CN113390936A - 一种一氧化氮电化学传感微电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一氧化氮电化学传感微电极及其制备方法和应用，该电极以碳纤维构成微电极内芯，所述电极内芯由内而外依次修饰包括金沉积层、NO电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层，由上述多个修饰层形成完整的微电极。本发明制备的NO电化学传感微电极利用电化学分析方法实现NO的快速检测，其所需电化学仪器简单、选择性好、分析速度快、检测成本低、易于实现微型化，且响应快速、监测灵敏。本发明提出的一氧化氮电化学传感微电极有助于解决现有NO检测选择性和灵敏度不高的问题，是一种高性能的NO微传感器，可进一步拓展NO的检测应用，为环境监测、NO生理功能的研究提供重要的检测与传感器件。
Description
技术领域
本发明属于微电极领域，具体涉及一种高选择性一氧化氮(NO)电化学传感微电极及其制备方法和应用。
背景技术
一氧化氮(Nitric oxide，NO)在生物体内是一种重要的气体信号分子，在诸如血管扩张、神经信号传递和炎症反应过程中起着关键作用。与此同时，局部 NO水平与生理和病理状态息息相关，有着关键的指示作用。但由于NO在生物体内的活性半衰期仅为数秒，且扩散范围通常在几百微米以内，NO检测的困难显而易见。因此，克服NO检测困难，发展高灵敏度和高选择性的NO传感器，提升NO传感器的性能，不仅可以促进对NO生理功能的研究，还有望推进以 NO作为指示的疾病早期