(例如，过渡阶段)之间的过渡的截止点。在一些实施方式中，一旦已经达到与过渡阶段相关的预定点，控制器195可以使活塞140从第一端部151循环至第二端部152。在一些实施方式中，控制器可以使用与循环间变化相关的计算。在其他实施方式中，控制器可以使用与本文别处描述的循环内变化相关的计算
可以通过将传感器尽可能地靠近反应流体(例如，距反应流体不多于5mm，或更优选地不多于4mm，或更优选地不多于3mm，或更优选地不多于2mm，或更优选地不多于1mm)且同时尽可能保持至热源的高的热梯度来减少过多的停留时间。这减少了虚假的热读数，并且能够实现热循环的更快平衡。为了确定用于化学扩增的足够停留时间与最小化的循环持续时间之间的最佳平衡，停留时间可以通过重复的标准化PCR控制被迭代地减少，同时观测PCR输出。作为可选步骤，一旦观测到在PCR产量中第一个材料减少(或者根据需要在第一个材料减少之前)，可以采用算法(设计范式本质上可以是递归或迭代的)，从而将温度增量划分在足够的PCR输出结果时间与减少的时间之间，直到观察到优选地小于5秒，但甚至更优选地小于3秒、2秒、1秒或更小的增量为止。以这种方式，使温度优化的效率接近n(logn)效率，这优于线性或随机优化方法。
循环持续时间可以通过以若干方式使热源与反应流体之间的热传递速率增加而被最小化。使加热表面积与反应流体体积的比率增加是优选的，其中，在一些实施方式中，用作基底的反应流体腔室的比率为(3/半径)，表面积与从腔室边缘至反应流体腔室中心的平均距离的比率为4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多，并且使加热表面积与反应流体体积的比率增加可以通过减少反应体积、使加热表面的表面积增加、或使三个维度形式中的一个维度或二个维度展平(或这些改变的组合)来实现。减少反应体积是有利的，因为减少反应体积使每次测定所需的试剂成本减少，并且与更小的装置几何形状相关，这又降低了成本和热行进的距离。体积可以通过下述方式减少：使样本流体浓缩(例如通过使用离液盐，比如在Boom方法中-参见通过参引并入本文的R.Boom等人,J.Clin.Microbiology,1990年3月)或通过许多标准核酸浓缩技术，这对从业者来而言是明显的。样本流体体积在不浓缩的情况下的减少——尽管从实施的角度来看更简单——可能会影响某些样本的灵敏度，并且可以在分析物的检测界限支持样本的临床或实验相关的体积减少的情况下应用。附加地，减少反应液中最终存在的样本液的比例可能会使样本类型固有的PCR抑制剂的抑制作用降低，PCR抑制剂为比如如在描述稀释剂与样本的比率的部分中所述的血液中的血红蛋白或植物中的酚类化合物。
加热表面的较大的表面积可以在基于活塞的装置中通过使热接触盘的直径增加、使从加热表面至流体最远方面的线性距离减少或使热传递的几何形状改变来获得，使热传递的几何形状改变例如通过将加热元件延伸以沿着活塞的轴线环绕反应流体、通过端部或侧向翅片将加热元件延伸到反应流体中(直接地或通过热传递)，并且当采用其中活塞和腔室与反应流体直接接触的设计时，优选的是将具有反向结构的那些突出部容纳在活塞端部与腔室端部之间，使得任何突出部或凹凸部彼此交叉以使如本文别处所述的死区最小化。表面积也可以通过以下述各种方式改变表面积来增加：这些方式设计成例如通过包括微孔、微槽或纳米结构来引起这种增加。
如本文中所使用的，在反应的上下文中的“死区”或“无效区”是指反应腔室中反应流体的在装置操作期间不处于针对扩增的理想温度处的部分。死区可能由下述各者引起：制造公差(包括表面的光滑度和表面之间的间隙)、导致与热源分离的流体行进路径、粘附至反应腔室表面的流体、或在循环期间阻止热充分传递至流体的几何形状。在某些实施方式中，死区对反应效率的影响可能是显著的。因此，当设计基于往复活塞的扩增腔室的几何形状时，作为总反应流体体积的百分比的死区的最小化可以如下获得。
总的潜在死区可以首先通过减小活塞与腔室壁(或在不使用不同腔室的实施方式中的相应端盖侧壁)之间的周缘或周向公差而被最小化。在某些实施方式中，在活塞于上述约3秒至5秒的范围内、但如稍后讨论的那样优选地小于2秒、或1秒地从行程的一个端部运动至另一端部时，到达该公差的下限并且完成优化。具体实施方式包括毛细管以促进流体在活塞的一个端部与另一端部之间的运动，而不经过周向空间(无论是公差空间，还是在活塞/腔室接合处设计的凹槽或变平)。由毛细管引入的死区的量(在一些实施方式中具有小于3mm、2mm或低于1.5mm、1mm、0.7mm或0.5mm的累积直径)小于周向死区所需的量，以实现相同的行程速度。此外，就行程速度而言，在相同体积的多个毛细管上可能需要单个毛细管，或者当反应流体的粘度在最低的可允许的环境温度处高于0.9cP或在操作温度处高于0.5cP、0.4cP或0.3cP时可能需要单个毛细管。
检测
如前所述，设备200可以操作成使活塞腔室157的容纳物扩增。在扩增过程期间，设备200还可以操作成在不需要将来自活塞腔室157的所制备样本混合物转移或输送的情况下对所制备的样本混合物中的受关注的分析物进行检测。因此，设备200可以操作成在不需要将样本传送至不同的位置(即扩增)的情况下在同一位置(例如活塞腔室157)中扩增样本的容纳物和检测样本内的分析物。
现在参照图27，示出了检测盖组件250的分解图以及检测盖组件250所联接的第二端部152。在所示的实施方式中，检测盖组件250包括端板231以将活塞腔室157的容纳物与设备200的电子照射部件和检测部件分开。在某些实施方式中，端板231可以容许一个或更多个范围的波长，例如是可见光可透过的。
端板231可以安装在边框230内，边框230可以以螺纹的方式联接至壳体150的第二端部152。检测盖组件250还可以包括边框盖236，边框盖236可以以螺纹的方式联接至边框230，使得光罩232和检测控制器234位于端板231与边框盖236之间。
在一些实施方式中，设备200可以利用结合荧光探针的检测方法来识别特定分析物。在特定示例中，这些探针可以具有一个或更多个吸收最大值并且具有一个或更多个发射最大值。在所示的实施方式中，检测控制器234包含一个或更多个光源237、一个或更多个检测器235、零个或多个(可选的)发射源光电检测器239、以及一个或更多个过滤器240。在特定实施方式中，光源237可以包括电致发光灯比如发光二极管(LED)、有机发光二极管(OLED)、聚合物发光二极管(PLED)和/或高功率发光二极管(HP-LED)，或者包括白炽光源、荧光光源、高强度放电(HID)光源、卤素光源、化学发光光源、金属卤化物光源、基于燃烧的光源、基于核的光源、太阳光光源、辐射发光光源、热发光或磷光光源等，并且检测器235可以包括光电二极管、光度计或其他合适的光检测器。在一些实施方式中，过滤器是带通过滤器，并且在一些实施方式中，这些带通过滤器可以是短通过滤器或长通过滤器。这些短通过滤器和长通过滤器可以被布置成使得受关注的发射和激发最大值能够在照射源的同时激活期间被辨别。在其他实施方式中，过滤器、光源和检测器将被选择成适应多个通道，例如，2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个通道，这对本领域从业者而言将是熟悉的。
在操作期间，检测控制器234可以通过一个或更多个光源237发射光247而照射活塞腔室157的容纳物。然后可以通过一个或更多个检测器235检测由对活塞腔室157的容纳物的照射产生的响应248。在特定实施方式中，响应248可以从结合至活塞腔室157的表面的分析物249检测到。光247在不使用配置成重新引导光路径(例如，不使用透镜或镜子)的部件的情况下跟随从光源237延伸至活塞腔室157的光路径。此外，响应248在不使用配置成重新引导光路径(例如，不使用透镜或镜子)的部件的情况下跟随从分析物249延伸至活塞腔室157的响应路径。为了清楚起见，光247至活塞腔室157和响应248自活塞腔室157的相应的路径没有用附图标记标记。
如果检测方法采用荧光，则可以选择下述材料：该材料在检测模块中使用的发射或吸收波长(例如，优选地400nm至700nm，例如约485nm)处不显示自发荧光，这可以在设计阶段期间通过在存在聚合物和不存在聚合物的情况下执行扩增反应并且对凝胶上可见的荧光进行比较来确定，其中，材料的背景荧光贡献优选地小于阳性对照的信号的10％，但更优选地小于5％、3％、2％、1％或更少。
附加地，对于通过一个或更多个光源/照射器和一个或更多个检测器的依赖于光或电磁辐射的荧光检测或方法，一个实施方式是使用在相关波长中具有较低反射率的材料以通过减少照射光的反射(辐射)来增加信噪比。在其他实施方式中，使用较高反射率材料允许光电检测器捕获更高量的信号。如本文所讨论的，根据绝对和相对信噪比(SNR)水平，任一者都可以是适合的优化技术。
现在参照图28至图29，在某些实施方式中，设备200可以配置为基部及筒组件。在图示的实施方式中，设备200包括基部201和筒202。在图28中，筒202还没有插入到基部201中，而图29示出了插入基部201中的筒201。在某些实施方式中，筒202可以特别地配置成用于检测特定的目标分析物(例如筒202可以包括适合于特定分析物的扩增和检测的特定试剂)。因此，可以以套件提供单个基部201和多个筒202以提供对各种不同分析物的检测。
在该实施方式中，样本进入、扩增和检测的试剂容纳在腔室203内，该腔室203可以包括与先前描述的实施方式中所示的实施方式类似的进入杆组件和壳体。腔室203包括端板204，该端板204可以容许一个或更多个范围的波长，包括例如是可见光可透过的。筒202可以插入到基部201中，使得腔室203位于壳体150内并且端板204靠近检测盖组件250。因此，可以以与本文公开的其他实施方式等效的方式执行检测。
在图29中所示的实施方式中，基部201可以重复使用，而筒202可以是一次性的。因此，基部201可以用于多次分析，而筒202可以在单次使用、包括多路使用或并行使用后丢弃。在使用期间，样本和扩增流体容纳在筒201的腔室203内，这可以消除对针对多次使用而净化基部201或以其他方式准备基部201的需要。因此可以通过允许多次使用筒201中的部件来减少设备200的操作的总成本。
循环间检测方法
执行自动检测的当前一代PCR装置使用各种技术，所述各种技术通常依赖于对扩增效率的在先了解和两条曲线(实验曲线和标准曲线)的比较。
该模式的替代方案是使用不需要预先知道扩增效率的曲线拟合技术、比如4-因子参数曲线拟合。通常，这些技术依赖于辐射测量校准的光学系统以允许对PCR扩增结果进行准确解释。
为了使用不依赖于作为检测基础的绝对(辐射测量)校准值并且能够在不预先了解特定样本和反应的扩增效率的情况下检测荧光的装置来检测PCR产物，可以应用的一种方法是将早期基相期间的初始PCR循环的相对基线与荧光(或其他)信号值的滑动窗口进行比较，以检测S型曲线的线性阶段和曲线的后期渐近阶段。
光源和其他电子部件的自加热通常由于存在的热噪声而使这种比较不切实际，这会在建立基线时的阶段期间赋予可变斜率，但如果热噪声被充分地控制(在一些实施方式中借助于共同的散热器或散热片，例如通过结合在第二端部152与检测控制器234的部件之间的铜或铝)，这种斜率的可变性可以被消除或减轻到至斜率的可变性不会干扰检测的程度。
不依赖于辐射光学系统校准并且对热噪声具有鲁棒性的、使用相对基线的这种循环间检测的一个实施方式如下。首先，在与可检测PCR扩增相关的S型曲线的基相(groundphase)与线性相(linear phase)之间的指数转折之前，在PCR反应处于初始循环时建立基线。在一些实施方式中，基线可以具有非零的斜率，并且可以应用校正因子(例如，使用线性回归)来将数据变换为近似平坦(零斜率)的基线。基线值的数目可以是少至2，但可能包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多值。针对基线计算样本平均值和方差。值得注意的是，在一些实施方式中，包含在基线中的基线值的数目会改变自由度，并且因此改变用于所选的统计测试的置信度值，因此对于这些实施方式，应该包括具有计算统计量所需的函数的数学库，或者如果使用查找表代替此类数学库，则应包括每个允许数目的基线值的适当查找值(包括近似值)。在一些实施方式中，基线值表(或列)的数目是一个。在其他实施方式中，这种查找表(或列)的数目与允许的基线值集合的大小数目相对应。
第二，建立滑动平均窗口。该滑动平均窗口可以包括少至2个值，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多值。第三，一旦滑动窗口的平均值超过基线的平均值，在每个PCR循环的同一点(在一个实施方式中在冷循环结束处)，执行统计测试(参见能够从http://itl.nist.gov/div898/handbook/获得的通过参引并入本文的NIST/SEMATECH统计电子手册方法，2013年10月更新版)以建立基线与滑动窗口之间的差异并非偶然的置信区间。
在一个实施方式中，统计测试是双样本t测试，其中，t2值计算如下：
Figure BDA0003189920900000471
其中：
t2＝t2统计值
Figure BDA0003189920900000472
＝所选滑动窗口的平均值
Figure BDA0003189920900000473
＝所选基线的平均值
VarW＝所选滑动窗口的方差
VarB＝所选基线的方差
nW＝滑动窗口的所选值的数目
nB＝基线的所选值的数目
在一个实施方式中，双样本单尾t测试使用查找表来确定t分布的置信度，例如使用8个自由度，
索引 t<sup>2</sup> t 置信度
1 0 0 0.50000
2 1 1 0.8267
3 2 1.4142 0.9025
4 3 1.73205 0.9392
5 4 2 0.9597
6 8 2.8284 0.9889
7 20 4.4721 0.999
8 42 6.4807 0.9999
9 80 8.9443 0.99999
10 147 12.1244 0.999999
在一些实施方式中，检测结果基于对t2值的查找，t2值的查找简化了计算并且取决于设备的存储器的尺寸和容纳更复杂函数所需的数学库的大小，t2值的查找允许使用包含较小存储容量的电子部件(在某些情况下小于4MB、2MB、1MB、512kB、256kB、128kB、64kB、48kB、36kB、24kB、18kB、16kB、12kB、10kB、8kB、6kB、4kB、2kB、或更小)，从而降低构造的成本。在其他实施方式中，使用数学计算迭代地计算置信度值。
在其他实施方式中，统计测试是失拟测试(lack-of-fit test)，例如平方和的分析。在其他实施方式中，统计测试是贝叶斯(Bayesian)测试，例如基于来自先前装置运行的数据并对当前运行的拟合进行比较的一种测试。在其他实施方式中，统计测试是不依赖于关于数据分布的先验假设的非参数统计测试、比如符号测试，并且例如一旦在数据收集期间偏离大于预期，则使用平均值的方差以拒绝原假设。
总体上，将系统设计成在不需要高等数学运算比如三角学、指数、积分等的情况下进行操作是有利的，因为这种库通常需要1千字节、1.5千字节、2千字节或更多千字节(kB)的存储。在特定实施方式中，不包括浮点数学的定点数学的排他性使用降低了计算的复杂性，使得不使用这样的数学库，从而将代码大小减少约2kB。尽管这在台式或其他复杂的PCR机器中是微不足道的总和，但在针对小代码大小进行优化时(这对于实现用于部件的低成本基础很重要)，尤其是在小型、便携式或一次性装置中，从4MB、2MB、1MB、512kB、256kB、128kB、64kB、32kB、16kB、8kB、4kB或更小的存储池减少该存储需求量是有意义的减少。在一些实施方式中，这些函数的消除可以通过使用函数的查找表(例如开根号、统计、变换等)或通过约束至2的整数幂的值来实现，使得可以容易地应用按位操作。在一些实施方式中，通过样本集的大小的先验知识来促进查找表的使用，使得(例如，自由度可以是已知的并且)计算可以被简化。
另外，在一些实施方式中，为了节省空间，可以对特定操作进行近似计算。例如，要计算不是完全平方数的数A的平方根，可以使用查找表(包括散列查找表)来确定该平方根的一种方法如下：
步骤1：确定小于A的最大完全平方(以下简称B)；
步骤2：确定大于A的最大完全平方(以下简称C)；
步骤3：计算由(A-B)/(C-B)得到的商(下文为Q)；
步骤4：将Q相加至B的平方根，以获得A的近似平方根。
为了说明应用上述过程，如果需要近似计算32的平方根，32的平方根为5.657(四舍五入到小数点后三位)，则过程将如下：
步骤1：小于32的最大完全平方为25；
步骤2：大于32的最大完全平方为36；
步骤3：(32-25)/(36-25)＝大约0.636；
步骤4：25的平方根+大约0.636＝大约5.636。
此外，在一些实施方式中，为了增加用于测试的有效性的置信度，还可以包括额外的检测通道，例如控制通道，这些通道使用用于上述实施方式来获得检测结果。在一个实施方式中，通道之间的布尔真值表的构建基于置信度以二进制格式将检测结果联接，其中，置信度阈值确定每个通道的成功或失败。例如，假设具有两个对照(C1和C2)和一个样本(S)的3通道系统，其中，置信阈值为0.999或更高从而表明检测通道成功或失败。在一个实施方式中，使用布尔代数将控制通道分组为组合对照结果C，使得C＝C1与C2。将C与S进行比较以创建具有四(4)个结果的结果真值表：
C＝成功 C＝失败
S＝成功 正结果 错误结果
S＝失败 负结果 非确定性结果
附加地，另一实施方式利用基于每个检测结果的置信度的评分方法。整个系统结果可以基于得分的组合进行表征，从而为每个结论创建不同的范围。例如，使用针对8个自由度的t分布的查找表的索引值作为得分点，具有控制通道(C)和样本通道(S)的2个通道的测试会将索引相对于置信度进行关联；C与S之间的得分点的组合(例如，来自统计查找表中的算术差异或指数总和)将为不同结果确定具有不同范围的系统结果：
结果
≤0 错误
1-4 负
5-15 非确定性
16-20 正
循环内优化方法
在一些实施方式中，如果循环内的扩增速率是非线性的并且循环的第一部分与循环的其余部分相比表现出大于线性的增益，则可以缩短统计学检测的总时间。如果倍增循环需要n秒，则一些反应由于反应的热特性或其他固有性质比如核苷酸、抑制剂、酶的浓度或活性等而可能在循环中提早表现出较大的扩增。用以倍增的循环的数目可以通过时间近似计算为达到特定百分比，并且一些反应可以因减少的循环时间而受益。在一些实施方式中，该优选的百分比对应于从PCR循环开始的最大斜率的点。在其他实施方式中，例如当核酸浓度的变化率与能够检测的荧光团的变化率不同时，对优选百分比进行调节以补偿该差异。
例如，如果倍增时间为80秒并且反应在前20秒中达到该反应的总荧光增加的30％(其大于线性，因为20/80在给定线性特性的情况下将预计产生25％的增长)，那么用以倍增的循环的数目如果缩短为20秒的循环的话则将为ln(2)/比率或大约69.3/30＝2.3个循环。在20秒/循环的情况下，对于大约两倍而言大约等于46秒，这比80秒快42％。使用这种荧光曲线压缩的方法，缩短的循环荧光曲线可以通过应用后处理增益系数而被拟合成呈现为全循环曲线。该方法例如在倍增时间的预先估算已知的情况下或者在倍增时间的预先估算未知并且早期循环用于对扩增动力学进行估算以选出循环的优选百分比时可以与其他实施方式结合。
在一个实施方式中，额外的优化可以在无需曲线动力学、光学系统的辐射测量校准或热系统的逐单元校准的高级知识的情况下通过对循环内(在一个或更多个单个循环的范围内)的荧光信号的分析来实现。尽管当前这一代PCR装置通常依赖于在每个PCR循环(循环之间)结束时获得用于检测的荧光读数，但使用本文中所述的允许扩增(将扩增和检测阶段组合成单个过程)的实施方式允许在单个循环的过程期间进行读数。
该实施方式在分析未知浓度和扩增效率的样品时在PCR效率方面实现了显著提高。在一些实施方式中，该提高可以达5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％或更多。在特定实施方式中，该提高为4％。在其他实施方式中，该提高为约26％。该实施方式还允许检测系统自动补偿操作环境或装置状态中的变化，并且进一步减少或消除对校准的需要。在一些实施方式中，本文中所描述的装置不需要先前的测定专用热校准(例如，使用基于已知标准DNA片段的熔解曲线分析来校准温度与荧光之间的关系)。此外，在一些实施方式中，可以使用未使用辐射测量校准进行光学校准的系统来执行检测。
在一些实施方式中，来自光电二极管的电信号(例如，模拟数字转换器标记(tick)或ADC标记)可以响应于光检测器上增加的光而减小，而在其他实施方式中，电信号可以响应于增加的光信号而增加。为了清楚起见，本文中讨论的是光电二极管上增加的光导致从ADC看到的标记减少(即，相反关系)的实施方式，但是本文中描述的方法和结构可以应用于任一实施方式。
在一些实施方式中，光检测器的特征可以在于建立噪声基底以确定在统计学计算中使用的元件的数目。此外，为了简化计算并且确保样本集合相对于标准偏差的高置信度，计算样本的最小数目时的近似值可以给出如下：
Figure BDA0003189920900000511
其中：
nmin＝元件的最小数目
Z＝与期望置信区间对应的z得分值
σ＝标准偏差
ErrTol＝误差容限
在一些实施方式中，为Z选择值2确保了大于95％的置信度，并且选择ErrTol作为标准偏差σ的因子简化了对样本的最小数目的计算，这在处理器速度、内存大小或数学库函数的可用性受限、例如因成本约束而受限制的情况下是有利的。
在一些实施方式中，移动平均可以包含n个元素的指标，其中，n是大于或等于一的正整数。在一些实施方式中，移动平均例如可以通过为每个指标数字赋予相同的权重(例如，在四指标移动平均(four-index moving average)中，权重可以是[1,1,1,1]/4)而被平衡。在某些实施方式中，优选的是，各权重的和等于2x，其中，x是整数(包括0)，因为这有利于按位计算。在其他实施方式中，移动平均例如可以利用偏倚例如利用朝向新近偏倚的权重(例如，在三指标移动平均中，权重可以是[5,2,1]/8)而被加权，同样，对于某些实施方式优选的是，和总计等于2x，其中，x是整数(包括0)。
在一些实施方式中，荧光信号由对温度表现出敏感性的染料(例如，DNA结合染料)发射，使得荧光在循环内随着流体的温度降低而增加。在其他实施方式中，荧光信号由在早期循环内期间对温度表现出敏感性的探针(例如，5’水解探针比如TaqMan探针，此类术语在本文中能够互换使用)发射，其中，降低温度使结合能降低或者导致探针形成二级结构，进而导致荧光团与猝灭剂之间更加接近并且导致在循环的延伸部分开始之前荧光团的初始降低，在该延伸部分期间，荧光团开始增加。在任一实施方式中，一旦PCR试剂的温度降低到足以使延伸发生，则荧光团就开始增加(在该实施方式中导致ADC标记值降低)。
在一些实施方式中，可以使用任何有效的统计学方法对数据进行过滤，以排除异常值。例如，异常值可以被指定为1.5*四分位数间距(IQR)。在其他实施方式中，可以在计算加权平均值之前去除集合中的最小值或最大值。在其他实施方式中，可以排除比平均权重大特定百分比的偏差。在一些实施方式中，所使用的统计学检验(例如，符号检验)在本质上对于异常值而言是稳健的，这是因为没有考虑差异的大小并且对最新近数据点的运行平均进行检查的性质使其对于检测变化(新近偏倚)而言是敏感的。
在一些实施方式中，荧光值的斜率的变化可以用于确定PCR反应何时达到受关注的转折点，这些转折点包括可以执行自动调用的点或PCR循环可以终止以提高反应的效率、速度或可靠性的点。在一些实施方式中，可以执行以下方法来确定PCR循环的延伸部分是否已达到一个点(例如，转折到PCR的S型曲线的渐近部分)——在该点处，结束延伸时段并且转移活塞以使大部分反应流体移动至第一端部(即，热循环仪的较高温度侧部)以重新开始另一PCR循环，这在应用于一个或更多个PCR循环的情况下将产生最终更快的扩增：
·第一，相对于本文中所述的标准偏差、置信度和误差容限建立的荧光值f的n大小的阵列(其中，n＝1+样本的最小数目)；例如，将z值选择为2(对应于大于95％的置信度)并将误差容限选择为标准偏差/sqrt(2)，导致最小样本大小为8。阵列f是滑动窗口，从而保持n个最新近的值。随着n的值增加，滑动窗口变得不那么容易受到噪声影响，但是相对于循环的延伸部分的结束而进行早期(循环之内)调用的能力(如下所述)会迟缓。在一些实施方式中，n为2或3。在其他实施方式中，n为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20或更大。在一些实施方式中，已经对荧光值f进行过滤以排除如本文中所述的异常值。在其他实施方式中，已经对荧光值f(或一旦异常值已被移除后的值)进行加权以应用平滑函数。在一些实施方式中，该平滑是荧光值关于加权值的卷积。如下所讨论，在PCR循环期间读取额外的荧光值。为清楚起见，当讨论对这些值的添加、选择或操纵时，应当理解的是，这也可以包括应用于经过滤或经平滑的数据的此类功能。
·第二，在滑动窗口内，确定最新值何时为阵列内的最小值；根据定义，这确保了整个阵列的下降趋势斜率。
·第三，一旦f的最新成员是滑动窗口内的最小值，则明确f内的最大值及其指标。由于荧光值具有波动，选择局部最大值允许最大的转折点并因此允许最大的绝对斜率计算。这是被认为是建立PCR的指数阶段的点。在一些实施方式中，可以使用二进制位对斜率的符号进行编码。
·第四，建立斜率值m的大小为k＝n-1的阵列，该阵列包含从f中明确的局部最大值开始的斜率。如果局部最大值不是最旧的条目，则继续读取荧光值并计算斜率值，直到针对阵列m达到了大小k。阵列m是滑动窗口，从而保持最新近的k个斜率。当k个斜率被计算时，这建立了最小基线集合。
·第五，计算mk＝fn+1-fn(并在每次新的荧光值添加至阵列时更新mk＝fn+1-fn)，从而在阵列m中保留最新的k个斜率。在读数之间的时间变化的一些实施方式中，mk＝(fn+1-fn)/(tn+1-tn)，其中，t是时间间隔。
·第六，对阵列m的滑动窗口内的最新近的斜率计算mk进行比较，并且如果该最新近的斜率计算mk是滑动窗口内的最小负斜率(或最大正斜率)，则这是被认为是建立PCR的渐近阶段的点。在达到该阶段的一些实施方式中，活塞被循环以将大部分PCR反应流体引导至腔室的另一端部(较高温度的端部)并且PCR循环结束。
·第七，返回至第五步以计算下一荧光值的斜率。
在其他实施方式中，(例如，当使用双链DNA结合染料时，因为聚合酶延伸可能滞后于荧光变化)，在使活塞循环之前分配额外的时段。在一些实施方式中，该额外的时段是静态的时段并且可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20秒或更长。在其他实施方式中，该时段基于特定的测定条件而被调节。例如，如果腔室的较低温度端部的温度对于最佳PCR延伸而言太热或太冷(在一些实施方式，从理想值偏离1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃、10℃、12℃、15℃、25℃、35℃、45℃或偏离更多)，则可以分配额外的时间，或者，如果被扩增的目标序列的长度较小(在一些实施方式中，等于序列长度的变化的百分比高于或低于200bp)或者所使用的聚合酶的速度增加(在一些实施方式中，与聚合酶速度相对于天然Taq聚合酶增加或减少的百分比成比例)，则可以缩短该额外的时间。
光学分析
当前的PCR荧光检测系统由于以下几个主要原因而相对昂贵：这些PCR荧光检测系统需要准直透镜和二向色镜，这些PCR荧光检测系统采用用于高光学效率的设计特征，这些PCR荧光检测系统需要辐射测量校准、高复杂性和大量的沿着光学路径的部件子系统。为了生产低成本的PCR荧光检测系统，优选的是，减少或消除这些元件中的每个元件。如本文中所使用的，术语“透镜”用于指代可以以多种不同方式构造的光累积器。例如，透镜可以构造有光纤部件和/或可以以凸面式、凹面式、菲涅耳式或其他适合的构型构造以用于光累积。
如果发射器与检测器之间足够接近并且从到达检测器的荧光探针产生足够的光通量，则透镜和反射镜不是构建用于PCR的荧光检测器的必要部件。漫射表面的封围件内的辐射交换限定了检测器上的入射通量的量。
如图30中所示，检测腔室内的任意两个表面之间的光交换由以下一般方程控制：
Figure BDA0003189920900000541
其中：
L＝两个表面之间的距离
α＝两个表面之间的材料的吸收系数*
θ＝光线在表面上的入射角度
*值α是由颗粒和其他污染物对材料的吸收以及由荧光团贡献的吸收的总和。
对于某些几何形状比如球形而言，该方程的估值是简化的。然而，该方程的求解在应用于PCR检测腔室内可能存在的复杂几何形状时变得相当复杂。代替数值估值地，可以使用非顺序射线追踪程序(商业上可获得的非顺序射线追踪程序，比如TracePro、ASAP、FRED、LightTools、SPEOS、ZEMAX等)通过建模来计算腔室内任何给定体积点的入射通量，其中，诸如特定腔室几何形状和激发光分布强度的参数可以被准确地建模。在这种模型中，将适当的吸收区域、腔室壁的反射率和所有表面的漫反射或镜面反射特性以及散射特性包括在内也很重要。
图31示出了对示例性检测腔室900的非连续射线轨迹建模，其中，该腔室被示出为灰色缸体，光发射装置为白色矩形901，并且检测光电二极管为阴影矩形902。灰色实线是在腔室内散射和反射的单独的射线。在此射线追踪示例中，缸体的内部表面具有高反射性。从各表面散射的漫射朗伯体将激发光分布在整个腔室中，从而为样品提供均匀的刺激。
腔室壁的反射率用于回收发射光，因此产生了额外的乘积因子，由此在检测器上整合了比一般方程将计算出的发射光多的发射光。因此，腔室的壁的材料和反射率对由检测器收集的光信号功率起着重要作用。乘积因子遵循以下表达式：
Figure BDA0003189920900000551
其中：
ρw＝内部表面的反射率
ρi＝吸收表面的反射率
fi＝吸收表面积相对于总面积的比例
为了使该乘积因子最大化，腔室表面的反射率应与所使用的材料所允许的反射率一样高(例如，通过使用具有光滑的、有反射性的饰面并且在所关注的波长范围[对于荧光检测实施方式，该波长范围通常约为400nm至600nm]内具有至少0.1、或更优选地0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或更高的反照率的表面)，并且使非检测器吸收区域最小化，其中，非检测器吸收区域构成优选的封围件的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。此外，优选的是，增加腔室的光检测器表面积与非检测器部分的表面积的比率，在一些实施方式中，以5％、10％、15％、20％、35％、50％、75％、90％、95％或更高的比率增加腔室的光检测器表面积与非检测器部分的表面积的比率。随着三维几何形状的体积减小，表面积与体积的比率将趋于增加(该比率在形状以比体积增加更快的速度经历至少一个方面的扁平化的情况下也可能增加)。此外，任何检测腔室的表面积与体积的比率将与三个正交维度成比例地增加，其中，在任何特定体积下，三维球体具有最小表面积与体积之比。
在一些实施方式中，优选的是，以所使用的特定光电检测器的灵敏度阈值为界，相对于检测腔室的体积增加光电检测器的表面积，使得到达光电二极管的光的通量足以达到从光电二极管感应出电流所必需的光的最小阈值，该最小阈值能够与暗电流和电噪声区分开来并且大于光电流线性度的下限。在一些实施方式中，光电二极管使用齐纳二极管、雪崩二极管或变容二极管。在一些实施方式中，光电二极管使用反向偏置、正向偏置或零偏置的电流流。在一些实施方式中，感应出可检测的电流所需的光的最小阈值(即，噪声等效功率)大于0.1pW/√Hz、0.5pW/√Hz、1pW/√Hz、5pW/√Hz、10pW/√Hz、15pW/√Hz、20pW/√Hz、25pW/√Hz、30pW/√Hz或更多。
如本文中别处所讨论的，根据所关注的优化参数，可以通过增加信号、减少噪声或通过两者来提高信噪比。深色(例如，黑色)的表面产生较低的噪声基底，并且只要使用光滑的表面材料(在设计中限制光挡板以及将粗糙度降低至3.2μm、1.6μm、0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm、0.025μm或更小)，则利用深色的表面可以实现有效的检测。具有增加的反照率的白色的、未染色的或其他反射材料产生更多信号，并且这些反射材料由于如本文中别处所讨论的适当的信号与噪声差异而也是有效的封围件材料，其中，较浅颜色的、更具反射性的材料对于大多数构型而言相比于深色表面通常表现出净2倍至2.5倍的提高的信噪比。
在PCR荧光检测器中，出于实际目的，从荧光团发射的光沿随机方向发射，因此发射击中检测器的可能性与从荧光团至检测器的距离的平方成正比。如此，腔室体积也应尽可能合理地小，以使内表面积最小化、使吸收最小化、使相对于检测器的平均距离减少、并因此增加可以最终到达检测器的通量。对于具有小体积(在一些实施方式中，小于500μL、250μL、150μL、100μL、50μL、40μL、30μL、25μL、20μL、15μL、10μL、7.5μL、5μL、1μL或更小)以及高反射率(在一些实施方式中，在所关注的波长范围[对于荧光检测实施方式，该波长范围通常约为400nm至600nm]内具有至少0.1、或更优选地0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或更高的反照率范围)的腔室，上述乘数效应会很显著，从而实现检测器上的光信号的2倍至10倍、或甚至更多倍的增加。
虽然在实践中，复杂系统通常使用上述非顺序射线追踪的方法建模，但是由PCR荧光检测器对来自荧光团的光的整合也可以被数值评估。检测器平面处的光的强度遵循以下一般形式，并且检测器腔室可以在不使用透镜或反射镜的情况下设计，假设检测器处的辐照度在光电二极管中产生足够的电流，使得因检测器上的辐照度而产生的光子感应电流的部分与暗电流(即，在没有光的情况下从光检测器产生的基线电流、例如由热源产生的基线电流)相比足够高(例如，至少1.5:1、但更优选地2:1、3:1、5:1、10:1、50:1、100:1、250:1、500:1、1000:1或更大)。具体地，检测器处的光谱辐照度可以计算如下：
Figure BDA0003189920900000571
其中：
Ed＝检测器处的光谱辐照度
Ie＝荧光团的光激发强度
ρ＝荧光团密度
Φ＝量子产率
α＝激发光的吸光度
r＝从检测器至荧光团的距离
Θ＝检测器的半角视场
由于系统的光学效率(包括激发光到样品的传输以及从荧光团发出的光的收集效率两者)可以计算(如下所述)，并且已经通过经由射线追踪的数值计算或以实验收集的方式确定了光谱辐照度值，因此检测器腔室的参数、荧光团类型和浓度可以在无需过多实验的情况下容易地改变，以将系统的光谱辐照度增加到至少达到光电流与暗电流之间的最小功能信噪比(如上所述)的水平。
检测器中的发射信号光的电转换可以通过光谱响应度和检测器材料的重叠积分计算，其中，荧光团的发射光谱荧光团的发射光谱的波长范围内积分。还包括由于带通、长通或短通或吸收过滤器或位于检测器前方的其他光学和非光学部件而造成的损耗或低效。流出检测器的信号电流可以根据下述等式使用检测器的面积和关于波长相关函数的积分来计算：
Figure BDA0003189920900000572
其中：
Is＝由于信号而流出检测器的电流
Ad＝检测器面积
R＝检测器材料的响应度
Figure BDA0003189920900000581
＝荧光团的正常化发射光谱
L＝光损耗分数
Ed＝检测器处的光谱辐照度
光学系统比如那些在典型的PCR荧光检测系统中起作用的系统由于容纳部件所需的延长的光学路径长度以及由于使用校准的检测模式而通常需要高光学效率。在这些系统中包含的准直透镜、二向色镜以及对各部件的精确对准通常实现了与激发光的传输相关的大于75％至80％的光学效率(可能具有大于90％至95％的效率)和介于0.3％与3％之间的收集效率(按如下所述计算)。使用透镜的系统中的光学效率可以通过以下公式计算：
Figure BDA0003189920900000582
其中：
η＝光学效率
n＝折射率
θ＝进入透镜的最大半角
相比之下，本公开的某些实施方式不包括透镜，由此使光学路径缩短至小于2cm、但更优选地小于1.5cm、1cm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.25mm、0.15mm、0.10mm、0.05mm、0.01mm或更小，并且由此具有随着距离变短而增加辐照度的效果，如上所述。
在一些实施方式中，可以使用光管、纤维束或其他光传播或光累积材料来增加样品腔室与检测器和/或发射器之间的物理距离。在这些实施方式中，物理间隔可以增加超过数厘米。在一些实施方式中，可以关注用以使光移动的光管、纤维束、棱镜或其他透明材料的实现，以帮助机械和/或电气封装。
在特定实施方式中，光源与扩增/检测腔室之间的最大距离(例如，光源与腔室中距光源最远的位置之间的距离)小于2cm、但更优选地小于1.5cm、1cm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.25mm、0.15mm、0.10mm、0.05mm、0.01mm。
这些实施方式能够在PCR期间利用在光学效率方面比典型的PCR荧光检测系统低大约100倍的系统可靠地检测荧光。在一个实施方式中，光源是下述LED：该LED在3.4V下使用230mA并且具有50％的效率，由此得到约391mW的激发光功率。在该实施方式中，根据检测腔室的设计(如上所述)，来自检测器的电流可以在约3mA至约30mA的范围内，并且假定硅光电二极管在400nm至600nm范围内的响应度为约0.3A/W，则大约10μW至100μW的入射功率到达光电二极管检测器。光学效率然后可以作为输入与输出功率的比率使用以下公式来计算：
Figure BDA0003189920900000591
其中：
η＝光学效率
ρout＝光电二极管的功率输出
ρin＝光源的功率输出
该实施方式中，系统的光学效率为约0.0025％至约0.025％、比典型的PCR荧光检测系统小两个对数级，但是如下所讨论的，在一些实施方式中，由于所使用的测量信号、噪声的方法以及校准途径，这种较低的光学效率是允许的。此类系统中光学效率低下的根源包括：未转化为光能的电能、未照射反应样品的光、关于发射过滤器的能量损耗(经由吸收或反射)、关于反应流体的吸收以及反应容器壁和封围件中的其他暴露元件的损失、到达反应流体但未到达光电检测器的视场的光、由覆盖检测器的过滤器吸收的光以及关于其他光学和非光学部件的损失。
优选地是生产一种低成本的检测器，并且有助于实现这一点的一个设计考虑是使部件的数目和单独的PCB板的数目最小化。在典型的PCR荧光检测设计中，包含发射器的照射侧与包含光电检测器的检测侧是相反的、正交的或是以其他方式分开的。这种形式减轻了“串扰”或光耦合，在“串扰”或光耦合的情况下，来自发射光源的光通过不包含吸收和传送光的荧光目标的光学路径而传输至光电检测器。然而，根据该设计构型，使部件分开也增加了成本，因为针对光学部件和相关联的PCB或光管需要两个分开的位置。
关于该设计的改进方案是通过利用不透明的屏障比如包覆模制件、隔离件或不透明聚合物或胶水来为各部件提供防护而使发射器和检测器部件以紧密靠近的方式可能地定位在相同PCB上或定位在集成的封装件内并且减轻串扰。串扰也可能通过穿过PCB本身发生的光传输而发生，因此，在一个实施方式中，光源(例如，LED)和光电检测器(例如，光电二极管)部件包含金属的或其他不透明的背衬，使得这些电子部件的最接近于PCB的区域无法穿过玻璃纤维PCB的纤维或其他半透明基板传输光。在一些实施方式中，检测系统仅具有一个PCB。在一些实施方式中，检测电路中的所有检测电路都存在于单个PCB中。在其他实施方式中，包含光源的PCB与包含光电检测器的PCB是同一PCB，并且这些元件在用于对PCR样品的直接照射和检测时位于单个PCB中。在其他实施方式中，包含检测电路的PCB位于与检测环境热耦合的环境中。
在一些实施方式中，光管、纤维束、棱镜、其组合或其他透射材料用于从源头注射激发光、和/或收集发射光、并将发射光移动至不邻近于检测腔室的检测器、并且可以在功能上代替透镜的作用。这些构型虽然增加了成本和复杂性，但是可以有利于对较大的检测部件或发射源的封装，以利于较小的检测腔室或者增加检测器的有效收集面积。例如，可以使用渐缩式光管，由此该部件的较大侧部安置成与检测腔室接近或接触。该渐缩式装置的窄侧部将与检测器靠近或接触，因此用作光累积器或透镜。以这种方式，管将比没有管的检测器收集更大的区域，从而增大信号光收集区域，同时保持检测器上较低的电噪声。
用于PCR荧光检测的典型光学系统使用辐射测量学来校准光学系统的部件，使得校正因子可以应用于各个部件，并且可以在绝对意义上计算发射光的量。如果没有这种校准，则不可能准确地确定荧光信号，因为发射光源中未经考虑和未经计算的变化会产生相当大的定量偏差，这在没有校准的情况下可能导致信号强度发生变化，这会导致对被测信号的错误解释。
典型的光学系统中的可变性来源可能随着时间的推移发生在单独的部件之间、从单元至单元、以及发生在同一单元中。这些可变性来源包括：光发射器孔口尺寸；过滤器安置的角度、距离和位置；光检测器的角度、距离和位置；过滤器部件和光学路径中的其他部件的特性(厚度、吸收、均匀性)；光源的量子效率；光强度；光谱分布；发射器与检测器之间串扰的程度和特性；由于灰尘、碎屑、湿度、光洁度特性导致的光学路径衰减；或其他制造公差。
这些因素的组合迫使成本增加，这是因为这些因素的缓解趋于借助这样的制造技术和材料：这些制造技术和材料使可变性最小化并需要更严格的公差，并且需要逐个单元计的辐射测量校准序列，该辐射测量校准序列在成本中所占的百分比随着制造量的增加和非逐个单元计的成本的下降而越来越大。
此外，即使在初始工厂辐射测量校准完成的情况下，光学系统也可能需要于预期使用的位点处在接近使用时间时定期重新校准，这是因为多种因素可能随着时间的推移或随着局部环境变化而导致系统失去校准。这些因素包括：过滤器、染料和材料随时间的劣化；透镜或其他光学路径部件的灰尘和碎屑、湿度和云纹；局部环境温度；由于老化而导致的发射源的波长变化；以及光学对准劣化。
潜在地重新校准光学系统的需要增加了成本、需要熟练工人得到培训并且是有空的、可能需要专门的工具以及需要将校准材料保留在手边，这些校准材料本身可能会过期或损坏。
本公开的实施方式通过采用没有固定基线的相对测量来消除对校准的需要。因此，本文中描述的实施方式能够使用便宜的部件(因为便宜的部件会具有相对高的可变性并且避免了对严格公差的需要)。具体地，光源可以是在对准、输出光特性、颜色和强度方面具有1％、2％、3％、5％、7％、10％、15％、20％或更大的可变性的LED。此外，光学对准公差比如发射器与检测器的对准变为0.5°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、12°、15°、20°或更多度，而非小于1,000微弧度，1,000微弧度是当前PCR机器的检测设计中的精密光学系统的特点。类似地，发射器和检测器的可接受平移公差在100微米的数量级上是允许的，100μm、150μm、200μm、500μm、750μm或更大，是允许的，而非单位或两位数的微米，单位或两位数的微米是当前PCR机器中使用的检测系统的构型的特点。
如本文中所使用的，术语“LED”是指借助于在施加电压时产生光的半导体二极管操作的任何光源，无论该光是被直接采用、是通过介质、经由光管道、光纤采用还是通过次级元件重新发射。
在一些实施方式中，通过消除对单元特定的辐射测量校准的需要，检测系统能够通过执行本文中别处描述的分析的方法而使用没有固定基线的相对测量。这些分析可以通过使用截止过滤器而在一个或更多个通道上同时进行。这些过滤器可以是短通式(允许低于某个截止点的波长被传输)、长通式(允许高于某个截止点的波长被传输)或带通式(仅允许处于某个频率范围内的波长被传输)。
在一些实施方式中，过滤器可以是吸收过滤器，其中，在一些实施方式中，染料通过对进行光学部件包覆模制而被结合到塑料、玻璃、聚合物或其他材料中。在其他实施方式中，过滤器可以是薄膜过滤器。这些薄膜过滤器可以是气相沉积的、可以是使用电子束、蒸发、溅射、浸渍、喷涂或其他涂覆方法得到的。膜可以是单组分的或是多组分的。在一些实施方式中，过滤器可以作为涂层直接沉积到检测器上。在其他实施方式中，在一个或更多个发射器或检测器具有单独的过滤器的构型中、或者于在一个或更多个检测器或发射器之间或之中共享一个或更多个过滤器的构型中、或者在吸收染料或薄涂层或其他过滤器类型结合到具有与其在PCB上的安置相对应的区域的单个整体式过滤器中的构型中，涂层可以置于玻璃或聚合物过滤器上。该整体式过滤器还可以用作端板231。在一些实施方式中，过滤器可以定位为一个或更多个集成单元的一部分，所述一个或更多个集成单元还可以包含发射器和检测器。
在一些实施方式中，发射器过滤器的不同波长可以组合使用，以利用下述方式执行检测：使得入射光波长的集合或总和提供用于对复用的分析物的扩增进行区分的不同发射分布。在一些实施方式中，一个或更多个光电二极管可以用于监测一个或更多个发射源的亮度以允许补偿光强度的变化，该光强度的变化包括亮度的变化并且包括因温度的波动而引起的以其他方式不受控制或未被补偿的变化。这种发射器源光电检测器239的示例在图27中示出。此外，包括对发射源的亮度进行监测的光电二极管还可以用于通过提供正常化的背景来提高准确度，这又会允许更高的信噪比和改善的检测灵敏度。
通常优选的是在光发射器上使用短通过滤器，因为这些过滤器通常表现出比吸收过滤器更尖锐的“截止点”。这种短通过滤器可以具有小至1nm、或小于5nm、10nm、20nm、50nm、75nm或100nm的截止范围。对于典型的薄膜短通过滤器，来自光带的光学拒波(以通过高于或低于截止点的光差的对数表示)可能是5个对数级。
设计低成本光学系统、特别是设计没有辐射测量校准的光学系统的挑战之一在于，装置或环境的热波动会对区分信号与噪声的能力产生很大的不利影响。光电二极管作为光检测器的使用因光电二极管的工作模式而变得复杂，光电二极管依赖于内部光电效应。入射光子产生电子-空穴对并产生各向异性电流，该各向异性电流可以作为电信号而被检测。在实践中，基线电流在没有光的情况下产生(“暗电流”)，并且从光电二极管观察到的电流是暗电流和光电流的总和。暗电流可以大幅变化、特别是响应于温度的变化(例如因光源、电源或检测器电路部件的自热而产生的温度的变化)而大幅变化。如此，控制温度或校准以及补偿和校正热环境对于使用光电二极管进行精确的光测量而言至关重要。
如前所述，PCR荧光检测器的光学回路通常被辐射测量校准，从而导致增加的成本和对重新校准的潜在需要。本文中描述的实施方式通过方法的组合而消除了对这些的需要。首先，如果环境实质上是等温的，则减少或消除了补偿热波动的需要。为了实现这一点，该装置在检测器的环境与热稳定反应腔室之间(例如，在第二端部152与检测控制器234之间)使用共同的散热件。这种用作散热带的共同的散热件将PCB和光学部件保持至3℃、2℃、1℃、0.5℃、0.3℃或0.1℃内的范围并且可以包括由下述各者制造的元件：铝、铜、钢、贵金属或其他金属(或其他非金属热导体，比如金刚石、立方砷化硼、碳纳米管、石墨烯)、热管道、液体传导件或任何其他具有高传导率的材料，该高传导率优选地超过50W·m-1·K-1，更优选地超过100W·m-1·K-1、150W·m-1·K-1、200W·m-1·K-1、250W·m-1·K-1、300W·m-1·K-1或更高。
光源的自热可以通过两种方式解决。首先，光源可以在反应的检测阶段期间保持开启，从而允许光源与局部环境达到热平衡。替代性地，二极管可以被快速脉冲调制，以允许对由光源引起的自热进行冷却以返回至基线并且防止热量的积聚使装置运行期间温度升高。在该实施方式中可以使用的光源启用的特定的最大分数时间可以计算为：
Figure BDA0003189920900000631
其中：
τmax＝最大光源启用
ρ＝功率
φ＝量子效率
U＝组件的热传递系数
A＝热源的表面积
ΔT＝温度增量
在一些实施方式中，光源被脉冲调制成小于1ms、但优选地小于750μs、500μs、400μs、300μs、200μs、100μs、50μs、40μs、25μs、15μs、10μs、5μs、3μs或1μs。
另一改进方案是使用电流源电源进行荧光检测。由于光源(在一个实施方式中为LED)的输出对电流而非对电压最敏感，因此使用电流源电源在发射器的通量中产生较小幅度的可变性。类似地，响应于温度或电流而改变其行为的其他电子部件在于操作过程中温度发生漂移或改变的环境中可能表现出不可接受的高可变性。在一个实施方式中，使用低温度系数电阻器和其他类似电子部件缓解了这一问题，低温度系数电阻器和其他类似电子部件在其工作温度范围内具有小于5％、但更优选地4％、3％、2％、1％、0.5％或更小的可变性。在另一实施方式中，电流源可以位于通过使用共同的散热件或散热带(例如，在第二端部152与控制器195的部件之间使用共同的散热件或散热带)热耦合至等温环境的区域内。以此方式，使电流源的热变化最小化，从而允许使用由于其增加的可变性而具有较低成本、具有的制造公差大于0.5％、1％、2％、3％、5％、7％、10％、15％、20％或更多的电阻器和其他电子部件。
活塞构型
本文中公开的实施方式可以包括活塞构型的变化。在某些实施方式中，活塞具有圆形的横截面，这允许腔室以最小摩擦朝径向取向旋转。活塞或腔室还可以包含小肋部或突起以使接触面积最小化或使活塞居中。在某些情况下，这种旋转不仅有助于线性运动，而且还有助于反应流体混合。在一些实施方式中，螺旋槽可以有助于这种混合运动，或者位于两个活塞端部之间的毛细管可以包括斜面以引起径向运动。混合还可以通过结合有下述喷嘴而被改善：该喷嘴用以在流体移动时将流体引导至腔室的端部，从而引起有助于混合的湍流，或者，通道本身可以包括非线性部分以引起涡旋脱落或其他湍流模式。由于在大多数实施方式中使用相对较小的体积，因此所施加的热引起布朗运动(并且在某些情况下引起瞬态相变)，这也有利于混合效率。在某些情况下，这些技术的组合不仅具有附加效应(即，协同效应)，而且可以发生在装置的进入模块、扩增模块或检测模块中。
在一些实施方式中，活塞可以是单个活塞。在其他实施方式中，活塞可以由响应于磁场的颗粒比如铁、镍、钴、稀土金属、此类的合金或其他铁磁材料构成。以此方式，在磁场的影响下，颗粒可以优先迁移至腔室的一侧，从而使一部分反应流体移位至腔室的相反端，在该相反端存在热梯度。然后磁场可以反转，从而引起颗粒的往复运动并且又引起反应流体的往复运动，进而实现可以重复的热循环。在一些实施方式中，颗粒优先被涂覆以防止与反应流体直接接触(这又可能抑制PCR)。涂层可以是聚合物比如迭尔林(Delrin)或金属比如铬。在一些实施方式中，还可以使用由贵金属形成的顺磁性或反磁性颗粒或低反应性组合物以在不对扩增化学产生不利影响的情况下消除对涂层的需要。
在某些实施方式中，活塞可以是多个部段。活塞部段可以一致地操作，从而一起移动到同一极点，或者活塞部段可以被操作成使得活塞部段沿相反的方向移动，从而在循环的一个(较高温度)阶段期间于腔室的近似中心会合(join)并且在循环的第二(较低温度)阶段期间返回至远端的极点。该实施方式可以允许具有增加的加热效率的运动模式，使得待被加热的流体可以经历的用于热传递的表面积是其中整体的流体从一个较高温度的极点移动至另一较低温度的极点的活塞运动模式的两倍。实现类似效果的替代性实施方式是修改活塞(例如，通过增加长度、降低热传导率或改变加热参数修改活塞)，使得腔室的中心处的温度对应于期望的较低温度设定点，并且极点对应于较高的温度设定点。在其他实施方式中，热区中的一个热区可以对应于第三温度区，例如以促进经典的三温度PCR(例如，区一为95℃，区二为55℃，并且区三为65℃)。当活塞部段往复运动时，极点作为较高温度区工作，并且中心作为较低温度区工作，从而在活塞周围或穿过各区之间的一个或更多个毛细管交换一部分流体。
在一些实施方式中，活塞具有椭圆形、多边形或抵抗旋转或强制定向的任何其他二维形状的横截面(参见Zhang,Q.等人(2015).Bioinspired engineering of honeycombstructure(蜂窝状结构的仿生工程)Progress in Materials Science(材料科学进展)74,332–400，其通过参引并入本文中)。在一些实施方式中，这种构型例如可以在下述情况中使用：这些情况包括在使用并行(paraplexing)以及活塞取向或旋转被关于相邻的其他活塞考虑的时候。在一些实施方式中，磁场的强度或磁性元件的位置被修改，以减少摩擦并且允许活塞在并行布置结构中自由移动。例如，在磁性元件中需要较弱磁场的情况下，可以使用较低成本的磁体，但并行磁体的累积场强度足以允许有效的活塞运动。在其他情况下，磁性元件可以是交错的(通过在二维并行填装布置内的位置或通过沿着活塞的轴线的位置而是交错的)，以允许一个或更多个活塞独立于一个或更多个其他活塞而操作。在一些特定实施方式中，活塞横截面是六边形、矩形(包括正方形、线性构型以及此类形状的规则和不规则矩阵)、圆形或椭圆形、或三角形。相邻的腔室可以以包括偏移、或方形填装、成角度、偏移或支撑填装的多种方式填装。
“并行的(paraplexing)”或“并行(paraplex)”(或相关术语)当在本文中使用时是指同时进行多个反应，所述多个反应对于至少一部分反应而言被分到不同的物理区域中。在一些实施方式中，该设备可以测试单独的、分开的样本。在其他实施方式中，该装置可以测试合并的样本。在其他实施方式中，该设备可以测试多个不同的样本。在各种实施方式中，该设备可以测试单独的样本、合并的样本或不同的样本的组合。在一些实施方式中，多个腔室可以各自包含一个或更多个活塞，所述一个或更多个活塞中的所有活塞可以由第一磁性线圈共同驱动。在其他实施方式中，多个腔室可以包含一个或更多个活塞，所述一个或更多个活塞中的所有活塞可以由多于一个的磁性线圈共同驱动，所述多于一个的磁性线圈包括两个、三个、四个或五个或更多个磁性线圈。
在其他实施方式中，多个腔室可以各自包含一个或更多个活塞和第一磁性线圈，其中，所述线圈驱动特定腔室中的活塞。在另外的实施方式中，多个腔室可以各自包含一个或更多个活塞和第一磁性线圈以及第二磁性线圈或更多个磁性线圈，其中，所述线圈驱动特定腔室中的活塞。在一些实施方式中，可以在并行的腔室中复制反应条件，以提供冗余度或额外的灵敏度或特异性属性。
参照图32，示出了可以用于并行的各种腔室填装构型的示意性端视图，各种腔室填装构型包括蜂窝状构型601、矩形构型602、三角形构型603、方形填装筒形构型604和六边形填装筒形构型605。在示例性实施方式中，活塞可以布置在以各种构型示出的每个腔室中。图33图示了包括多个腔室610和活塞615的六边形填装筒形构型605的示意性立体图。如图33中所示，活塞615设置在每个腔室610中。并行(paraplexing)与多路(multiplexing)形成对比，多路发生在多个反应可以在同一物理区域或反应中运行时。在一些实施方式中，反应既可以是多路的又可以是并行的，从而允许多个反应同时发生在多个隔室中(在一些实施方式中另外的改进方案包括使用嵌套式PCR来改善反应的特异性)。这可以通过多种方法来实现，多种方法包括将反应化学物质完全分离、或者通过将反应化学物质部分分离、以及在一些实施方式中允许其中分析物不因非特异性引物而特异性扩增的非特异性预扩增(或第一扩增)步骤以及其中特异性引物更特异性地扩增或检测所关注的目标的随后步骤或多个步骤。
在一些实施方式中，反应腔室中存在的空气的百分比可以为25％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。当反应腔室加热时，根据理想气体定律，空气中的氧气和氮气的一部分将溶解在反应混合物的液相中，但大部分仍保持为气相。在空气百分比低于10％的情况下，将反应容纳物从室温加热至95℃至99℃的温度范围会导致压力增加至大约3个大气压。类似地，在空气百分比小于5％的情况下，将反应容纳物加热至95℃会导致压力增加至大约5个大气压。建造用以承受更高压力的压力容器会带来额外的成本和材料，因此在一些实施方式中，使容器压力保持在小于5巴、4巴、3巴、2巴或1.5巴，或者采用排气特征以允许过量空气逸出。
附加的示例性实施方式
反应腔室插入构型
现在返回参照图6至图9，另一的实施方式包括进入模块350和反应腔室插入件300，以将活塞和缸体材料与反应流体物理地分离。在该实施方式中，两个挠性的(例如，聚合物的)片材301和302(或折叠到自身上的单个片材)可以用于形成多个腔室。在图6中，片材301和302以俯视图构型被示出为形成第一腔室311、第二腔室312和第三腔室313。应当理解，片材301和302在膨胀成图6中所示的构型之前可以构造得相对平坦。在特定实施方式中，腔室311、312和313可以通过使用超声焊接或热焊接、粘合剂、外部夹紧(或适合承受操作装置的压力和温度的任何其他机械或化学方法)形成密封，以形成可以用作用于反应流体的往复运动的流体腔室的潜在空间。在所示实施方式中，腔室312包括PCR试剂322，并且腔室313可以用作溢流腔室(例如，以接纳来自腔室311和312的过量空气或流体溢流)。
图6图示了反应腔室插入件300和进入模块350在使用前的俯视图。进入模块还包括将流体352(例如稀释物、溶解物或其他样品制备流体)密封的隔膜351以及样品端口355。
图7图示了构造成将样品装载于进入模块350的样品端口355中的样品装载装置400的侧视图。样品装载装置400包括构造成吸收样品的吸收性材料410(例如，海绵)。在特定实施方式中，样品装载装置400可以暴露于样品(例如，在口腔中拭抹或以其他方式安置成与样品接触)，使得吸收性材料410可以吸收足以改变指示器420的状态的体积的样品。在特定实施方式中，当已经由样品装载装置400获得足够体积的样品时，指示器420可以改变颜色或以其他方式改变状态。样品装载装置400包括具有孔口435的柳叶刀430，该柳叶刀430允许来自吸收性材料410的样品进入柳叶刀430并且接触指示器420。
在样品装载装置400装载有样品之后，样品装载装置400可以插入到进入模块350的样品端口355中。进入模块350还包括肩部357，肩部357在样品装载装置400插入到进入模块350中时压缩吸收性材料410并从吸收性材料410中提取样品。此外，肩部357在样品装载装置400插入于样品端口355中时阻止样品装载装置400的前进。进入模块350可选地还包括锁定凸部359，锁定凸部359接合样品装载装置400中的凹口459，以将样品装载装置400保持在进入模块350内。
柳叶刀430构造成当样品装载装置400在插入到样品端口355中时穿透隔膜351。通过破坏隔膜351，来自样品装载装置400的样品可以与稀释流体352混合。样品和流体352的组合由可选的过滤器358过滤并且在样品装载装置完全插入到进入模块350中时被导向至混合器354。
图8和图9图示了插入到具有第一端部451和第二端部452的壳体450中的反应腔室插入件300的侧视图和仰视图。设置在壳体450内的活塞460构造成在靠近于第一端部451的第一位置与靠近于第二端部452的第二位置之间移动，以使反应流体在反应腔室插入件300内移动。
在某些实施方式中，反应腔室插入件300包含与活塞460的两个侧部对应的两个较大直径区域以及将这两个较大直径区域连接并且在远端并在近端延伸的通道，这些通道优选地具有较小直径以使死区最小化。在所示实施方式中，近端通道331连接至进入模块350，并且远端通道332(如果存在)将溢流/气体接纳腔室313连接至腔室312。中间通道333将腔室311和腔室312连接。
在一些实施方式中，样品装载装置400插入到进入模块350中，以将样品以上述方式引入至反应腔室插入件300。在样品已被装载到反应腔室插入件300中之后，通道331在密封位置341处被密封并且通道332在密封位置342处被密封。
壳体450可以联接至基部470，基部470具有热源471和472以及照射源476、检测器473和致动器474和475。在其他实施方式中，基部470中可以结合有单个热源和致动器。致动器474和475可以用于引导活塞460在第一位置与第二位置之间往返，并且热源471和472可以用于加热反应腔室插入件300中的反应流体，以便对反应腔室插入件300的容纳物执行PCR或其他扩增技术。
壳体450可以包括反射表面455，使得检测器473可以检测来自反应腔室插入件300的响应(例如检测响应于由照射源476对反应腔室插入件300的照射的荧光信号)。在某些实施方式中，壳体450可以由联接在一起的两个或更多个件形成。在特定实施方式中，壳体450可以形成为使得第一端部451和第二端部452是分离的部件的一部分，这些分离的部件具有形成壳体的中心部分的相互交叉的部分，这些分离的部件包括用以容纳中间通道333的间隙或槽口。在某些实施方式中，腔室313可以形成为第三较大直径(或体积)区域，腔室313(作为插入件的一部分或与插入件连续地)被结合，以用作在样品或裂解液体或过量的这些液体进入之前来自通道332的任何气体的接纳储存部。这可以使反应流体的液气比最大化并且降低填装期间的背压。这可以进一步提供更快的热传递，避免气体优于液体的运动偏好动力学，以及使反应分析物最大化，这可以提高灵敏度并减少反应时间。在特定实施方式中，第三腔室313可以由不同材料形成，第三腔室313可以被密封(从而在存在或不存在指示填装状态的传感器的情况下适应增加的压力)或者包含真空、或者与大气压力直接或间接连通，从而包括设计成容纳气体和液体的多孔的或吸收性的填装部或腔室。
对反应腔室插入件300的在近端和在远端(例如，在密封位置341和342处)的密封可以以多种方式完成，多种方式包括热的、超声的、基于阀的、化学的、相变的或者通过由对于从业者而言将明显的任何数目的方法所产生的机械压力。这种密封发生在装置操作期间，使得在反应腔室插入件300的边界内形成封闭的反应腔室，该封闭的反应腔室包含反应流体并且允许活塞460的压缩压力实现反应流体在活塞460的极点之间的相反运动，该封闭的反应腔室通过通道将插入件的较大直径部段接合。
反应腔室插入件300的使用可以允许对于活塞460和缸体或壳体450以及其他部件的更宽容的设计公差。当考虑活塞设计时，通常期望减小由活塞在缸体或壳体内的移动所限制的死区，以便使反应流体在期望的温度范围之间进行有效的热循环。然而，随着公差变得更严格，活塞的运动可能会受到摩擦(直接的摩擦或者由于反应、小粗糙部、漂浮的颗粒或粘附的碎屑导致的摩擦)的阻碍。这种冲击(impingement)也受到反应内的动力学影响，使得各部件的粘度或不同的热膨胀可能导致妨碍。
因此，可以有益的是，收紧公差以使死区最小化，但保持防止冲击的设计余量。在一些实施方式中，考虑到在使用包括磁铁、金属和聚合物的不同材料的情况下活塞与缸体之间的热膨胀差异，可以优选的是，将公差保持成使得活塞与缸体之间的空间不超过10密耳(千英寸)，但最优选地是保持7密耳、5密耳、3密耳、2密耳或1密耳的公差。包含插入件将这两个相反的参数(parameter)断开耦合，从而通过允许活塞与腔室之间的更宽松的公差(这也降低制造成本)来促进活塞的移动，同时结果不会使死区增加，因为反应流体包含在插入件内，并且死区不随活塞-缸体公差变化而变化。
此外，插入件可以包含冻干反应组分，该冻干反应组分应优选地是无污染的，以使将核酸酶或环境中存在的核酸包括在内的风险最小化，将核酸酶或环境中存在的核酸包括在内可能产生虚假结果。插入件的使用将上述(和其他)严格的制造要求限制于进入模块和插入件，从而允许灵活、便宜、快速且专业化地生产其他装置部件。
在特定构型中，死区将不超过总反应体积的35％，或者特别地，死区将不超过总反应体积的25％，或者更特别地，死区将不超过总反应体积的20％，或者更特别地，死区将不超过总反应体积的15％，或者甚至更特别地，死区将不超过总反应体积的10％，或者最特别地，死区将不超过总反应体积的5％。
非活塞构型
现在参照图10至图11，另一实施方式是将装置布置成使得消除对活塞的需要。这可以通过下述方式实现：将两个温度区域搭配在同一平面上，由此杠杆或流体柱的液压作用或者热气动膨胀或相变(闪蒸)(flashboil)气体膨胀直接地(通过挠性隔膜)或间接地经由机械桥或盘(机械桥或盘可以可选地缩小接触面积以获得机械压力优势)用于影响流体从较高温度侧部向较低温度侧部的运动。
在构造没有往复活塞的装置时，可以适合于形成挠性区域的材料包括聚合物比如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。这些聚合物可以通过使用负模模制(negative molding)过程形成期望的形状，由此可以首先形成可溶解的模具例如聚醋酸乙烯酯(PVA)。然后可以将PDMS倾倒在PVA形式上并且允许PDMS固化(根据需要部分固化或完全固化)。然后可以通过可选地借助搅拌、热、气压或超声辅助地溶解在含水溶液比如水中来去除PVA。该特定实施方式允许形成与扩增化学比如PCR相兼容的挠性形式，并且消除了对以后可能发生泄漏的密封件或垫圈的需求。
PDMS和其他聚合物也可以被部分固化(或者其表面可以在借助于静电放电或化学再活化而完全固化后呈现反应性)，并通过调节溶液中聚合物的温度和浓度而彼此退火。例如，PDMS可以在较高温度(例如大于约150℃)下被快速固化(在某些情况下，少于约10分钟)，或者如果期望更长的工作时间，则PDMS可以更缓慢地冷却。
在图10至图11中所示的具体实施方式中，装置500包括用于引入样品的输入端口501。装置500还包括第一热气动腔室511和第二热气动腔室512以及照射模块525和检测模块515。在所图示的实施方式中，第一热气动腔室511经由第一通道531联接至第一膨胀构件521。类似地，第二热气动腔室512经由第二通道532联接至第二膨胀构件522。第一膨胀构件521和第二膨胀构件522可以由在膨胀构件的容纳物体积增加时可以变形(例如，从相对平坦的构型变形至弯曲构型)的挠性材料形成。
第一热气动腔室511和第二热气动腔室512可以各自包含在被加热时膨胀的可膨胀流体(例如，气体或液体)。当第一热气动腔室511的容纳物被加热时，容纳物流动穿过第一通道531并进入第一膨胀构件521，从而导致第一膨胀构件522膨胀。类似地，第二热气动腔室512的容纳物可被加热，以经由通道532使第二膨胀构件522膨胀。
在操作期间，样品550可以从输入端口501穿过输入通道502流动至第一膨胀构件521下方的区域541，该区域541可以包括微丸527，微丸527包括适合于PCR或其他扩增技术的裂解试剂。当第一膨胀构件521膨胀(例如通过加热第一热气动腔室511的容纳物而膨胀)时，样品550可以从区域541经过检测模块515和照射模块525而被引导至第二膨胀构件522下方的区域542。区域542可以包括微丸535，微丸535包括适用于PCR或其他扩增技术的缓冲液和试剂。当样品到达区域542时，第二膨胀构件522可以膨胀(例如通过加热第二热气动腔室512的容纳物而膨胀)并且第一膨胀构件521可以收缩(例如通过使第一热气动腔室511的容纳物的温度降低以及使收缩气体穿过第一通道531返回而收缩)。这可以将样品550从区域542经过检测模块515和照射模块525引导并引导回区域541。该过程可以重复，以使样品550在区域541与542之间循环，其可以保持在适合于如本文中公开的扩增技术的不同温度下。样品550可以被照射模块525照射并且响应由检测模块515检测。
其他设计考虑
由于探针精度、探针安置、热分辨率、时间分辨率、废热的存在以及在不增加从穿孔的或不完全密封的传感器泄漏的风险的情况下将探针定位得尽可能靠近反应流体的挑战，测量温度与实际温度之间经常存在差异。因此，在某些实施方式中，装置可以被校准，以允许对读数的软件补偿。尽管补偿的方法取决于实施方式的具体几何形状，但是可以通过将传感器定位在3mm内、或更特别地定位在1mm内、并且甚至更特别地定位在反应流体内或与反应流体连通来实现线性的、静态的补偿。
如本文中所使用的，传感器涉及对从业者而言将是明显的检测方法，包括：温度、压力、机械位置(例如活塞的机械位置)、通道中存在的液体、通过光学、电导率、电容变化(电容变化优选地防止直接电极接触的化学效应、引线(leads)的潜在性和制造复杂性)、或者通过运动致动开关或其他检测器。某些实施方式可以避免使用机械开关、传感器或阀门，这对于基于活塞的PCR装置而言是不需要的，并且会造成成本、复杂性并限制制造选择方案和灵活性。传感器可以涉及装置内的内部状态、涉及环境条件或状态、或者传感器可以从装置外部的源接收信息。
通过使用具有更高热传导率的材料可以实现进一步的增强，热传导率对于聚合物而言优选地高于1W/mK、并且对于(更优选的)金属导体而言优选地高于10W/mK，甚至更优选地具有高于100W/mK的传导率，并且甚至更优先优选地具有高于300W/mK的传导率。优选更硬的材料，因为更硬的材料在实践中倾向于增加热传导率，即使理论或参考文献未报告这种热传导率。此外，增加的硬度以更高的速度、更低的精度和更通用的处理选项允许在制造和组装期间的优势。具有足够工作温度(工作温度通常为至少110℃，但是，除非采用热桥或加热脉冲，否则工作温度在任何情况下都高于最大反应流体温度，并且优选地为至少115℃、120℃、130℃、150℃或更高)的任何聚合物是容许的，然而，优选具有更高耐磨性和抗压缩性的聚合物，其中，优选至少50的洛氏R值，但甚至更优选60、70、80、90、100或更高的硬度。
此外，热传递可以通过涂层材料而进一步增强，涂层材料会以其他方式妨碍裂解、扩增或检测化学，以实现更高的热传导率。在一个实施方式中，该材料是铝，虽然铝和氧化铝通常不被认为对PCR具有抑制作用，但在某些化学条件下，观察到了对PCR抑制，并且可以观察到不希望的效果比如5’水解探针例如TaqMan的自发水解，使得铝的使用需要进一步的保护措施。具体地，例如在铝上使用聚合物涂层(或任何容许的涂层)或衬垫或插入物允许使用铝，其中铝原本在某些条件下是抑制性的。使用具有较高热传导率的材料的额外益处是能够更快地升高温度，从而特别是在初始加热阶段提高速度。受到避免形成抑制性氧化物的金属或者化学反应物比如环氧树脂的限制，涂层可以是薄涂层、保形涂层、贵金属(比如金、银、铂、铑、铱、钯、钌等)涂层、漆、陶瓷或将对从业者明显的大量其他涂层和电镀技术。
快速升高温度的能力通过具有比最高反应流体温度高的工作温度的材料进一步提高，例如，工作温度比反应流体温度高至少10℃、或者甚至更特别地比反应流体温度高15℃、20℃、30℃、50℃、75℃或100℃。这可以允许在初始加热循环期间的过温目标使反应流体和周围材料用作散热件的时段的持续时间缩短。以这种方式的过温以及材料对过温的容许度也是有利的，因为这降低了所需的精度以及降低了热控制回路比如PID(即，比例-积分-微分控制器)或类似控制方法的任何子集或扩展的最大偏差。这同样既直接地因为降低了部件复杂性和所需的精度又间接地通过降低的制造灵活性和更低的精度要求(例如，传感器或其他部件安置中的精度要求)而降低了成本。
促进过温的另一改进是，在高温区周围包括相变蜡或其他材料或者与高温区热联接有相变蜡或其他材料，以用作用于过多的热的缓冲器，将材料或多种材料的属性选择为使得其熔化温度低于装置材料的最大工作(操作)温度，但优选地具有至少5℃、但优选地10℃、15℃、20℃、30℃、50℃的温度阈值，使得原本可能损坏装置材料的过多的热被相变材料吸收为熔化的热。这进一步用作用于高温区的蓄热器，从而使被动热损失最小化并且降低功率需求。
相比于加热(或冷却)元件与反应流体之间(或间接地通过插入物)的高热传导率相反，对于非等温扩增实施方式，在活塞和在两个温度区之间连通的部件中可以优选低热传导率。在一些实施方式中，热传导率可以小于1W/mK、0.5W/mK、0.1W/mK、0.075W/mK、0.5W/mK、0.4W/mK、0.3W/mK、0.25W/mK、0.2W/mK或0.1W/mK。活塞和周围部件中的低热传导率(在阈值方面、程度方面和上面针对高热传导率描述的方式方面)可以通过聚合物选择(包括粘合剂和固化剂)和活塞(和周围部件)的长度、横截面积、几何形状实现。优选地，在活塞和周围部件内包括有空隙或气凝胶，以在不增加实施方式的潜在死区的同时限制热传递，空隙或气凝胶可选地与结构部件结合，以向活塞和周围部件比如横向构件或将为从业者所熟悉的其他结构部件提供足够的刚性和耐用性。
降低热传导率(或增加绝缘系数)也可以在装置端盖周围的区域中是有用的、在较高温度侧部——在一些实施方式中为第一端部151上是最有用的，特别是当高温侧高于90°时、并且甚至更特别地在高温侧高于92℃、93℃、95℃或更高时。端盖自身可以被压配合、焊接或聚合物焊接、旋入或结合有O形环或者使用用于压力容器其他常用方法。替代性地，端盖可以结合手风琴设计，使得活塞相对于装置保持静止，并且在行程循环期间由缸体和端盖执行平移运动。在另一实施方式中，可以没有缸体，而仅具有活塞和接纳端盖。往复运动是通过端盖之间的刚性、半刚性或弹性横向构件实现的，或者在没有这种构件的情况下，其中，来自一个端盖的流体压力用作使另一端盖移动的液压。此外，端盖可以是缸体的一部分，使得端盖和缸体形成单个单元。
对用于基于活塞的往复式PCR装置的聚合物选择可以由若干个因素驱动，这些因素包括：最高操作温度和最低操作温度；灵活性；吸水率(以重量百分比计在一些实施方式中小于1％、5％、10％、25％)；荧光吸收率(在涉及荧光或比色检测的一些实施方式中，荧光吸收率旨在使对来自光源比如LED的入射光的吸光度最小化，其中，一些实施方式具有小于0.1％、0.5％、1％、5％或10％的吸光度)；荧光浸出/背景荧光，其包括自发荧光，其中，一些实施方式具有大于2:1、5:1、10:1、25:1、100:1、500:1的信噪比；以及PCR抑制率，其中，一些实施方式与不存在对聚合物进行特定选择的PCR相比具有小于1％、5％、10％、25％、50％的抑制率。在某些实施方式中，最高工作温度可以高于120℃、或更特别地130℃、140℃、150℃、160℃或更高。在特定实施方式中，最低工作温度可以小于25℃、或更特别地15℃、10℃、5℃、1℃或更低。在某些实施方式中，可以期望使用具有高刚性(低挠性)、具有大于0.1GPa或更特别地大于0.2GPa、0.3GPa、0.5GPa或1GPa的杨氏模量值的材料。
材料在温度和压力的一定范围内保持功能的能力也是选择聚合物的重要因素，并且如本文中别处所讨论的，各部件的热膨胀、并且另外特别地附近的部件的不同热膨胀可以被考虑为：确保在更高的温度下这些部件不会超过公差值，或者确保在对反应腔室中的穿孔部进行密封时在更高或更低的温度下不会发生泄漏。在某些实施方式中，可以选择形成密封的穿孔部的聚合物和材料，使得较高热膨胀的部件搁置在较低热膨胀的部件内，聚合物和材料特别地具有布置成使得膨胀将各部件压得更靠近在一起的几何形状(例如通过使用成角度的插入件或设计部件比如止回阀)。在一些实施方式中，相邻材料的热膨胀可以在彼此的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％以内或更少。
以类似的方式，可以在允许的工作温度的极端情况下考虑形成活塞腔室的材料的吸水率，其中，吸水率小于0.5％、或更特别地小于0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％或更低。应当注意的是，由于降低的公差要求，吸水率对于不属于活塞腔室的一部分的聚合物部件(例如，那些储存载体或裂解液体的聚合物部件)而言不那么重要。在这种情况下，吸水率可能超出上面确定的范围，但可能会受到机械泄漏(在肿胀或收缩使储存密封件变形时)的限制，其中，试剂的浓度被改变超出本文中其他地方所确定的范围，或者其中，其他因素导致累积地造成这些影响。
在特定实施方式中，使对PCR反应的抑制最小化可以是重要的设计考虑因素，并且在一些实施方式中，装置可以超过控制反应的80％、或更特别地控制反应的90％、95％、98％、99％或100％。除了选择用于特定实施方式的聚合物之外，在选择聚合物时应当考虑所结合的任何相关联的粘合剂、固化剂、溶剂、润滑剂或染料。通常，每种聚合物类型具有多种选择方案，包括不含染料的聚合物类型以及包含各种交联程度、聚合物长度或改变聚合物特性的添加剂的聚合物类型(例如，Zhang G.等人“Increasing Polypropylene HighTemperature Stability by Blending Polypropylene-Bonded Hindered PhenolAntioxidant(通过共混聚丙烯键合的受阻酚抗氧化剂提高聚丙烯高温稳定性)”，Macromolecules(大分子),2018,51(5),1927-1936，其通过参引并入本文中)。在一些实施方式中，聚合物是迭尔林(Delrin)。在一些特定实施方式中，迭尔林是未经染色的。
除了活塞和缸体外，还应考虑与反应流体接触的任何其他聚合物或材料，包括O形环、金属、粘合剂和制造过程中的人工制品。例如，Viton O形环与腈O形环相比对PCR的抑制更低，并且Viton O形环因其在其他方面可接受的操作特性而在某些实施方式中可以是优选的。
为方便起见，下面包括了几种聚合物的示例性比较，但该示例性比较不意在代表详尽的选项列表：
Figure BDA0003189920900000761
图例：透明度：TL＝半透明，C＝透明，O＝不透明。(对于某些涉及透照的测量技术，优选透明材料用于缸体和端盖，以允许活塞位置测量。对于不使用透照的其他实施方式比如霍尔(磁传感器)测量，则不考虑透明材料，并且替代地，非铁磁材料是有利的(除非这种材料被故意用于扩展或传播磁场构象)。在其他实施方式中，较暗的或不透明的材料吸收光的程度更大，并且允许较少的光从外部进入反应环境，并且由于较低的背景和提高信噪比而可以是有利的。在特定实施方式中，使用黑色或深色聚合物可以将噪声降低50％、75％、85％、90％、95％、99％或更多。在其他实施方式中，白色的、未染色的或反射材料的使用可以用于通过增加扩增-检测腔室内的信号反射来增大信噪比。例如，在一些实施方式中，使用反射表面比如铝可以将信号增加2倍，并且在其他实施方式中，使用白色或未染色的聚合物可以将信号增加2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍或更多倍。)灵活性：R＝刚性，F＝挠性。
当执行并行并且(在一些实施方式中)在端盖区域中进行检测时，可能优选地选择抵抗轴向旋转的活塞横截面轮廓，以使剪切力最小化并且根据构形而使意外混合最少化。在没有插入件的情况下，多个活塞(或分开的活塞)可以并行操作以处理反应。在具有插入件比如反应腔室插入件300的一些实施方式中，单个活塞面可以驱动多个反应，这些反应通过插入件内的分区而在与活塞面平行的平面中或穿过成排布置的多个这种平面而被分离。
活塞的长度可以影响从装置的较高温度端部至较低温度端部的热传递。在一些实施方式中，活塞的长度可以缩短以接近平衡点，使得来自较高温度侧部的被动热传递足以或几乎足以使较低温度侧部升高至期望的设定点。优选具有安全余量，使得在最大允许环境操作参数中的最大装置容差下，较低温度侧部将优选地贡献至少1％、但更优选地3％、5％或10％的热，否则需要将装置的较低温度侧部在给定的环境条件下保持在期望的设定温度。第二端部152可以可选地包括散热件或热防护物，包括对于从业者而言将明显的包含允许对流冷却的空气的连通空隙、用于辐射冷却的翅片或突出部、冷却(热)管道、化学冷却或包括主动和被动冷却的其他方法或其组合。
作为进一步的增强，并且作为较高温度区和较低温度区处的加热源的替代性实施方式，该设计可以通过调节热源与第一端部或第二端部或热源与第一端部和第二端部两者之间的接触表面积来动态地调节从单个热源引导至较高温度侧部和较低温度侧部的热的比例，以基于环境条件或样品特性来优化热传递比例(并因此优化功率使用)。对这种优化的控制对于从业者而言将是明显的并且可以包括机械和电动方法以及自调节材料比如双金属合金和相变化合物，这些相变化合物被校准成与所接收的热的分数成反比地改变其表面接触面积。
活塞的组分、密度、几何形状、热传导可以被优化，以产生不同的优化实施方式。在一个实施方式中，为了优化活塞的几何形状，考虑缸体与活塞之间的体积差，并且计算总体积作为缸体体积与活塞之间的差值(减去由活塞-缸体公差产生的体积以及如果存在的话减去毛细管体积)。反应体积计算为抵靠与由活塞接合的壁相反的缸体壁的流体的缸体减去由任何暴露的O形环或突起、粗糙部或肋部所占据的任何体积。死区是通过从总体积中减去反应体积来计算的，并且死区百分比是死区与总体积的商。
在某些实施方式中，受活塞大致横移壳体的线性行程长度的能力的限制，死区可以小于35％、25％、20％、甚至更特别地小于15％、10％、5％或更低，其中，行程长度横移时间少于5秒、或更特别地少于4秒、3秒、2秒、1秒、500毫秒、250毫秒、100毫秒或更少，其中，下限行程长度横移时间受先前讨论的热传递时间和所用扩增方法所需的最小化学反应时间之和的限制。例如，在聚合酶链反应中，可行的是通过增加较低体积的反应物的浓度(参见Farrar,“Extreme PCR：Efficient and SpecificDNAAmplification in 15-60Seconds”,Clinical Chemistry 2015；另参见US 9932634，其通过参引并入本文中)以及本文中讨论的用以优化扩增的其他方法而实现快速循环持续时间(例如，每半个循环小于10秒、9秒、8秒、7秒、6秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1秒、500毫秒、250毫秒、100毫秒，这又将相当于总PCR反应时间等于循环时间和循环数目的乘积，循环数目例如为10个循环、15个循环、20个循环、25个循环、30个循环、35个循环、40个循环、45个循环和50个循环或更多个循环；因此，例如，总PCR反应时间可以快到少于1分钟、或约2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟、或约在30分钟至35分钟之间、35分钟至40分钟之间、约在40分钟至45分钟之间、约在45分钟至50分钟之间、约在50分钟至55分钟之间、约在55分钟至60分钟之间、或更多分钟)。
在一些实施方式中，装置可以经由无线连接、蓝牙、USB电缆或其他适合的机制连接至智能手机、平板电脑、计算机或其他类似装置(以下称为“配套装置”)。如前所述，虽然这种配套装置可以用于向装置提供电力，但这种配套装置也可以用于允许装置在没有显示屏的情况下以及在显著降低内存和处理能力的情况下运行，这是因为配套装置将能够提供这种内存。在这种实施方式中，装置还可以与将在配套装置上运行的配套应用程序(或应用软件)一起作用。以此方式，装置在生产成本方面可以显著降低，同时仍然保留了便携性的关键特征。
在一些实施方式中，可以对所使用的聚合酶类的酶进行修饰，以提供更短的PCR循环时间或更短的总PCR时间或者其他特性比如更高的保真度、稳健性、更低的成本或与材料、试剂或样品组分更低的兼容性。例如，可以使用高持续合成能力的酶、或快速聚合酶、或紧密结合的酶、或包括内切或外切核酸酶功能的酶。例如，许多PCR聚合酶的运行速度接近每分钟1千碱基。在所关注的目标是例如200碱基对的实施方式中，这相当于聚合酶时间为大约12秒(200bp/1000bp*60s)。包含有速度例如为每分钟5千碱基的快速聚合酶对于类似大小的目标将使聚合酶时间减少至2秒至3秒。聚合酶可能来自各种嗜热微生物，其包括水生栖热菌(Taq)、激烈火球菌(Pfu聚合酶)、嗜热高温球菌(Wind或Tli聚合酶或Vent聚合酶)和嗜热栖热菌(Tth聚合酶)。(Drouin等人，DNA polymerases for PCR applications(用于PCR应用的DNA聚合酶)，J.Polaina和A.P.MacCabe(编辑)，Industrial Enzymes(工业酶)杂志，379-401，2007)。可以针对5’至3’聚合酶活性、3’至5’核酸外切酶校对活性或5’至3’核酸外切酶切口平移活性来选择聚合酶。示例性聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段(例如对双链DNA的凹入3’端进行标记)、Taq DNA聚合酶(例如用于DNA标记)、T4 DNA聚合酶(例如用于形成平末端)、末端转移酶(例如用于跟随并标记3-OH末端)、Deep
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(例如用于高保真度)、Pfu DNA聚合酶(例如用于引物延伸)、
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增强型PhusionTM、SequenaseTMDNA聚合酶I、rTh DNA聚合酶XL、Isis校对聚合酶、rBst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶(例如滚环复制)、SurePRIMETMDNA聚合酶、BioTHERMTMDNA聚合酶、SpeedSTARTM HS DNA聚合酶、MTPTM Taq DNA聚合酶和KOD“宿主起始”DNA聚合酶。
在一些实施方式中，可以使用Deep
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或其他更高温度的酶(比如从T.litoralis或类似物种中分离的那些酶)，其使得在聚合反应期间在较低浓度下半衰期时间增加。此外，多种酶的组合或针对这些特性进行优化的组合或者例如与等温扩增和rtPCR的组合可以用于提高效率，特别是对于RNA目标或具有不普通的碱基对含量比如高GC含量的目标或者具有高度重复性片段的序列。也可以包括其他技术，比如使用靶向核酸内切酶来区分SNP和细微的目标序列。此类靶向核酸内切酶包括但不限于CAS/CRISPR、TALEN、ZFN、以及允许对所关注的序列进行高保真可编程靶向的任何快速可用的分子生物学工具(Batista和Pacheco，Detecting pathogens with Zinc-Finger,TALE and CRISPR-basedprogrammable nucleic acid binding proteins(使用基于锌指状结构、TALE和CRISPR的可编程核酸结合蛋白检测病原体)，Journal of Microbiological Methods(微生物学方法杂志)，152：98-104，2018)。
例如，在一些实施方式中，SNP或细微目标序列的区分是通过包含DNA结合蛋白和其异源调节结构域或功能片段的融合蛋白进行的。在一些方面，域包括例如转录因子域比如激活剂、阻遏物、共激活剂、共阻遏物、沉默子、癌基因、DNA修复酶及其相关因子和修饰剂、DNA重排酶及其相关因子和修饰剂、染色质相关蛋白及其修饰剂例如激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶、以及DNA修饰酶例如甲基转移酶、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶及其相关因子和修饰剂。例如参见美国专利申请公开No.2005/0064474；No.2006/0188987和No.2007/0218528，这些美国专利申请公开以其全部内容通过参引并入本文中。
在一些实施方式中，锌指蛋白(ZFP)是靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，通常为9个至18个核苷酸长，通过独立的指状物的组装产生。ZFP包括其中单个指状域的长度为大约30个氨基酸并且包含α螺旋的ZFP，该α螺旋包含通过锌与单个β转角的两个半胱氨酸协调的两个不变的组氨酸残基并且具有两个、三个、四个、五个或六个指。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)进行氨基酸取代而改变。因此，在一些实施方式中，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如，ZFP或含有ZFP的分子被改造以结合至所选择的靶位点。例如，参见Beerli等人，2002年；Pabo等人，2001年；Isalan等人，2001年；Segal等人，2001年；Choo等人，2000年；美国专利No.6,453,242；No.6,534,261；No.6,599,692；No.6,503,717；No.6,689,558；No.7,030,215；No.6,794,136；No.7,067,317；No.7,262,054；No.7,070,934；No.7,361,635；No.7,253,273；以及美国专利公开No.2005/0064474；No.2007/0218528；No.2005/0267061，上述所有文献以其全部内容通过参引并入本文中。
在一些实施方式中，TALEN是包含源自TALE的DNA结合域和切割核酸目标序列的核酸酶催化域的融合蛋白。在一些实施方式中，将TALE重复结构组装至特异性靶向基因(Gaj等人，2013年)。已经构建有靶向18,740个人类蛋白质编码基因的TALEN库(Kim等人，2013年)。定制设计的TALE阵列能够通过Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、TransposagenBiopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦)和Life Technologies(美国纽约州格兰德岛)商购获得。
在一些实施方式中，使用CRISPR/Cas系统，其包括对Cas基因进行编码的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(包括“同向重复”和在内源性CRISPR系统的背景下经tracrRNA加工的部分同向重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统的背景下也称为“间隔物”)、和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括序列特异性地结合至DNA的非编码RNA分子(引导)RNA和具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或更多个元件可以源自I型、II型或III型CRISPR系统、例如源自包含内源性CRISPR系统的特定生物体比如化脓性链球菌(US20110059502和US8795965，两者均通过参引并入本文中)。
减小反应体积可以通过减少热传递时间和化学反应时间而对基于活塞的扩增的效率产生多于附加(即协同)的影响。因为这些因素随着体积减小而有助于基于活塞的装置中越来越快的反应，因此这些因素会受到两个主要因素的限制、即灵敏度和死区占总反应体积的比例。正如别处所讨论的，灵敏度的影响可以通过在进入模块方面的几种途径来减轻，包括如对从业者将非常熟悉的所关注的核酸浓缩的样品制备方法。死区的比例影响扩增反应的效率，其中，死区的比例越高，则使反应顺序从理想化的第二级(其中PCR反应使每个热循环加倍)向第一级(线性)反应速度降低。然而，由于较小反应的多于附加的益处也是高阶效应(根据用于实现更高热传递的模式，速率与表面积、距离的倒数和热传导率成正比)，在某些实施方式中可以优选地确定与反应的优选体积相对应的扩增时间的局部最小值，并且进而确定实现这一点所需的几何参数。
随着反应空间的总体积增加，死区的相对百分比减少，从而产生更靠近地接近理想加倍的扩增效率(应理解，如果污染物、浓缩样品或其他人工制品抑制了早期的ΔCt值，qPCR的测量效率会超过100％，从而人为地增加了产量曲线)，但是这可以受到几个约束的限制。第一，随着反应体积增加，热的量和热传递所需的时间两者均会增加，如果扩增时间要保持恒定，则造成了额外的设计要求。第二，增加的体积可能需要增加样本大小。这通常不是对临床样品的约束，但是可以关于包括浓缩步骤的裂解模块或者关于实验样品。第三，增加的体积通常会增加试剂成本，并在某种程度上增加制造时间和材料成本。此外，由于扩增期间的宏观体积效应，扩增反应在较高体积下可能变得不可靠。因此，在一些实施方式中，反应体积可以小于500μL、更特别地小于250μL、150μL、100μL、50μL、25μL、15μL、10μL、5μL、1μL或更小。
在特定实施方式中，样本端口155可以是具有收集活塞的浮动式活塞构型，其中，收集活塞的前进用于关闭进入端口、推进样本流体并将样本流体挤压到下一阶段以最大程度地减少空气的进入和所需的手动步骤，例如在一些实施方式中，275。样品流体也可以在该阶段与裂解试剂混合以完成提取和纯化，或者替代性地以液体形式、冻干形式、粉末形式或其他形式被预装载。
在一些实施方式中，在扩增之前，可以从生物样品中纯化、分离或提取核酸。为了释放细胞或病毒颗粒的容纳物，可以利用酶或利用化学品对其进行处理，以使细胞壁或病毒颗粒溶解、降解或变性。在其他实施方式中，裂解可以通过渗透压或膨胀压或加热来实现。在其他实施方式中，样品可以与以下各者接触：离液剂比如硫氰酸胍或阴离子、阳离子、两性离子或非离子洗涤剂、对先前描述的酶或不需要的蛋白质进行快速降解的蛋白酶比如碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或蛋白酶K。
在某些使用PCR和RT-PCR过程的实施方式中，样品的裂解可以使用以下各者以化学的方式进行：冻干制剂；蛋白酶(丝氨酸蛋白酶比如蛋白酶K、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶)，特别地每反应0.05μg至2μg(或更特别地每反应0.5μg至1μg)；RNA酶抑制剂(特别地每微升反应体积超过0.1单位、甚至更特别地每微升反应体积1单位)；并且可选地，细菌酶(特别地每微升反应体积超过0.05单位)。在一些实施方式中，裂解缓冲液包含缓冲剂、离液盐、离子清洁剂、非离子清洁剂溶剂、EDTA、Trizol、一价盐和/或二价盐。使用的缓冲液可以包括但不限于H3PO4/NaH2PO4、甘氨酸、柠檬酸、乙酸、柠檬酸、MES、二甲胂酸、H2CO3/NaHCO3、柠檬酸、Bis-Tris、ADA、Bis-Tris丙烷、PIPES、ACES、咪唑、BES、MOPS、NaH2PO4/Na2HPO4、TES、HEPES、HEPPSO、三乙醇胺、Tricine、Tris、甘氨酸酰胺、N-二甘氨酸、双甘氨肽、TAPS、硼酸(H3BO3/Na2B4O7)、CHES、甘胺酸、NaHCO3/Na2CO3、CAPS、哌啶、Na2HPO4/Na3PO4及其组合。在其他实施方式中，裂解可以通过加热、微波或物理解离(例如，基于二氧化硅的过滤器或磨碎机)进行。模块内任何阶段的冻干组分与液体组分在冻干组分和液体组分被薄膜隔开的条件下可以包含在一起，薄膜在操作期间被穿孔或随后通过本文中所述的任何流体通道划分方法而接合。例如，冻干的PCR试剂可以位于活塞毛细管内、端盖或圆柱体中，并且在活塞相对于圆柱体或端盖移动时被穿孔。以类似的方式，冻干的裂解试剂可以被包含在拭子手柄或进入模块的相应接收部分内(可选地与液体试剂或载体溶液包含在一起)，使得柳叶刀或隔室的其他机械穿透允许两个元件的混合，或者混合通过本文中别处提到的其他方法而实现。
在某些实施方式中，反应流体175可以在PCR过程中热循环，其中，试剂包括冻干制剂、PCR预混制剂的一个珠粒(例如，Jena Bioscience有限公司；包含进行PCR所需的所有组分，包括Taq DNA聚合酶、0.5毫摩尔至10毫摩尔的氯化镁、10毫摩尔至100毫摩尔的氯化钾、5毫摩尔至50毫摩尔的硫酸铵，以及实现冻干所需的添加剂和稳定剂，添加剂和稳定剂可以包括以下化合物的组中的一项或更多项：聚(乳酸共乙醇)酸、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(己内酯)、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(原酸酯)和聚(羟基丁酸酯)、果糖、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、艾杜糖、半乳糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿果糖、果糖、山梨糖、塔格糖、呋喃果糖、呋喃核糖、核糖、脱氧核糖、甘露糖醇、乳糖酸、乳糖纤维二糖、海藻糖和乳果糖、淀粉、糖原、纤维素、软骨素、角蛋白、肝素、皮肤素和透明质酸)、2毫摩尔至10毫摩尔的MgCl2、50纳摩尔至900纳摩尔的正向测定引物和反向测定引物、50纳摩尔至400纳摩尔的检测探针、以及1微摩尔至10微摩尔的蛋白酶k抑制剂(AAPF、AAPV、AAPA；其他抑制剂可以包括：AEBSF、6-氨基己酸、抗痛素、抑肽酶、盐酸苯甲脒、苯丁抑制素、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、N-乙基马来酰亚胺、亮抑酶肽、胃酶抑素、磷酰二肽、胰蛋白酶抑制剂)。在特定实施方式中，反应流体175可以在RT-PCR过程中热循环。在一个具体实施方式中，用于RT-PCR的试剂可以包括冻干制剂、PCR预混制剂的一个珠粒、2毫摩尔至10毫摩尔的MgCl2、50纳摩尔至900纳摩尔的正向测定引物和反向测定引物、50纳摩尔至400纳摩尔的检测探针、10微摩尔至500微摩尔的蛋白酶抑制剂和逆转录酶制剂(每微升反应体积0.05单位至2单位)。PCR混合液中可以包含化学添加剂或共溶剂比如赋形剂和/或稳定剂。例如，1％至10％的二甲亚砜(DMSO)、5％至20％的甘油、1.25％至10％的甲酰胺、10μg/mL至100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、15毫摩尔至30毫摩尔的硫酸铵、5％至15％的聚乙烯乙二醇(PEG)、0.01％的明胶、0.05％至0.1％的非离子清洁剂(例如，Tween 20、Triton X-100)或1摩尔至3摩尔N,N,B-三甲基甘氨酸(甜菜碱)(Bartlett JMS、Stirling D(2003)PCR协议。出自：Methods in molecular biology(分子生物学的方法)(第2版)。Totowa：Humana出版社)。在一些实施方式中，可以使用PCR抑制剂比如多酚、腐殖酸和富里酸。
在某些实施方式中，照射模块133和检测模块135可以用于在热循环过程之前、热循环过程期间或热循环过程之后对反应流体175中存在的分析物照明和检测。例如，试剂173可以包含与样品170中的特定目标分子或序列反应、结合或以其他方式对样品170中的特定目标分子或序列进行修饰的组分。在某些实施方式中，此类分析物可以发射可以由检测模块135检测的荧光或化学发光信号。应当理解，图1中所示的照射模块133和检测模块135的位置出于示例性目的，并且其他实施方式可以包括照射模块133和检测模块135的不同位置。在所示实施方式中，设备100包括显示器196(例如，液晶显示器)，显示器196构造成显示由分析和诊断样品170所得的结果。设备100还可以包括一个或更多个控制元件197(例如按钮、开关等)，以允许用户控制设备100(例如，开始设备100的操作或停止设备100的操作)。在特定实施方式中，装置100可以包括允许用户开始设备100的操作的单个控制元件197(例如，开始按钮)，其中，控制的所有后续方面由控制器195自动执行。
在某些实施方式中，可以优选的是，在操作期间允许宽范围的生物样品体积，其具有用作基底的最小可检测体积(其由与在装置上执行的测试相关的分析物的浓度设定)以及受便携性、成本和预期用途的其他商业方面限制的上限。由于此处提到的因素，生物样品体积的典型范围可以是至少10μL、或更具体地50μL、100μL、250μL、500μL、1mL或更大，并且大于5mL、7mL或10mL的体积可以浓缩，或者如果不采用浓缩，则包含足够的目标分析物以允许直接裂解、扩增和检测。
在特定实施方式中，使用对样本流体进行稀释的承载流体。该承载流体稀释剂可以包含裂解试剂或PCR试剂(例如，引物)的子组，并且可以以1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9的比率、或更特别地以1:10的比率稀释样品流体。在其他实施方式中，该比率可达1:15或更大。在样本流体是唾液的某些实施方式中，该比率可以在1:9与1:15之间。在某些实施方式中，对于粘性的、包含所采用的扩增化学的抑制剂或包含大量目标分析物的样品流体而言可以优选地进行稀释，最特别地是在使用定量或半定量检测方法的情况下。在一些实施方式中，具有排除或限制碎片或者通过较小的孔过滤器排除或限制长链化学品的机械过滤器，或者具有使特定电荷或尺寸通过的机械过滤器。
在一些实施方式的操作期间，还可能期望从上述最小目标体积和最大目标体积中提取出固定体积，使得化学物质浓度对于裂解流体、反应流体和检测流体而言在那些固定的或分布更紧密的体积中具有类似的范围。在一些实施方式中，可以优选地获得体积变化不超过30％、但甚至更特别地小于25％、20％、15％、10％、5％、3％、1％或更少的裂解流体并且获得体积变化小于20％、但更特别地小于15％、10％、7.5％、5％、3％、1％或更少的反应流体。
由于检测流体主要是反应流体的子集成分，而反应流体又是裂解流体的成分，而裂解流体又是样品流体(并且可选地，包含有任何承载流体或稀释流体)的成分，应当理解，每种流体将额外地包含可以在该阶段增加体积的液体或干燥(例如冻干)的试剂，并且应当理解，优选的是将固定体积保持在一定范围内(如上所述)，在一些实施方式中，对来自每个阶段的剩余流体/废流体的管理通过包括溢流腔室或者通过在流体柱中采用分隔部来实现，使得尽管有上述试剂添加，但进入流体的体积在每个阶段减少(或最小程度为不增加)。在包括溢流腔室的实施方式中，溢流腔室可以可选地包含吸收材料或传感器以指示该腔室的进入或饱和。
流体柱的划分可以在几个不同的实施方式中于不同的模块(例如进入、裂解、组合扩增/检测，[本文中也称为“扩增”])中实现，包括但不限于使用热或通道的化学密封、机械压缩或膨胀、包括螺旋或扭转压缩、压配合或温度辅助模式，例如通过依靠部件的热膨胀来使各部件的配合收紧或依靠流体压力来更紧密地密封止回阀、球、旋转的或其他的阀、致动器，通过将可以通过机械过程、控制器195、传感器调控的或可以通过流体通道的动作直接触发的物质熔化或固化。
如在活塞插入件的实施方式中所讨论的，空气管理对于整个流体通道会是重要的，并且过量空气(并且通常是气体)可以通过各种实施方式来处理，这些实施方式包括在模块内使用真空/抽空隔室，应当理解，虽然在一些实施方式中可以优选90％、95％、97％、99％或更高的真空度，但如果与本文中所述的其他方法组合，则可以采用更低的百分比。其他这种实施方式包括使用液体预填充模块，从而将流通特征结合至本发明，由此在流体柱的前方前进的空气可以穿过该模块，并且可以使用若干方法关闭出口以及管理溢出(如上所述)，并由此形成包含适合于具有足够大体积和具有足够低气液比的模块的流体的模块。
在其他实施方式中，吸收空气组分的方法包括使用氧气和其他气体吸收化合物或材料、铁基的、不含铁的去氧剂(例如Kerry,Joseph；Butler,Paul(2008年5月23日).SmartPackaging Technologies for Fast Moving Consumer Goods(用于快速消费品的智能包装技术).Wiley&Sons.，其通过参引并入本文中)以及可以在室温和压力下操作或需要更高温度暴露的合金或化合物(例如，US8211202，其通过参引并入本文中)。当使用化学吸收剂、特别是铁基吸收剂时，在一些实施方式中可以期望将清除剂包含在聚合物或合金结构中，以防止随后对PCR化学反应的抑制。
某些实施方式被设计成接纳或管理存在的空气。这可以通过解决基于活塞的PCR的核心挑战来实现，该核心挑战即为对液体-气体边界的管理。对于使用较高温度解离核酸的扩增方法(例如PCR)，水溶液通常接近水的沸点，或者在标准压力下高于大约90℃，并且根据将为从业者所熟悉的气体定律，在更高压力下相应地为更高温度且在更低压力下相应地为更低温度。虽然引物设计可以提供较低的解离温度，但是在对于DNA的最佳解离和蛋白质的变性而言优选接近沸点的温度的情况下于基因组DNA或其他化学物中提取或靶向分析物时，可以期望增加反应的压力以避免闪沸。在一些实施方式中，可以期望使用压力容器，为了安全起见包括压力释放特征。
在一些实施方式中也可以期望严格的温度控制，其中，控制回路允许不超过10％的变动，或者更特别地，甚至更优选的是不超过7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的变动。这可以允许装置在接近其最大允许温度的设定点处运行，这不仅从材料的角度来看很重要，而且因为扩增的效率在高于特定温度时可能会降低，即使沸点借助于额外的压力而增加(例如，参见Drouin等人，DNA polymerases for PCR applications(用于PCR应用的DNA聚合酶)，J.Polaina和AP MacCabe(编辑)，Industrial Enzymes(工业酶)，379-401，2007；另参见https://www.neb.com/tools-and-resour ces/selection-charts/thermophilic-dna-polymerases，每者均通过参引并入本文中)。对于含有TaqMan检测所需的5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，可以将反应温度保持为低于99.9℃、更优选地低于99.5℃、99℃、98℃或更低，如所关注的特定目标所允许的。对于不依赖上述机制的检测方法，可以期望更高温度的聚合酶(在100℃至105℃或更高温度处工作的聚合酶)。
在某些实施方式中，设备100构造为扩增或复制模块或能够进行热循环的热循环仪，包括使用聚合酶链反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、实时PCR、逆转录PCR的循环加热或经由空间域或时域格式的其他适合的热循环。
在某些实施方式中，反应流体175可以包含引物、寡核苷酸、缓冲液、dNTP(脱氧腺苷三磷酸)、rNTP(核糖核苷三磷酸)、探针、盐、一价阳离子、钾、二价阳离子、镁(Mg)、锰(Mn)、适体、水解探针(例如TaqMan探针)、双标记探针、蝎形探针、Taq聚合酶、分子信标、比色指示剂、DNA结合或报告染料(例如SYBR绿)、金纳米粒子、荧光或逆转录酶。在一些实施方式中，探针是ATTO647、FAMTM、HEXTM、TETTM、JOETM、TAMRATM、Texas
Figure BDA0003189920900000871
NEDTM、ROXTM、
Figure BDA0003189920900000872
Cy、罗丹明、ATTO或其他类似的探针。为多个通道(即，多路复用)选择和组合探针的原则将是从业者所熟悉的。用于特定测定的优选探针应结合对量子产率或能量输入与能量输出的比率的考虑，其中，1.0的量子产率是100％，并且量子产率小于此值表示能量的一小部分以期望的波长返回。应当注意，虽然许多染料是关于其最大吸收或发射波长来描述的，但实际曲线通常根据许多因素而不同，并且对高带通波长和低带通波长的考虑由于不同的染料而应包括“肩部”或次最大波长频率以及信号重叠。参见以下与探针和染料选择及组合相关的参考文献，其通过参引并入本文中：
·https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications/fluorophores/freedom-dyes
·Prediger，Recommended dye combination for multiplex PCR(用于多重PCR的推荐染料组合)，Integrated Data Technologies(集成数据技术)，2018年。
·Prediger，qPCR Probes—selecting the best reporter dye and quencher(qPCR探针——选择最佳报告染料和淬灭剂)，Integrated Data Technologies(集成数据技术)，2015年。
在一些实施方式中，引物的长度为12个核苷酸至35个核苷酸(例如，长度为12个核苷酸至20个核苷酸、20个核苷酸至25个核苷酸、25个核苷酸至30个核苷酸或30个核苷酸至35个核苷酸)，比如长度为15个核苷酸至20个核苷酸。引物可以从模板的已知部分设计，一个引物与模板核酸分子的双链的每条链互补且位于待合成的区域的相反侧。引物可以按照本领域中已知的方式而被设计和合成地制备。可以对引物进行修饰，以减少非特异性杂交(美国专利No.6,001,611，其通过参引并入本文中)。在一些实施方式中，热启动引物可以用于减少非特异性反应并且可以包含茎环或发夹状结构(美国专利No.6,482,590、美国专利申请No.2007/0128621)。引物的化学修饰可以包括但不限于乙二醛、乙二醛的衍生物、3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐、3-乙氧基-2-酮丁醛(酮乙醛)、茚三酮、羟基丙酮、草酸二乙酯、中草酸二乙酯、1,2-萘醌-4-磺酸、丙酮醛、酰胺、γ-羧酰胺、脒和氨基甲酸酯。在某些实施方式中，可以使用的核苷酸类似物包括其中糖被修饰的衍生物，如2’-O-甲基衍生物、2’-脱氧-2’-氟衍生物和2’,3’-双脱氧核苷衍生物、基于其他糖骨架比如苏糖、锁核酸衍生物、双环糖或己糖、甘油和乙二醇糖的核酸类似物、基于非离子骨架的核酸类似物。
在某些其他实施方式中，反应流体可以采用由模块135检测的替代检测方法，包括dsDNA结合染料、水解探针、杂交探针、核苷酸类似物、pH变化、比色指示剂、发光指示剂或电化学检测模式。例如，检测的模式可以包括SYBR green(分子探针)、SYBR-Gold、EvaGreen、溴化乙锭、YO-PRO-1、SYTO、BEBO、BOXTO、TaqMan(Roche)、i-探针、Eclipse探针、FRET、ATTO、PicoGreen、Snake、分子信标、适体信标、PNA信标、标记的LNA探针、抗体信标、Scorpions探针、LightCycler探针、Hyprobe、HyBeacon,ResonSense、Yin-Yang、Amplifluor、LUX、Cyclicons、Angler、LNA、PNA、ZNA、Plexor引物、使用离子敏感场效应晶体管(ISFET)的pH感应、高分辨率熔解曲线分析(HRM)或其他。这些技术分别在以下来源中总结，这些来源通过参引并入本文中：
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·Lee MA,Siddle AL,Page RH(2002)
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simple linearfluorescent probes for quantitative homogeneous rapid polymerase chainreaction(
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用于定量均相快速聚合酶链反应的简单线性荧光探针).AnalChim Acta(肛门化学学报)；457:61–70.
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resonance energytransfer probes in real-time polymerase chain reaction(在实时聚合酶链反应中使用极短的
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共振能量转移探针).”Nucleic Acids Res(核酸研究).41:e191.
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用于检测的探针的一些非限制性示例包括荧光团、放射性同位素、色原、酶、抗原，其包括但不限于表位标签、半导体纳米晶体例如量子点、重金属、染料、磷光基团、化学发光基团、电化学检测部分、结合蛋白质、磷、稀土螯合物、过渡金属螯合物、近红外染料、电化学发光标记和质谱仪兼容的报告基团比如质量标签；电荷标签和同位素(例如参见Haff和Smirnov,Nucl.Acids Res.25:3749-50,1997；Xu等人,Anal.Chem.69:3595-3602；1997；Sauer等人,Nucl.Acids Res.31:e63,2003)。可以使用多元素探针系统，其包括但不限于亲和标签比如生物素：抗生物素蛋白、抗体：抗原等，其中，一种元素与系统的一种或更多种其他元素相互作用以产生对于可检测信号的潜力。多元素探针系统的一些非限制性示例包括包含生物素报告基团和链霉亲和素偶联荧光团的寡核苷酸，或者反之亦然；包含DNP报告基团和荧光团标记的抗DNP抗体的寡核苷酸；诸如此类。可以使用荧光团-猝灭剂对，其包括但不限于荧光猝灭剂和暗猝灭剂(也称为非荧光猝灭剂)。暗色或非荧光猝灭剂的一些非限制性示例包括Dabcyl、Black Hole Quenchers、Iowa Black、QSY-7、AbsoluteQuencher、Eclipse非荧光猝灭剂、某些金属颗粒比如金纳米颗粒等。可以使用藻胆蛋白包括R0-藻红蛋白、B-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白(Hu，Production of potential coproductsfrom microalgae(从微藻中生产潜在副产品),Biofuels from Algae(藻类生物燃料)，2019)以及萤光素包括萤火虫、紫螟萤光素、细菌萤光素、腔肠素、沟鞭藻类、以及3-羟基组氨酸。在一些实施方式中，探针与一个或更多个表面缀合或结合并且可以用作捕获探针，包括将为本领域技术人员所熟悉的加入洗涤或洗脱步骤。在一些实施方式中，探针可以按取向和图案排列以允许基于其与光电检测器元件的接近度进行差分检测。
在一些实施方式中，用于检测的适合的标记可以包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹磺酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六组氨酸(6×His)、磷酸-氨基酸(例如，P-tyr、P-ser、P-thr)、萤光素、罗丹明、藻胆蛋白或任何其他适合的标记。在一些实施方式中，使用CRISPR-Cas13a/C2c2介导的报告RNA的裂解进行检测，比如通过特定的高灵敏度酶促报告解锁平台(Gootenberg等，Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2(使用CRISPR-Cas13a/C2c2进行核酸检测)，科学,356(6336):438-442,2017；Myhrvoid等，Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13(使用CRISPR-Cas13的可现场部署的病毒诊断)，科学,360(6387),444-448)。
在某些实施方式中，检测是使用电场接近感应(EFPS)来执行的，其依赖于下述事实：假设附近物体至少轻微地导电，则电场可能会因附近物体的存在而受到干扰，(例如参见de la Rica,Selective Detection of Live Pathogens via Surface-ConfinedElectric Field Perturbation on Interdigitated Silicon Transducers(经由叉指型硅传感器上的表面限制电场扰动对活病原体进行选择性检测),Anal.Chem.2009,81,10,3830-3835)。在一些实施方式中，熔解曲线分析可以用于通过评估加热期间双链DNA的解离特性来进行检测，例如用于对单核苷酸多态性进行检测(Farrar等人，High-resolutionmeltingcurve analysis for molecular diagnostics,Molecular Diagnostics(用于分子诊断的高分辨率熔解曲线分析)，分子诊断，第2版，2010年)。
在一些实施方式中，通过测量混浊度或透明度的降低来进行浊度分析。由颗粒比如微生物散射的光能够检测水中的这些颗粒(Omar和MatJafri，Turbidimeter Design andAnalysis:A Review on Optical Fiber Sensors for the Measurement of WaterTurbidity(浊度计设计和分析：用于测量水浊度的光纤传感器综述)，传感器(巴塞尔)。2009；9(10):8311-8335)。
在某些实施方式中，侧向流动测试或侧向流动免疫层析测定可以用于检测。侧向流动分析可以包括基于一系列毛细管床比如多孔纸片、微结构聚合物或烧结聚合物对样品中的目标分析物的存在进行基于纤维素的检测(Urusov等人,Towards Lateral FlowQuantitative Assays:Detection Approaches(关于侧向流动定量测定：检测方法),生物传感器(巴塞尔).2019Sep；9(3):89)。侧向流分析可以使用对彩色的、荧光的、磁性的或导电的标签进行记录的检测器。
在一些实施方式中，toehold探针可以用于核酸检测(Toehold Probes forNucleic Acid Detection,New molecular probe can distinguish DNA and RNAsequences with unprecedented accuracy(用于核酸检测的Toehold探针，新分子探针可以以前所未有的准确度区分DNA和RNA序列)，威斯研究所，2012)。Toehold探针可以包含由于其核苷酸序列的互补性而彼此杂交的两条DNA链。一个“探针链”也与目标序列、例如人类基因组中的目标序列互补，而第二“保护链”对目标DNA的一部分进行复制。Toeholds——位于探针链的末端处的与目标序列或保护链互补的短序列——可以引发两个交换反应。这些引起探针链特异性地结合至其目标DNA/RNA/XNA(以允许该目标DNA/RNA/XNA的检测)并且保护链被释放；或者相反地引起探针链与保护链重接合并留下目标DNA/RNA/XNA。这两种竞争性的交换反应会导致对扰动高度可预测且高度敏感的平衡，使得目标序列中的单个非匹配核苷酸(变体)的存在会阻碍其检测。
分子信标是在与RNA或DNA或XNA目标序列杂交后会发出荧光的发夹形寡核苷酸探针。分子信标的环用作探针并且长度为约15个核苷酸至25个核苷酸。分子信标的茎用于使分子的连结至荧光团和猝灭剂的两个端部紧密靠近。尽管茎长度仅5个核苷酸长至7个核苷酸，但是茎将标签保持成紧密靠近，使得荧光团的荧光在游离探针中被淬灭(Tyagi和Kramer，F1000 Med Rep.2012；4:10)。分子信标和其他适用于实时PCR的探针通常包括位于5’端的荧光报告分子和位于3’端的猝灭剂分子。利用大量荧光团中的任何一种荧光团修饰的探针是可商购的。可商购的荧光核苷酸类似物例如包括Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences公司,Piscataway,NJ,USA)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红
Figure BDA0003189920900000941
Cascade
Figure BDA0003189920900000942
-7-dUTP、
Figure BDA0003189920900000943
FL-14-dUTP、
Figure BDA0003189920900000944
R-14-dUTP、
Figure BDA0003189920900000945
TR-14-dUTP、罗丹明绿TM-5-dUTP、
Figure BDA0003189920900000946
488-5-dUTP、得克萨斯红
Figure BDA0003189920900000947
Figure BDA0003189920900000948
630/650-14-dUTP、
Figure BDA0003189920900000949
650/665-14-dUTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009410
488-5-dUTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009411
532-5-dUTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009412
568-5-dUTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009413
594-5-dUTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009414
546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、得克萨斯红
Figure BDA00031899209000009415
Cascade Blue
Figure BDA00031899209000009416
Figure BDA00031899209000009417
FL-14-UTP、
Figure BDA00031899209000009418
TMR-14-UTP、
Figure BDA00031899209000009419
TR-14-UTP、罗丹明绿TM-5-UTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009420
488-5-UTP、Alexa
Figure BDA00031899209000009421
546-14-UTP(分子探针公司.Eugene,OR,USA)。可以用于合成后附接的其他荧光团包括Alexa
Figure BDA00031899209000009422
350、Alexa
Figure BDA00031899209000009423
532、Alexa
Figure BDA00031899209000009424
546、Alexa
Figure BDA00031899209000009425
568、Alexa
Figure BDA00031899209000009426
594、Alexa
Figure BDA00031899209000009427
647、BODIPY493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹酰、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红(可以从分子探针公司,Eugene,OR,USA获得)、以及Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(AmershamBiosciences公司，Piscataway，NJ USA等)。也可以使用FRET串联荧光团比如PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-得克萨斯红和APC-Cy7；此外，PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。
核酸染料是对双链多核苷酸特异的荧光分子或者当与双链多核苷酸相关而非与单链多核苷酸相关时至少发出明显更大的荧光信号。通常，核酸染料分子通过嵌入在双链区段的碱基对之间、通过结合在双链区段的大槽或小槽中或通过这两者而与多核苷酸的双链区段相关联。核酸染料的非限制性示例包括溴化乙锭、DAPI、Hoechst衍生物，包括但不限于Hoechst33258和Hoechst 33342、包含镧系螯合物的嵌入剂(例如但不限于携带两个荧光四配位基的3-二酮-Eu3+螯合物(NDI-(BHHCT-Eu3+)2)的萘二亚胺衍生物，例如参见Nojima等人，Nucl.Acids Res.Supplement No.1,105-06(2001))、溴化乙锭和某些不对称花青染料比如SYBR
Figure BDA0003189920900000951
Figure BDA0003189920900000952
(均可从分子探针-英杰公司(Molecular Probes-Invitrogen)获得)和BOXTO(TATAA Biocenter AB)。在特定实施方式中，装置100构造成检测核酸(例如脱氧核糖核酸[DNA]、核糖核酸[RNA]、异种(合成)核酸[XNA])、核材料目标、所关注的基因(GOI)、基因组或体细胞突变的分析物/扩增子/目标等的存在、定量或半定量。在特定实施方式中，装置100可以是用完可丢弃的(例如构造成用于一次性使用)。在一些实施方式中，装置100可以接纳筒(例如包括具有不同试剂组合的筒)。装置100可以是电池供电且便携的(例如重量小于10磅、5磅、1磅、400g、300g、200g、100g、50g或更小)。装置100可以构造成接纳原始样品并提供样品的分析或诊断，而无需在样品被引入到装置100中之前制备样品。
如本文中进一步描述的，本文中描述的装置、设备和方法可以用于检测与所关注的各种生物样品相关联的核酸的存在、不存在或数量，所关注的各种生物样品包括传染原比如病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫以及与人类或其他动物的感染相关联的宿主反应序列或表达模式。其他非限制性用途包括基因组序列、体细胞突变、法医学、基因工程生物体的鉴定或表征、个性化医疗。
如下另外讨论的，本文公开的实施方式可以用于检测传染性疾病(包括但不限于HIV、EBV、CMV、流感、疱疹、支原体、肺炎、癌症、梅毒、真菌和原生动物疾病以及肝炎)、诊断癌症、基因指纹、亲子鉴定和法医分析。本文中还提供了用于对来自组织培养分析和动物模型的不可培养或生长缓慢的微生物比如分枝杆菌、厌氧细菌或病毒进行鉴定的方法。所关注的传染原还包括细菌病原体比如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌、麻风分枝杆菌和非洲分枝杆菌)、立克次体、支原体、衣原体和军团菌。细菌感染的一些示例包括但不限于由下述各者引起的感染：革兰氏阳性杆菌(例如李斯特菌、芽孢杆菌如炭疽杆菌、丹毒杆菌属)、革兰氏阴性杆菌(例如巴尔通体、布鲁氏菌、弯曲杆菌、肠杆菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、克雷伯菌、摩根菌、变形杆菌、普罗维登西亚、假单胞菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、弧菌和耶尔森氏鼠疫杆菌属)、螺旋体细菌(例如，包柔氏螺旋体属，包括引起莱姆病的伯氏疏螺旋体)、厌氧菌(例如，放线菌和梭菌属)、革兰氏阳性和阴性球菌、肠球菌属、链球菌属、肺炎球菌属、葡萄球菌属和奈瑟式菌属。传染性细菌的具体示例包括但不限于：幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌、关西分枝杆菌、戈登分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生李斯特菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、草绿色链球菌、粪链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、红斑丹毒丝菌、破伤风梭状芽孢杆菌、破伤风杆菌、肺炎链球菌、梅毒螺旋体、密螺旋体、钩端螺旋体、立克次体、以及以色列放线菌、不动杆菌、芽孢杆菌、博德特氏菌、疏螺旋体、布鲁氏菌、弯曲杆菌、衣原体、衣原体、梭菌、棒状杆菌、肠球菌、嗜血杆菌、螺杆菌、分枝杆菌、支原体、寡养单胞菌、密螺旋体、弧菌、耶尔森氏菌、鲍曼不动杆菌、百日咳博德特氏菌、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、梭状芽孢杆菌、三叶梭状芽孢杆菌、三叶梭菌沙崎肠杆菌、成团肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、结核杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌、宋内志贺氏菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌等(美国专利公开No.US20170304829，其通过参引并入本文中)。
在一些实施方式中，可以被检测的病毒病原体包括但不限于疱疹病毒(例如，人巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒I(HSV-1)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒)、甲型流感病毒和丙型肝炎病毒(HCV)或小核糖核酸病毒比如柯萨奇病毒B3(CVB3)。其他病毒可以包括但不限于乙型肝炎病毒、HIV、痘病毒、肝炎病毒、逆转录病毒和RNA病毒比如黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、腺病毒、人类疱疹病毒、8型、人类乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、人类博卡病毒、细小病毒B19、人类星状病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸系统综合症病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。在一些实施方式中，病毒是包膜病毒。此类包膜病毒的示例包括但不限于属于下述病毒科中的一员的病毒：嗜肝病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、逆转录病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒的病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和沙粒病毒科。其他示例包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)、土拨鼠肝炎病毒、地松鼠(嗜肝病毒科)肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、苍鹭乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、人巨细胞病毒(HCMV)、小鼠巨细胞病毒(MCMV)、豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类疱疹病毒6(HHV变体A型和B型)、人类疱疹病毒7(HHV-7)、人类疱疹病毒8(HHV-8)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、B病毒痘病毒痘苗病毒、天花病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、骆驼痘病毒、小鼠脱脚病病毒、鼠痘病毒、兔痘病毒、浣熊痘病毒、传染性软疣病毒、口疮病毒、挤奶器节点病毒、牛乳头性口炎病毒、羊痘病毒、山羊痘病毒、块状皮肤病病毒、鸡痘病毒、金丝雀病毒、鸽痘病毒、麻疹病毒、粘液瘤病毒、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒、猪痘病毒、特纳河痘病毒、亚巴痘病毒、黄病毒登革热病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、GB肝炎病毒(GBV-A、GBV-B和GBV-C)、西尼罗河病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、玻瓦桑病毒、蜱传脑炎病毒、科萨努尔森林病病毒、披甲病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、基孔肯雅病毒、罗斯河病毒、马亚罗病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、逆转录病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)1型和2型、人类T细胞白血病病毒(HTLV)1型、2型和5型、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、慢病毒、冠状病毒、严重急性呼吸系统综合症(SARS)病毒、丝状病毒埃博拉病毒、马尔堡病毒、偏肺病毒(MPV)比如人偏肺病毒(HMPV)、弹状病毒狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、布尼亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、汉坦病毒、正粘病毒、流感病毒(A型、B型和C型)、副粘病毒、副流感病毒(PIV 1型、2型和3型)、呼吸道合胞病毒(A型和B型)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、沙粒病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳里托病毒、拉沙病毒、安帕里病毒、屈曲病毒、伊皮病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、拉丁病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、蓬塔撕裂病毒(PTV)、塔卡里伯病毒和塔密亚米病毒。在某些实施方式中，病毒是无包膜病毒，其示例包括但不限于属于下述病毒科中的一员的病毒：细小病毒科、圆环病毒科、多瘤病毒科、乳头瘤病毒科、腺病毒科、虹彩病毒科、呼肠孤病毒科的病毒、双RNA病毒科、杯状病毒科和小核糖核酸病毒科。具体示例包括但不限于犬细小病毒、细小病毒B19、猪圆环病毒1型和2型、BFDV(喙羽病病毒、鸡贫血病毒、多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、JC病毒、BK病毒、鹦鹉雏病病毒、人乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)1型、棉尾兔乳头瘤病毒、人腺病毒(HAdV-A、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E和HAdV-F)、禽腺病毒A、牛腺病毒D、青蛙腺病毒、呼肠孤病毒、人轮状病毒、人结肠病毒、哺乳动物正口病毒、蓝舌病毒、轮状病毒A、轮状病毒(B至G组)、科罗拉多蜱热病毒、水状病毒A、环病毒1、斐济病病毒、水稻矮缩病毒、水稻短节病病毒、虫源呼肠孤病毒属1、真菌呼肠孤病毒属1、双RNA病毒、法氏囊病病毒、胰腺坏死病毒、杯状病毒、猪水疱性皮疹病毒、兔出血性疾病病毒、诺沃克病毒、札幌病毒、小核糖核酸病毒、人脊髓灰质炎病毒(1-3)、人柯萨奇病毒(Bl-6(CB1-6))、人埃可病毒1-7、9、11-27、29-33、维柳式病毒、猿猴肠道病毒1-18(SEVI-18)、猪肠道病毒1-11(PEV1-11)、牛肠道病毒1-2(BEVI-2)、甲型肝炎病毒、鼻病毒、肝病毒、心脏病毒、口疮病毒和埃可病毒。病毒可能是噬菌体。噬菌体的示例包括但不限于T4噬菌体、TS噬菌体、λ噬菌体、T7噬菌体、G4、P1、
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、嗜热变形杆菌病毒1、M13、MS2、Qβ、
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X174、Φ29、PZA、Φ15、BS32、B103、M2Y(M2)、Nf、GA-1、FWLBc1、FWLBc2、FWLLm3、B4。参考数据库可以包含致病性、保护性或两者兼有的噬菌体的序列。在一些情况下，病毒选自黄病毒科的成员(例如，黄病毒属、瘟病毒属和肝炎病毒属的成员)，其包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒；蜱传病毒比如加德格兹谷病毒病毒、卡达姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、卡尔希病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫金病毒、绵羊跳跃病病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒比如米班病毒、索马里兹礁病毒和秋列尼病毒；蚊媒病毒比如阿娜病毒、登革热病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温得病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊列乌斯病毒、以色列火鸡脑膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒、塞皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄色发烧病毒；以及没有已知节肢动物载体的病毒比如恩德培蝙蝠病毒、横濑病毒、阿波依病毒、牛骨岭病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉萨蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达喀尔蝙蝠病毒、蒙大拿州肌炎白质脑炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝙蝠病毒和细胞融合剂病毒。在一些情况下，病毒选自沙粒病毒科的成员，其包括伊皮病毒、拉沙病毒(例如乔赛亚型、LP型或GA391毒株)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉丁裔病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕尔病毒和路约病毒。在一些情况下，病毒选自布尼亚病毒科的成员(例如汉坦病毒、内罗病毒、正布尼亚病毒和静脉病毒属的成员)，其包括汉坦病毒、辛诺布雷病毒、杜格贝病毒、布尼亚病毒、裂谷病毒谷热病毒、拉克罗斯病毒、蓬塔托罗病毒(PTV)、加利福尼亚脑炎病毒和克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒。在一些情况下，病毒选自丝状病毒科的成员，其包括埃博拉病毒(例如，扎伊尔株、苏丹株、象牙海岸株、雷斯顿株和乌干达株)和马尔堡病毒(例如，安哥拉株、Ci67株、穆索科株、波普株、Ravn株和维多利亚湖菌株)；披膜病毒科的成员(例如甲病毒属的成员)，其包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德比斯病毒、风疹病毒，塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴尔马森林病毒、奥尼永尼翁病毒、以及基孔肯雅病毒；痘病毒科的成员(例如，正痘病毒属的成员)，包括天花病毒、猴痘病毒和痘苗病毒；疱疹病毒科的成员，包括单纯疱疹病毒(HSV型；1型、2型和6型)、人类疱疹病毒(例如7型和8型)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)；正粘病毒科的成员，包括流感病毒(A型、B型和C型)例如H5N1禽流感病毒或H1N1猪流感；冠状病毒科的成员，包括严重急性呼吸系统综合症(SARS)病毒；弹状病毒科的成员，包括狂犬病病毒和水疱性口炎病毒(VSV)；副粘病毒科的成员，包括人类呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人类副流感病毒(例如，1型、2型、3型和4型)、鼻病毒和腮腺炎病毒；小核糖核酸病毒科的成员，包括脊髓灰质炎病毒、人类肠道病毒(A型、B型、C型和D型)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；嗜肝病毒科的成员，包括乙型肝炎病毒；乳头状病毒科的成员，包括人乳头瘤病毒；细小病毒科的成员，包括腺相关病毒；星状病毒科的成员，包括星状病毒；多瘤病毒科的成员，包括JC病毒、BK病毒和SV40病毒；钙病毒科的成员，包括诺沃克病毒；呼肠孤病毒科的成员，包括轮状病毒；逆转录病毒科的成员，包括人类免疫缺陷病毒(HIV；例如I型和2型)和人类T淋巴细胞病毒I型和II型(分别为HTLV-1和HTLV-2)。
在一些实施方式中，可以被检测的真菌包括但不限于曲霉属、芽生菌属、球孢子菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、副球孢子属、孢子丝菌属和至少三种接合菌属。在一些实施方式中，可以被检测的寄生虫包括疟原虫、利什曼原虫、巴贝虫、密螺旋体、疏螺旋体、锥虫、弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、疟原虫、锥虫属或军团菌。
结果数据
图34图示了本公开的示例性实施方式(称为“NucleinTM装置”)与替代性装置(“台式qPCR”，其为应用生物系统
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7500实时PCR机器)之间化脓性链球菌DNA片段的比较性扩增。
图35是图示了使用TaqMan探针和本公开的示例性实施方式对化脓性链球菌DNA区段进行的装置上检测的图。该图说明了PCR检测(以百分比表示的相对荧光)与PCR循环数目的关系。
各种应用
本文提供的实施方式可以用于广泛的应用领域，包括但不限于以下方面：健康、环境监测、基因组学、法医和研发、以及其他应用。
核酸
如前所述，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以用于检测任何类型的核酸等。对所有已知的生命形式均必不可少的核酸由可能含有核糖的核苷酸构成，在这种情况下，聚合物被称为RNA(核糖核酸)，或者核苷酸可能含有脱氧核糖，在这种情况下，聚合物被称为DNA(脱氧核糖核酸)，或者核苷酸也可能含有其他主链、包括合成主链比如苏糖、环己烯、乙二醇、锁式、肽、氟阿拉伯糖、1,5-脱水己糖醇等，并且统称为XNA(异核酸)。RNA的类型包括但不限于信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、rRNA(核糖体RNA)、信号识别颗粒RNA(SPR RNA)、转移信使RNA(tmRNA)、引导RNA(gRNA))、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(SmY)、小卡哈尔体特异性RNA(scaRNA)、核糖核酸酶P(RNase P)、核糖核酸酶MRP(RNase MRP)、Y RNA、端粒酶RNA组分(TERC)、剪接前导RNA(SL RNA)、反义RNA(aRNA、asRNA)、顺式天然反义转录本(cis-NAT)、CRISPRRNAcrRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、重复相关siRNA(rasi RNA)、7SK、增强子RNA(eRNA)、库RNA(vRNA)、卫星RNA、类病毒、逆转录转座子等。DNA可以是单链(ssDNA)或双链(dsDNA)、DNA的类型包括但不限于线粒体DNA和核DNA，其也可以表征为常染色体DNA、X-DNA和Y-DNA以及其他DNA类型，其中一些在本文中被引用。在一些实施方式中，本文所述的装置和方法可以用于检测其他所关注的分子标志物，例如蛋白质、抗体、碳水化合物、小分子、脂质和其组合比如脂蛋白。在一些实施方式中，用于检测这些非核酸生物标志物的方法是PLA(邻近连接测定)或IPCR(免疫PCR)。
核酸序列可以是天然存在的，或者核酸序列可以通过基因工程技术进行修饰，这将为从业者所熟知。此类技术可以包括相对于目标序列添加或删除核酸(在某些情况下，基本上同时添加或删除，以便替换核酸)，其中，改变通过多种方法进行，包括但不限于随机诱变、随机靶向技术(比如显微注射)或者经由靶向方法比如诱变、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)和Cas相关的可编程核酸内切酶比如改编自CRISPR的Cas9-guideRNA系统。这种以医学治疗为目标的技术被称为基因治疗。
本文描述的装置、设备和方法的实施方式也可以用于检测核酸类似物，其在结构上类似于天然存在的RNA和DNA。如先前所参引，此类类似物通常被称为异种核酸(或XNA)，并且此类类似物通常用于医学和分子生物学研究。虽然核酸含有磷酸骨架、戊糖(核糖或脱氧核糖)和核碱基(包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)，但核酸类似物可能会使上述各者中的任何一者发生改变。具体示例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
健康
对于人和动物，本文中描述的装置、设备和方法可以用于对与所关注的生物样品相关联的核酸的存在、不存在或数量进行检测，所关注的生物样品包括传染原，包括本文中公开的那些传染原比如病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫，以及与人类或其他动物感染相关联的宿主反应序列或基因表达模式。
在本文中描述的装置、设备和方法用于动物的情况下，这种用途可以包括但不限于与下述各者一起使用：宠物(例如猫、狗、鱼、鸟、兔子、仓鼠、老鼠、雪貂、豚鼠等)、牲畜(例如牛、鸡、火鸡、羊、猪等)、运动中使用的动物(例如赛马、犊牛、公牛和阉公牛等)、以及水产养殖中生产的鱼类(例如鲑鱼、鳕鱼、金枪鱼、鲱鱼、罗非鱼、鲶鱼等)以及任何其他动物。
此外，本文中提供的实施方式可以用于检测与传染性疾病相关联的核酸序列，(传染性疾病包括但不限于EBV、CMV、流感、支原体、梅毒、真菌和原生动物疾病、急性弛缓性脊髓炎、无形体病、炭疽病、巴贝虫病、肉毒杆菌病、布鲁氏菌病、弯曲杆菌病、耐碳青霉烯类感染、软性下疳、基孔肯雅病毒感染(Chikungunya)、衣原体、雪卡毒素(有害藻华(HABs))、艰难梭菌感染、产气荚膜杆菌(Epsilon毒素)、球孢子菌病真菌感染(谷热症)、克罗伊茨费尔特-雅各布病传染性海绵状脑病(CJD)、隐孢子虫病(Crypto)、环孢子虫病、登革热、1型2型3型4型(登革热)、白喉、大肠杆菌感染、志贺毒素产生(STEC)、东部马脑炎(EEE)、埃博拉出血热(Ebola)、埃立克体病、脑炎、虫媒病毒或副感染、肠道病毒感染、非脊髓灰质炎(非脊髓灰质炎肠道病毒)、肠道病毒感染、D68(EV-D68)、贾第虫病(Giardia)、腺体、淋球菌感染(淋病)、腹股沟肉芽肿、流感嗜血杆菌病、B型(Hib或H-流感)、汉坦病毒肺综合征(HPS)、溶血性尿毒症综合征(HUS)、甲型肝炎(Hep A)、乙型肝炎(Hep B)、丙型肝炎(Hep C)、丁型肝炎(Hep D)、戊型肝炎(Hep E)、疱疹、带状疱疹、带状疱疹VZV(带状疱疹)、组织胞浆菌病感染(Histoplasmosis)、人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感(Flu)、铅中毒、军团菌病(Legionnaires disease)、麻风病(Hansens disease)、钩端螺旋体病、李斯特菌病(Listeria)、莱姆病、性病性淋巴肉芽肿感染(LGV)、疟疾、麻疹、类鼻疽、脑膜炎、病毒性(脑膜炎、病毒性)、脑膜炎球菌病、细菌性(脑膜炎、细菌性)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、腮腺炎、诺如病毒、麻痹性贝类中毒(麻痹性贝类中毒、雪卡毒)、虱病(虱、头虱和体虱)、盆腔炎(PID)、百日咳(百日咳)、鼠疫；腺癌、败血症、肺炎(鼠疫)、肺炎球菌病(肺炎)、脊髓灰质炎(脊髓灰质炎)、鹦鹉热、鹦鹉热(鹦鹉热)、甲癣(螃蟹；阴虱感染)、脓疱性皮疹病(天花、猴痘、牛痘)、Q-发烧、狂犬病、蓖麻毒素中毒、立克次体病(落基山斑疹热)、风疹包括先天性风疹(德国麻疹)、沙门氏菌肠胃炎(沙门氏菌)、疥疮感染(Scabies)、鲭鱼中毒、败血症休克(败血症)、严重急性呼吸系统疾病(SARS)、志贺氏菌性胃肠炎(志贺氏菌)、天花、葡萄球菌感染、耐甲氧西林(MRSA)、葡萄球菌食物中毒、肠毒素-B中毒(葡萄球菌食物中毒)、葡萄球菌感染、万古霉素中间体(VISA)、葡萄球菌感染、抗万古霉素病原菌(VRSA)、链球菌病、A组(侵袭性)(Strep A(invasive))、链球菌病、B组(Strep-B)、链球菌中毒性休克综合征、STSS、中毒性休克(STSS、TSS)、梅毒、破伤风感染、破伤风(牙关紧闭症)、毛线虫病(毛线虫感染)、毛滴虫感染(旋毛虫病)、结核病(TB)、结核病(潜伏)(LTBI)、兔热病(兔热症)、伤寒症、D组、斑疹伤寒症、阴道病、细菌(酵母菌感染)、水烟相关肺损伤(电子烟相关肺损伤)、水痘(水痘)、霍乱弧菌(霍乱)、弧菌病(弧菌)、病毒性出血热(埃博拉型、拉沙型、马尔堡型)、西尼罗河病毒、黄热病、耶尔森氏菌(耶尔森氏菌)、寨卡病毒感染或任何其他传染病。本文提供的实施方式还可以用于检测与传染原比如细菌相关联的核酸，传染原包括但不限于肺炎球菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、链球菌、脑膜炎球菌、淋球菌、埃希氏菌、克雷伯菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、嗜血杆菌、耶尔森氏菌、李斯特菌、棒状杆菌、弧菌、梭状芽孢杆菌、沙眼衣原体、分枝杆菌、螺杆菌和密螺旋体；原生动物病原体等。本文中提供的实施方式还可以用于诊断癌症和其他疾病。在癌症的情况下，如前所述，这可以通过检测循环肿瘤DNA(ctDNA)来实现，该循环肿瘤DNA包含可以用于检测癌症的遗传变化。还可以通过鉴定与疾病相关的宿主反应序列或基因表达模式来检测癌症和其他疾病。
本文中提供的实施方式还可以用于检测在血液中自由流通的游离DNA(cfDNA)。cfDNA可能是比如用于遗传缺陷的检测的游离胎儿DNA。cfDNA可能是循环肿瘤DNA(ctDNA)，循环肿瘤DNA包含用于检测癌症的遗传变化。ctDNA可以用于诊断、预后、监测治疗和估计受试者的肿瘤体积(Fiala和Diamandis，BMC Medicine第17卷，文章编号：159(2019)。cfDNA可以根据血液的样本来分析。在一些实施方式中，该过程还包括在根据游离DNA准备测序库之前从血浆成分中去除血清蛋白。在一些实施方式中，从血浆成分去除血清蛋白包括使血浆成分经过支持基质，支持基质吸附了血清蛋白(US10017807)。在其他实施方式中，可以在不准备测序库的情况下直接分析cfDNA，例如通过对具有高片段化、低分子量cfDNA的短序列(例如，小于50碱基对、75碱基对、100碱基对、125碱基对、150碱基对、175碱基对或200碱基对)进行筛选并且通过使用差异引物与通用引物结合来检测序列差异以区分SNP(例如参见Woods-Bouwens等人，Single-Color Digital PCR Provides High-PerformanceDetection of Cancer Mutations from Circulating DNA.分子诊断学杂志，第19卷，第5期，2017年9月，其通过参引并入本文中)。
在本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以通过将为从业者所知的方法来确定血型。在一些实施方式中，可以通过使用多重等位基因特异性引物组检测三个单核苷酸多态性(SNP)位点(核苷酸261、526和803)来进行ABO血型分型，这些位点可以识别A、B、O01/O02、O03和cis-AB01等位基因或其他SNP位点，以用于检测稀有A亚型或B亚型(Lee等人，Rapid Direct PCR for ABO Blood Typing(ABO血型分型的快速直接PCR)，Journal ofForensic Sciences(法医学杂志)，56(s1)：S179-S182，2011年；Chen等人，Rapid rare ABOblood typing using a single PCR based on a multiplex SNaPshot reaction(使用基于多重SNaPshot反应的单一PCR进行快速稀有ABO血型分型)，118(1):395-400,2019)。这种确定通常对时间非常敏感，并且准确性至关重要。以低成本提供此类确定也是允许在广泛基础上做出此类决定的重要考虑因素。
此外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以在预防性的基础上由任何患者、医生或组织使用，包括但不限于健康保险公司、企业和政府组织(特别是那些具有需要高水平的人员可用性，包括但不限于军队、安全部队、执法机关、治安官员、空中交通管制员和其他重要人员)，上述这些人员希望主动监控以确定个人是否有意或无意感染特定病原体、是否处于感染上特定病原体的增加的风险下(例如，由于获得性、先天性或其他类型的免疫缺陷)、或者是否处于患上特定疾病的风险下(例如，由于协同共感染、遗传或表观遗传倾向或其他因素)。
此外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以用于快速确定基因治疗的功效(例如通过测试各个组织、器官、器官系统或个体在不同的时间点处遗传转化的存在、不存在或程度，或者间接地通过测量与免疫反应相关的标志物)。这种快速确定对于允许快速调整治疗方案很重要。
此外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以用于通过检测各种基于血液的生物标志物的增加的基因表达来快速确定某人是否遭受脑震荡。在一些实施方式中，基于血液的生物标志物包括但不限于用于星形胶质细胞损伤的S100β、用于轻度创伤性脑损伤的神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、用于神经元损伤的神经元特异性烯醇化酶(NSE)、用于轻度创伤性脑损伤的泛素C-末端水解酶(UCH-L1)、用于轴突损伤的alpha-II血影蛋白裂解产物、用于轴突损伤的Tau蛋白和用于轴突损伤的神经丝(Papa，Potential Blood-Based Biomarkers for Concussion(潜在的基于血液的脑震荡生物标志物)，Sports MedArthrosc(运动医学和关节镜术评论)，24(3)：108-115,2016)。
本文中描述的装置、设备和方法的实施方式进一步提供了与人类和动物健康相关的大量额外用途，这对于从业者而言将是明显的。
其他数据的整合
在本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以与软件应用程序结合使用以主动监测增加的感染风险、以及如果需要的话主动建议潜在用户使用本文中描述的装置、设备和方法的实施方式来测试一种或更多种感染的存在。
可以通过考虑多种因素来执行这种上述监测，这些因素可以由本文中描述的装置、设备和方法的实施方式或者通过这些装置与其他装置之间的通信收集比如可穿戴技术(例如，
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Oura
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等)和音频监测技术(例如，智能手机、
Figure BDA0003189920900001053
等)直接收集。此类因素可以包括但不限于以下各者：当前的免疫系统功能(例如直接测量或通过生理体征推算，或其组合)、一年中的时间、旅行史、已知或疑似暴露、当前和历史流行病学模式、特别地包括本地模式或者替代性地某人最近与其直接或间接接触的朋友和家人之间的模式。此类信息也可以通过直接输入或通过间接方法获得，比如设计算法来分析社交媒体、电子邮件内容、旅行历史和电子日历内容。
可以考虑的其他信息包括但不限于任何医学相关的生物特征数据比如心率、心率变化性、血流中的氧饱和度水平、温度、血压、呼吸率、皮肤电反应、脉搏血氧测定、语音调制(特别是与已知基线的差异)或其他可听数据，其他可听数据可以包括咳嗽、打喷嚏、喘息、啰音、肺部爆声、上呼吸道声音比如喘鸣、呼吸暂停期、胃肠道紊乱、症状的口头讨论以及整体活动水平(特别是与基线的差异)比如总活动或步态的变化，无论其是测量的(例如通过体动记录仪)还是报告的。
通过对包括但不限于上述各者的因素的分析，在认为感染或疾病的风险(例如，以阴性预测值或阳性预测值衡量)已超过一定阈值的情况下、比如超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％、或更优选地超过91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的情况下，本文中描述的设备或装置的特定实施方式可以通过执行使用从业者熟知的方法设计的特定算法来自动排序。此类命令可以通过邮件完成，或者此类命令可以通过快速交付模式而加速，包括但不限于在期望更快交付速度的情况下可以由任何数目的加速零售服务(例如，Prime NowTM)提供的速递或无人机交付。
此外，在本文中描述的装置或设备的实施方式是在考虑上述数据之前使用的情况下，可以追溯地使用这些数据以进一步提高结果的准确性。例如，如果测试结论为样本对罕见疾病比如霍乱或埃博拉呈阳性，但该样本来自与此类罕见疾病没有明显暴露途径的来源，并且在其他方面没有任何压力或疾病的迹象(例如，生物特征数据未表明急性病理)，这将增加测试结果错误的可能性。替代性地，如果测试结果有些不确定(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高程度的不确定)，并且生物特征数据表明感染，这将增加感染实际存在的可能性，并且此类信息可以合并到决定测试结果的算法中。在其他实施方式中，此类数据可以用于调节测试的预测试概率以及正负预测值。
基因组学
除了上面提到的那些之外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式可以用于基因组学的领域。例如，用途可以包括通过将被从业者较好理解的方法确定一个人的血统或动物的品种(不仅对于活体动物而且对于来自死去动物的肉)。在一些实施方式中，用途可以包括区分鹿的肉与牛、山羊、水牛、狗和绵羊的肉以及区分腐烂的肉(Rajapaksha等人，J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,49(7):322-4,2002，其通过参与并入本文中)。在一些实施方式中，用途包括区分狗的品种(Ezer等人，87(6):450-5,1996，其通过参与并入本文中)和牛的品种(Yoon等人，Asian-Australas J Anim Sci,18(10),2005,其通过参与并入本文中)。用途可以包括检测线粒体SNA中的SNP模式以追踪母系祖先。类似地，用途可以包括快速亲子鉴定或产科测试，或建立其他家庭关系，比如兄弟姐妹、祖母、祖父、堂兄、阿姨、叔叔、侄子、侄女或其他亲属关系。此类测试在家庭关系存在疑问的对时间敏感的情况比如包括移民或其他执法情况在内的情况中可能特别重要。在人类基因组中的某些位置(称为基因座)存在可预测的遗传模式，已经发现这些模式可以用于确定身份和生物学关系。这些基因座包含短串联重复序列(STR)，并且在每个人身上发现的标记大小(markersize)的组合构成了他/她独特的遗传图谱。分析可以包括Y染色体分析或线粒体分析。利用本文中描述的装置、设备和方法的实施方式进行这种测试的方法将被从业者很好地理解。
此外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式的用途包括鉴定特定生物学或医学相关的非传染性核酸序列的存在、不存在或数量。这些可以包括但不限于特别关注的基因和基因突变。例如，测试可以用于确定一个人或动物或其他生物体是否是基因携带者(或遗传携带者)，这意味着其遗传了遗传性状或突变的隐性等位基因，同时显示出很少或没有疾病的特征或症状(或者，在一些实施方式中，表观遗传性变化或部分或不完全显性或印记的情况)。此类携带者可以是常染色体显性-隐性携带者或性染色体遗传携带者，或者此类携带者可以表现出中间的、不完全、部分的或其他形式的遗传优势、包括印记或表观遗传调节、以及不同程度的表型外显。遗传疾病的遗传隐性等位基因的示例包括但不限于对于下述各者的那些遗传隐性等位基因：唐氏综合症、镰状细胞性贫血、囊性纤维化、血友病、马凡氏综合征、杜氏肌营养不良症、脊髓性肌营养不良症、泰萨克斯病、脆性X综合征、GJB2相关听力损失、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、卡纳万病、家族性自主神经功能障碍、布卢姆综合征、范可尼贫血C组、戈谢病、IV型粘脂贮积症、尼曼-匹克病A型、糖原贮存病1a型、和枫糖浆尿病(MSUD)、包括经典重度MSUD、中度MSUD、间歇性MSUD、硫胺素反应性MSUD和E3缺乏性MSUD伴乳酸酸中毒以及例如由Orph anet编入的许多罕见疾病，(在https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/Diseas e.php上更新并且可找到，其通过参引并入本文中)。
本文中所述的装置、设备和方法可以用于检测的生物学或医学相关核酸序列的其他示例可以支持个性化医疗，例如以识别与药物反应相关的基因，(包括但不限于布洛芬代谢、奥美拉唑代谢、假胆碱酯酶缺乏症和恶性高热)。
本文中所述的装置、设备和方法可以用于鉴定的生物学或医学相关核酸序列的其他示例包括与各种健康特征相关的那些核酸序列，包括与常见的基因序列和罕见突变相关的基因。特定特征的示例可以包括但不限于酒精潮红反应、特应性皮炎、乳糖酶持续存在、面容失认症、睡眠相关基因(特别是允许个体睡眠明显少于每晚大约八小时比如睡眠四个小时至六个小时但仍然感到得到休息的那些基因比如ADRB1基因和DEC2基因)、RPE65基因、以及从业者将知道的其他特征。其他示例包括与疾病相关的基因、比如通过参引并入本文中的美国医学遗传学和基因组学学院的出版物“ACMG Recommendations for Reportingof Incidental Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing(对于临床外显子组和基因组测序中偶然发现的报告的ACMG建议)”的末尾处的列表上列出的那些“待报告的变体”，其非限制性示例包括：BRCA1、BRCA2、TP53、STK11、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、VHL、MEN1、RET、NTRK1、PTEN、RB1、SDHD、SDHAF2、SDHC、SDHB、TSC1、TSC2、WT1、NF2、COL3A1、FBN1、TGFBR2、SMAD3、ACTA2、MYLK、MYH11、MYBPC3、MYH7、TNNT2、TNNI3、TPM1、MYL3、ACTC1、PRKAG2、GLA、MYL2、LMNA、RYR2、PKP2、DSP、DSC2、TMEM43、DSG2、KCNQ1、KCNH2、SCN5A、LDLR、APOB、PCSK9、RYR1、CACNA1S等。
取证
本文中所述的装置、设备和方法也可以用于与犯罪的检测或调查有关的法医学领域。与法医分析相关的特定非限制性示例包括用于通过从业者将已知的基因谱分析或基因指纹识别方法来识别死者或动物的遗骸，通过检查死后发生的基因表达的变化来确定死亡时间，以及确定特定嫌疑人或犯罪受害者(例如，谋杀受害者或绑架受害者等)是否曾出现在特定地点。在下述情况中将有助于此类确定：先前已经使用将为从业者所知的方法收集和剖析了所讨论的个体的已知样本，在这种情况下，可以进行基因匹配过程。
环境
本文中所述的装置、设备和方法还可以用于检测存在于环境样品中的核酸序列。可以从中收集样品的环境来源可以包括海水或淡水(非限制性示例包括湖泊、河流、池塘、溪流和雨水)、陆地土壤、水生土壤或沉积物、雪、永久冻土或空气。
环境相关用途的示例包括检测可能与所关注的特定生物体相关联的所关注的核酸序列(比如来自环境DNA或“eDNA”)的存在、不存在或数量。示例来源可以包括但不限于粪便、粘液、配子、脱落的皮肤、抚摸和毛发以及本文中所述的其他来源，并且可以通过将为从业者所知的方法对这些示例来源进行分析。此类分析支持在无需收集活的或已死亡的有机体的情况下进行生物监测，并且除了检测常见物种外还可以用于检测入侵的、难捉摸的或濒临灭绝的物种。此类信息在研究种群规模、物种分布和一般种群动态时是特别有用的。
本文中所述的装置、设备和方法还可以用于通过对环境来源测试相关联的DNA(使用将为从业者所知的方法)来确定传染原比如寄生虫、细菌和病毒的存在或不存在，传染原中的许多先前已在本文中具体引用。以此方式，可以在传播发生之前识别和避免潜在的传染原。作为非限制性示例，水传播疾病是一个重要的健康问题，特别是在发展中国家。水传播疾病的示例可以包括但不限于以下各者：伤寒、霍乱、贾第鞭毛虫、痢疾、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌和甲型肝炎。通过使用本文中所述的装置、设备和方法，可以在使用前对水进行测试以确保其不含传染原、确保传染原存在，或在一些实施方式中，样品高于或低于最小传染剂量(MID)。
与上文描述的类似，本文中描述的装置、设备和方法可以使用将为从业者所知的方式以测试与家中和家周围的传染原相关联的核酸序列的存在或不存在，特别地包括但不限于，测试住宅井水和水池以及测试霉菌、孢子和真菌样本以确定潜在的毒性。
可以进行进一步的环境分析，本文中描述的装置、设备和方法可以由市政当局或其他政府组织以将为从业者所知的方式用于测试与由下述各者携带的下述各种媒介传播疾病相关联的核酸序列的存在或不存在：蚊子(非限制性示例包括基孔肯雅热、登革热、淋巴丝虫病、裂谷热、黄热病、寨卡病毒、疟疾、日本脑炎和西尼罗河热)、白蛉(非限制性示例为利什曼病和白蛉热)、蜱(非限制性示例包括克里米亚-刚果出血热、莱姆病、回归热[疏螺旋体病]、立克次体病[斑疹热和Q热]、蜱传脑炎和兔热病)、锥虫(非限制性示例包括查加斯病[美国锥虫病])、采采蝇(非限制性例子包括昏睡病[非洲锥虫病])、跳蚤(非限制性例子包括鼠疫和立克次体病)、黑蝇(非限制性示例包括盘尾丝虫病[河盲症])、水生蜗牛(非限制性示例包括血吸虫病[血吸虫病])和虱子(非限制性示例包括斑疹伤寒和虱传回归热)。可以由市政当局或其他政府组织利用本文中所述的装置、设备和方法进行的另外的环境分析是基础设施泄漏的定位。此类检测可以通过使用对此类生物体的密度进行迭代量化的过程以定位泄漏(例如，相关生物体的密度越高，则泄漏越近)来检测与此类基础设施泄漏相关的生物体的核酸序列来实现。
除了上面提到的示例之外，本文中描述的装置、设备和方法可以以将为从业者所理解的方式用于确定食物源是否已经被基因改造，无论该食物源是植物还是动物。
此外，本文中所述的装置、设备和方法可以以将为从业者所知的方式用于确定食源性病原体是否存在于食物本身中或是存在于准备食物的区域中比如住宅或商业厨房或其他食物准备场所。
附加实施方式
与其他常用的核酸检测方法不同，本文所述的装置、设备和方法为个人提供了在无需第三方参与的情况下私下进行检测和接收结果的机会。此外，在一些实施方式中，可以在无需与外部位置、服务器、数据储存库或类似装置进行任何数据通信的情况下执行测试并接收结果。这与其他常见选择方案相比提供了关于健康记录的更高级别的隐私和安全性。部分地，这是因为本文中描述的装置、设备和方法在一些实施方式中可以在便携的基础上工作，从而允许在无需数据连接或其他装备的情况下在独立的基础上执行测试。这也是由于本文中描述的装置、设备和方法不需要特定的技术技能或专门的培训来实施，使得普通公众能够在没有第三方辅助的情况下操作该装置、设备。
本文中描述的装置、设备和方法也可以以使得所包括的软件和硬件可以内部验证自身的方式操作。例如，在一些实施方式中，软件可以包括数据可以与之比较的对于方差或操作参数的参考值。在其他实施方式中，数据的量值或特征(例如，数据的随机或不连续变化)可以用于识别与合理有效数据不一致的数据。
此外，在需要时，本文中描述的装置、设备和方法可以与将为从业者所知的数字通信技术结合使用，这可以在如果无法立即找到经过适当培训的医疗专业人员的情况下实质上允许包括医生(MD)、医师助理(PA)、高级执业注册护士(APRN)、注册护士或其他经过适当培训的医疗专业人员。在各种实施方式中，此类数字通信技术包括有线通信技术(例如，通用串行总线、以太网)和/或无线通信技术。在各种实施方式中，此类无线通信技术包括任何适合的无线通信协议网络比如无线电话网络(例如，GSM、CDMA、LTE等)、Wi-Fi网络(IEEE802.11标准)、WiMAX网络、蓝牙网络等。附加地或替代性地，此类无线通信技术包括能够操作成使用近场通信标准(例如，ISO/IEC 18092、由NFC论坛提供的标准等)进行通信的电路。这种包含可以允许立即审查测试结果，并且在适当的情况下允许提供处方。将为从业者所知的特定算法可以提供剂量指南，并且这些算法可以使用下述各项来考虑患者的医疗状况：本文中描述的生物特征数据以及患者的过敏症、其他药物和整体医疗状况、以及与患者当时或即将所处的特定地理区域相关的考虑因素。
在本文中描述的装置、设备和方法的各种实施方式中，可以存储进行独特标识的或可以用于标识特定人的个人信息。此类个人信息包括但不限于姓名、地址、人口统计数据、基于位置的数据、实际地址、电子地址、与用户健康或健康水平相关的数据或记录(例如，生命体征测量、药物信息、锻炼信息)、出生日期等。在各种实施方式中，此类个人信息数据的收集、分析、公开、传输、存储或其他使用将遵守完善的隐私政策和/或隐私惯例(例如，加密存储、散列等)。在各种情况下，政策和惯例应当适应正被收集和/或访问的特定类型的个人信息数据并且应当适应适用的法律和标准，包括适应可能有助于实施更高标准的特定于管辖区的考虑因素。例如，在美国，某些健康数据的收集或访问可能受联邦和/或州法律管辖，比如健康保险流通与责任法案(HIPAA)；而在其他国家健康数据可能会受到其他法规和政策的约束并且应当进行相应处理。
此外，本文中描述的装置、设备和方法的实施方式通过对与某些伴随生物标志物匹配的核酸序列进行测试而可以用作伴随诊断测试，伴随诊断测试可以用作治疗药物的伴随结果以确定治疗药物对特定人的适用性。非限制性示例是针对癌症突变(例如BCR-ABL易位)、对某些药物或疗法的超敏反应或不适合性(例如恶性高热)、疾病状态与潜在药征的交叉点(例如在预期治疗中检测心丝虫)、PIK3CA基因的突变的生物标志物、以及在通过参引并入本文中的“FDA已通过或批准的伴随诊断装置(体外和成像工具)列表”中列出的那些疾病的生物标志物，所述那些疾病例如急性髓性白血病、侵袭性系统性肥大细胞增多症、B细胞慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、宫颈癌、慢性粒细胞白血病、结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌和胃食管癌、胃食管交界处腺癌、胃肠道间质瘤、头颈部鳞状细胞癌细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征/骨髓增生性疾病、非小细胞肺癌、非输血依赖性地中海贫血、卵巢癌、三阴性乳腺癌(TNBC)或尿路上皮癌等。
最后，结合在本文中描述的装置、设备和方法的实施方式，可以采用将为从业者所知的算法来开发流行病学预测和模式，流行病学预测和模式在对于疾病遏制的主动性准备方面会是有价值的。
根据本公开，本文中公开和要求保护的所有装置和/或方法可以在没有过多的实验的情况下制备和执行。尽管已经根据优选实施方式描述了本发明的结构和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文中所述的方法和/或方法的步骤或方法的步骤顺序进行变型。更具体地，将明显的是，化学和生理学相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。本文公开的所有示例均为非限制性示例。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似替代和修改都被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (167)

1.一种用于执行分子诊断的设备，所述设备包括：
壳体，所述壳体包括第一端部和第二端部；
活塞，所述活塞设置在所述壳体内；
第一热源，所述第一热源靠近所述壳体的所述第一端部；以及
致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从靠近所述壳体的所述第一端部的第一位置移动至靠近所述壳体的所述第二端部的第二位置、并返回至靠近所述壳体的所述第一端部的所述第一位置。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，在循环期间，流体沿与所述活塞相反的方向移动。
3.根据权利要求1所述的设备，还包括靠近所述壳体的所述第二端部的第二热源。
4.根据权利要求3所述的设备，其中：
所述第一热源包括第一加热线圈，所述第一加热线圈配置成当向所述第一加热线圈施加电流时使所述壳体的所述第一端部的温度增加；并且
所述第二热源包括第二加热线圈，所述第二加热线圈配置成当向所述第二加热线圈施加电流时使所述壳体的所述第二端部的温度增加。
5.根据权利要求1所述的设备，还包括构造成插入到所述壳体中的反应腔室插入件。
6.根据权利要求5所述的设备，其中，所述反应腔室插入件在使用期间包含反应流体。
7.根据权利要求6所述的设备，其中，所述反应流体在使用期间不接触所述活塞和所述壳体。
8.根据权利要求1所述的设备，其中，所述壳体包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增。
9.根据权利要求8所述的设备，其中，所述核酸是DNA。
10.根据权利要求8所述的设备，其中，所述核酸是RNA。
11.根据权利要求8所述的设备，其中：
所述活塞构造成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述壳体的所述第二端部；并且
所述活塞构造成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述壳体的所述第一端部。
12.根据权利要求8所述的设备，其中，所述流体包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。
13.根据权利要求8所述的设备，还包括照射模块，所述照射模块配置成照射所述流体中包含的分析物。
14.根据权利要求13所述的设备，还包括检测模块，所述检测模块配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的响应进行检测。
15.根据权利要求14所述的设备，其中，所述检测模块在扩增期间对来自所述分析物的响应进行实时检测。
16.根据权利要求15所述的设备，其中，所述检测模块在扩增循环内对来自分析物的响应进行检测。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，所述扩增循环具有可变长度。
18.根据权利要求1所述的设备，还包括控制器，所述控制器配置成控制所述致动器和所述第一热源。
19.根据权利要求18所述的设备，其中，所述控制器配置成：
将所述第一热源控制成将靠近所述壳体的所述第一端部的流体加热至约92摄氏度与98摄氏度之间的温度；
将所述第二热源控制成将靠近所述壳体的所述第二端部的流体加热至约60摄氏度与65摄氏度之间的温度；以及
使所述活塞从所述第一位置至所述第二位置并返回至所述第一位置循环约30个循环至50个循环。
20.根据权利要求1所述的设备，其中，所述致动器包括：
至少一个线圈；以及
设置在所述壳体内的磁性元件，其中，所述至少一个线圈配置成当向所述至少一个线圈施加电流时对所述磁性元件施加力。
21.根据权利要求1所述的设备，其中，所述致动器包括：
第一线圈，所述第一线圈靠近所述壳体的所述第一端部；
第二线圈，所述第二线圈靠近所述壳体的所述第二端部；以及
设置在所述壳体内的第一磁性元件；以及
设置在所述壳体内的第二磁性元件，其中：
所述第一线圈配置成当向所述第一线圈施加电流时对所述第一磁性元件施加第一力；并且
所述第二线圈配置成当向所述第二线圈施加电流时对所述第二磁性元件施加第二力。
22.根据权利要求21所述的设备，其中：
所述第一线圈配置成当向所述第一线圈施加电流时使所述壳体的所述第一端部的温度增加；并且
所述第二线圈配置成当向所述第二线圈施加电流时使所述壳体的所述第二端部的温度增加。
23.根据权利要求1所述的设备，还包括与所述壳体流体连通的输入端口。
24.根据权利要求23所述的设备，其中，所述输入端口包括配置成推进样本的收集活塞。
25.根据权利要求1所述的设备，其中，所述壳体包括冻干微丸。
26.根据权利要求1所述的设备，其中：
所述活塞具有外径；
所述壳体有内径；并且
所述活塞的所述外径与所述壳体的所述内径的比率在0.90与0.999之间。
27.根据权利要求1所述的设备，其中，所述活塞包括通道。
28.根据权利要求1所述的设备，其中，所述通道是中央毛细通道，所述通道具有能够为0.3mm至2mm的直径。
29.根据权利要求1所述的设备，其中，所述通道是中央毛细通道，所述通道具有1mm的直径。
30.一种使用于复制核酸的流体进行热循环的方法，所述方法包括：
使设置在壳体内的活塞从所述壳体的第一端部移动至所述壳体的第二端部，其中，在所述壳体内设置有流体，并且其中，所述流体包括用于复制核酸的组分；
使所述壳体内的所述流体从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的第一端部；
将所述流体的温度控制在第一温度范围处持续第一时间段；
使所述活塞从所述壳体的所述第二端部移动至所述壳体的第一端部；
使所述壳体内的所述流体从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的第一端部；以及
将所述流体的温度控制在第二温度范围处持续第二时间段。
31.根据权利要求30所述的方法，其中：
所述活塞包括通道；以及
使所述壳体内的所述流体从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的所述第一端部包括引导所述流体穿过所述通道。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述活塞中的所述通道是中央通道。
33.根据权利要求30所述的方法，其中：
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的所述第一端部移动至所述壳体的所述第二端部包括向线圈施加电流并且对设置于所述壳体内的磁性元件施加力。
34.根据权利要求32所述的方法，其中：
所述线圈是靠近所述壳体的所述第一端部的第一线圈；
所述磁性元件是设置在所述活塞与所述壳体的所述第一端部之间的第一磁性元件；以及
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的所述第二端部移动至所述壳体的所述第一端部包括向靠近所述壳体的所述第二端部的第二线圈施加电流并且对设置在所述活塞与所述壳体的所述第二端部之间的第二磁性元件施加力。
35.根据权利要求30所述的方法，其中：
将所述流体的温度控制在所述第一温度范围处持续所述第一时间段包括向靠近所述壳体的所述第一端部的第一加热线圈施加电流；以及
将所述流体的温度控制在所述第二温度范围处持续所述第二时间段包括向靠近所述壳体的所述第二端部的第二加热线圈施加电流。
36.根据权利要求30所述的方法，其中：
所述第一温度范围在约92摄氏度与98摄氏度之间，并且所述第二温度范围在约60摄氏度与65摄氏度之间；
所述第一时间段在4秒与6秒之间；并且
所述第二时间段在8秒与12秒之间。
37.根据权利要求30所述的方法，其中，所述活塞从所述第一位置至所述第二位置并返回至所述第一位置循环约30个循环至50个循环。
38.一种分析生物样本的方法，所述方法包括：
将所述生物样本放置在诊断设备内；
将所述生物样本裂解；
将试剂引至所述生物样本；以及
操作所述诊断设备以使所述生物样本热循环，其中，所述诊断设备包括：
壳体，所述壳体包括第一端部和第二端部；
活塞，所述活塞设置在所述壳体内；
第一热源，所述第一热源靠近所述壳体的第一端部；
第二热源，所述第二热源靠近所述壳体的第二端部；以及
致动器，所述致动器构造成使所述活塞在靠近所述壳体的所述第一端部的第一位置至靠近所述壳体的所述第二端部的第二位置之间移动、并且返回至靠近所述壳体的所述第一端部的所述第一位置。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述试剂包括用于复制所述生物样本中的核酸的试剂。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，操作所述诊断设备以使所述生物样本热循环包括：
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的第一端部移动至所述壳体的第二端部；
使所述生物样本和所述试剂从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的所述第一端部；
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的所述第二端部移动至所述壳体的所述第一端部；
并且使所述生物样本和所述试剂从所述壳体的所述第一端部移位至所述壳体的所述第二端部；
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的第一端部移动至所述壳体的第二端部；并且
使所述生物样本和所示试剂从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的所述第一端部，其中：
所述壳体的所述第一端部被控制至第一温度范围内的温度；并且
所述壳体的所述第二端部被控制至第二温度范围内的温度。
41.根据权利要求40所述的方法，其中：
所述活塞包括通道；
使所述壳体内的所述流体从所述壳体的所述第二端部移位至所述壳体的所述第一端部包括引导所述流体沿第一方向穿过所述通道；以及
使所述壳体内的所述流体从所述壳体的所述第一端部移位至所述壳体的所述第二端部包括引导所述流体沿与所述第一方向相反的第二方向穿过所述通道。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述活塞中的所述通道是中央通道。
43.根据权利要求40所述的方法，其中：
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的所述第一端部移动至所述壳体的所述第二端部包括向线圈施加电流并对设置在所述壳体内的磁性元件施加力。
44.根据权利要求43所述的方法，其中：
所述线圈是靠近所述壳体的所述第一端部的第一线圈；
所述磁性元件是设置在所述活塞与所述壳体的所述第一端部之间的第一磁性元件；以及
使设置在所述壳体内的所述活塞从所述壳体的所述第二端部移动至所述壳体的所述第一端部包括向靠近所述壳体的所述第二端部的第二线圈施加电流并对设置在所述活塞与所述壳体的所述第二端部之间的第二磁性元件施加力。
45.根据权利要求40所述的方法，其中：
控制所述壳体的所述第一端部的温度包括向靠近所述壳体的所述第一端部的第一加热线圈施加电流；以及
控制所述壳体的所述第二端部的温度包括向靠近所述壳体的所述第二端部的第二加热线圈施加电流。
46.根据权利要求45所述的方法，其中：
所述第一温度范围足以将所生物样本和所述试剂加热至约92摄氏度与98摄氏度之间的第一样本温度；
所述第二温度范围足以将所述生物样本和所述试剂加热至约60摄氏度与65摄氏度之间的第二样本温度；
将所述生物样本和所述试剂保持在所述第一样本温度处持续4秒与6秒之间的时间；并且
将所述生物样本和所述试剂保持在所述第二样本温度处持续8秒与12秒之间的时间。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述生物样本和所述试剂从所述第一样本温度至所述第二样本温度并返回至所述第一样本温度循环约30个循环至50个循环。
48.一种分析生物样本的方法，所述方法包括：
将所述生物样本放置在诊断设备内；
将限定体积的所述生物样本与限定体积的流体组合以产生限定体积的生物样本流体混合物；以及
操作所述诊断设备以使所述生物样本流体混合物进行热循环，其中，所述诊断设备包括：
壳体，所述壳体包括活塞腔室；
活塞，所述活塞设置在所述活塞腔室内；
第一热源，所述第一热源靠近所述活塞腔室；以及
致动器，所述致动器构造成使所述活塞在靠近所述第一热源的第一位置与远离于所述第一热源的第二位置之间移动。
49.根据权利要求48所述的方法，其中：
所述壳体包括第一端部和第二端部；
所述活塞的所述第一位置靠近所述壳体的所述第一端部；并且
所述活塞的所述第二位置靠近所述壳体的所述第二端部。
50.根据权利要求48所述的方法，其中，在将所述生物样本放置在所述诊断设备内之前不对放置在所述诊断设备内的所述生物样本的体积进行测量。
51.根据权利要求48所述的方法，其中，所述流体包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。
52.根据权利要求48所述的方法，其中，所述流体包括裂解剂。
53.根据权利要求48所述的方法，其中，所述流体包括稀释剂。
54.根据权利要求48所述的方法，其中，所述限定体积的所述生物样本经由压力差被引入所述限定体积的所述流体。
55.根据权利要求51所述的方法，其中，所述限定体积的所述流体处于比所述限定体积的所述生物样本高的压力。
56.根据权利要求51所述的方法，其中，所述限定体积的所述流体处于比所述限定体积的所述生物样本低的压力。
57.根据权利要求48所述的方法，其中，所述限定体积的所述流体经由用户提供的手动动力被引入所述限定体积的所述生物样本。
58.根据权利要求48所述的方法，其中，所述限定体积的所述流体在没有电力的情况下被引入所述限定体积的流体。
59.根据权利要求48所述的方法，其中，所述限定体积的所述生物样本在没有电力的情况下被引入所述限定体积的流体。
60.根据权利要求48所述的方法，其中，所述限定体积的所述生物样本经由带螺纹部件的旋转被引入所述限定体积的流体。
61.根据权利要求48所述的方法，其中：
所述诊断设备包括收集腔室；并且
将所述生物样本放置在所述诊断设备内包括在所述收集腔室中进行咳出。
62.根据权利要求48所述的方法，其中：
所述诊断设备包括收集腔室；并且
将所述生物样本放置在所述诊断设备内包括将拭子放置在所述收集腔室中。
63.根据权利要求62的方法，其中，所述拭子包含稀释液体。
64.一种设备，包括：
壳体，所述壳体包括活塞腔室；
活塞，所述活塞位于所述活塞腔室中；
第一热源，所述第一热源靠近所述活塞腔室；
致动器，所述致动器构造成使所述活塞在靠近所述第一热源的第一位置与远离于所述第一热源的第二位置之间移动；以及
杆组件，所述杆组件联接至所述壳体，其中：
所述杆组件包括样本腔室和流体腔室；
所述样本腔室在所述杆组件处于第一位置时与所述活塞腔室流体连通；
所述流体腔室在所述杆组件处于第二位置时与所述活塞腔室流体连通；并且
所述样本腔室和所述流体腔室在所述杆组件处于第三位置时不与所述活塞腔室流体连通。
65.根据权利要求64所述的设备，其中：
所述壳体包括第一端部和第二端部；
所述活塞的所述第一位置靠近所述壳体的所述第一端部；并且
所述活塞的所述第二位置靠近所述壳体的所述第二端部。
66.根据权利要求64所述的设备，其中，所述活塞处于真空。
67.根据权利要求64所述的设备，还包括构造成用于收集生物样本的收集腔室。
68.根据权利要求67所述的设备，还包括传感器，所述传感器配置成对所述收集腔室中的生物样本进行检测。
69.根据权利要求68所述的设备，其中，所述传感器是光学传感器。
70.根据权利要求68所述的设备，其中，所述传感器检测导电性的变化。
71.根据权利要求68所述的设备，其中，所述设备在所述传感器检测到所述收集腔室中的生物样本时使所述杆组件自动地移动。
72.根据权利要求64所述的设备，其中，所述杆组件以螺纹的方式联接至所述壳体。
73.根据权利要求72所述的设备，其中，通过使所述杆组件的至少一部分旋转，所述杆组件能够从所述第一位置移动至所述第二位置和所述第三位置。
74.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米。
75.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于1.0厘米。
76.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于0.5厘米。
77.根据权利要求74所述的设备，其中，所述分析物结合至所述腔室的表面。
78.根据权利要求74所述的设备，其中：
所述设备包括从所述光源至所述腔室的光路径；并且
所述光路径小于或等于2.0厘米。
79.根据权利要求78所述的设备，其中，所述光路径小于或等于1.0厘米。
80.根据权利要求78所述的设备，其中，所述光路径小于或等于0.5厘米。
81.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间。
82.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光检测器的光学效率在0.005％与0.0125％之间。
83.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光源配置成在没有准直透镜的情况下照射所述流体。
84.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光检测器配置成在没有准直透镜的情况下检测光。
85.根据权利要求74所述的设备，其中，所述设备不包括准直透镜。
86.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光源配置成在没有二向色镜的情况下照射所述流体。
87.根据权利要求74所述的设备，其中，所述光源配置成在没有镜子的情况下照射所述流体。
88.根据权利要求74所述的设备，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；并且
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1。
89.根据权利要求88所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少2:1。
90.根据权利要求88所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少5:1。
91.根据权利要求88所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少100:1。
92.根据权利要求88所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少1000:1。
93.根据权利要求88所述的设备，其中，所述光检测器配置成响应于由所述光检测器检测到的光而产生电流。
94.根据权利要求93所述的设备，其中：
由所述光检测器产生的电流包括响应于所述信号光的信号电流；
由所述光检测器产生的电流包括响应于所述背景光的暗电流；并且
所述信号电流与所述背景电流的比率为至少1.5:1。
95.根据权利要求94所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少2:1。
96.根据权利要求94所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少5:1。
97.根据权利要求94所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少100:1。
98.根据权利要求74所述的设备，其中，所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
99.根据权利要求98所述的设备，其中，所述DNA是细菌DNA。
100.根据权利要求98所述的设备，其中，所述DNA是病原性DNA。
101.根据权利要求74所述的设备，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)。
102.根据权利要求74所述的设备，其中，所述流体包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。
103.根据权利要求74所述的设备，还包括设置在所述腔室内的活塞。
104.根据权利要求103所述的设备，其中：
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
105.根据权利要求104所述的设备，其中：
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
106.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间。
107.根据权利要求106所述的设备，其中，所述检测器的光学效率为0.005％与0.0125％之间。
108.根据权利要求106所述的设备，其中：
所述光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米；并且
所述光源配置成在没有准直透镜的情况下照射所述流体。
109.根据权利要求108所述的设备，其中，所述光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于1.0厘米。
110.根据权利要求108所述的设备，其中，所述光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于0.5厘米。
111.根据权利要求106所述的设备，其中：
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体。
112.根据权利要求106所述的设备，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；并且
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1。
113.根据权利要求112所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少2:1。
114.根据权利要求112所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少5:1。
115.根据权利要求112所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少100:1。
116.根据权利要求112所述的设备，其中，所述信号光与所述背景光的比率为至少1000:1。
117.根据权利要求112所述的设备，其中，所述光检测器配置成响应于由所述光检测器检测到的光而产生电流。
118.根据权利要求117所述的设备，其中：
由所述光检测器产生的电流包括响应于所述信号光的信号电流；
由所述光检测器产生的电流包括响应于所述背景光的暗电流；以及
信号电流与背景电流的比率为至少1.5:1。
119.根据权利要求118所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少2:1。
120.根据权利要求118所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少5:1。
121.根据权利要求118所述的设备，其中，信号电流与背景电流的比率为至少100:1。
122.根据权利要求106所述的设备，其中，所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
123.根据权利要求98所述的设备，其中，所述DNA是细菌DNA。
124.根据权利要求98所述的设备，其中，所述DNA是病原性DNA。
125.根据权利要求106所述的设备，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)。
126.根据权利要求106所述的设备，其中，所述流体包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂。
127.根据权利要求106所述的设备，还包括设置在所述腔室内的活塞。
128.根据权利要求127所述的设备，其中：
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
129.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1；
所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体；
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
130.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1；
所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体；
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
131.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1；
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体；
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
132.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的分析物的信号进行光检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1；
所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
133.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：
所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；以及
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体；
所述腔室包括第一端部和第二端部；
所述设备包括致动器，所述致动器构造成使所述活塞以循环的方式从所述腔室的所述第一端部附近的第一位置移动至所述腔室的所述第二端部附近的第二位置、并且返回至所述腔室的所述第一端部附近的所述第一位置；
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第一位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第二端部；并且
所述活塞配置成在所述活塞处于所述第二位置时将所述流体引导至所述腔室的所述第一端部。
134.一种设备，包括：
腔室，所述腔室包括流体，所述流体配置成使核酸经由热循环扩增；
光源，所述光源配置成对所述流体中包含的分析物进行照射；以及
光检测器，其中，光源与所述腔室之间的最大距离小于或等于2.0厘米，其中：
所述光检测器配置成对来自所述流体中包含的所述分析物的信号光进行检测；
所述光检测器配置成在不存在所述信号光时检测背景光；
所述信号光与所述背景光的比率为至少1.5:1；
所述光检测器的光学效率在0.0025％与0.025％之间；并且
所述光源配置成在没有准直透镜或二向色镜的情况下照射所述流体。
135.一种样本收集装置，其中：
所述样本收集装置配置成接纳可变体积的生物样本，并且在单个用户激活步骤中将所述可变体积的生物样本以固定比率稀释成固定体积的经稀释的生物样本；以及
将所述经稀释的所述生物样本转移到构造成在聚合酶链式反应(PCR)中使用的压力容器中。
136.一种设备，其中：
所述设备配置成执行聚合酶链式反应(PCR)；并且
所述设备包括活塞。
137.根据权利要求136所述的设备，其中，所述活塞与至少一种聚合酶链式反应(PCR)试剂物理接触。
138.一种设备，其中：
所述设备配置成接纳生物样本并且在单个用户激活步骤中执行样本准备、使聚合酶链式反应(PCR)扩增进行热循环、以及在不需要机械泵或螺线管的情况下进行检测。
139.一种光学系统，所述光学系统配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中，所述光学系统在检测所述荧光信号之前不经受辐射测量校准。
140.一种光学系统，所述光学系统配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中，所述光学系统不包括二向色镜。
141.一种光学系统，所述光学系统配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中，所述光学系统不包括准直透镜。
142.一种光学系统，所述光学系统配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中，所述光学系统的光学效率小于0.3％。
143.一种设备，所述设备配置成在不使用浮点数学函数的情况下对聚合酶链式反应(PCR)产品执行半定量检测。
144.一种设备，所述设备配置成对来自聚合酶链式反应(PCR)的荧光信号进行检测，其中：
所述设备执行与相对荧光基线的比较；并且
所述设备在检测所述荧光信号之前不经受辐射测量校准。
145.一种配置成在少于5分钟内检测核酸的设备。
146.一种配置成在少于10分钟内检测核酸的设备。
147.一种配置成在少于15分钟内检测核酸的设备。
148.一种检测核酸序列的方法，所述方法包括：
将样本接纳到PCR装置中，其中，所述PCR装置使用未经辐射测量校准的光学器件或活塞；以及
利用所述PCR装置通过进行下述各者来确定所述样本是否包含核酸序列：
用能够用于结合至所述核酸序列的一个或更多个标记剂来处理样本；
用光源照射所述样本，
对由所述标记剂发出的荧光进行测量，以及
基于所述测量来确定所述样本是否包括所述核酸序列。
149.根据权利要求148所述的方法，其中，所述核酸序列与感染疾病相关联。
150.根据权利要求148所述的方法，其中，所述核酸序列与遗传缺陷相关联。
151.根据权利要求148所述的方法，其中，所述核酸序列与血型相关联。
152.根据权利要求148所述的方法，其中，所述核酸序列与基因疗法治疗的目标相关联。
153.根据权利要求148所述的方法，其中，所述核酸序列与脑震荡相关联。
154.根据权利要求148所述的方法，其中，所述样本从生物体收集，并且所述核酸序列与所述生物体的物种的种群相关联，所述方法包括：
基于确定所述样本是否包括所述核酸序列来确定所述生物体是否在所述种群中。
155.根据权利要求154所述的方法，其中，所述生物体是非人类动物，并且所述种群是所述非人类动物的特定品种。
156.根据权利要求148至154中的任一项的方法，其中，所述样本与患者相关联，并且其中，确定所述样本是否包含所述核酸序列包括对关于所述患者收集的生物数据进行分析。
157.根据权利要求148所述的方法，其中，所述样本与刑事调查相关联。
158.根据权利要求157所述的方法，其中，所述核酸序列与所述刑事调查的嫌疑人相关联。
159.根据权利要求148所述的方法，其中，所述样本与身份不明的人相关联。
160.根据权利要求148所述的方法，其中，所述样本与特定环境相关联，并且其中，所述核酸序列与所述特定环境的入侵物种相关联。
161.根据权利要求148所述的方法，其中，确定所述样本是否包括核酸序列是由所述PCR装置在不与远程装置进行通信的情况下执行的。
162.根据权利要求148至161中的任一项所述的方法，还包括将确定的结果传递至远程装置。
163.根据权利要求148至162中的任一项的方法，其中，所述PCR装置包括小于32千字节(kB)的内部存储器。
164.根据权利要求148至162中的任一项的方法，其中，所述PCR装置包括小于16千字节(kB)的内部存储器。
165.根据权利要求148至162中的任一项的方法，其中，所述PCR装置包括小于8千字节(kB)的内部存储器。
166.根据权利要求148至165中的任一项的方法，其中，所述PCR装置在确定所述样本是否包括核酸序列时不从外部源接收电力。
167.根据权利要求148至166中的任一项的方法，其中，所述样本和所述试剂容纳在一次性筒内。
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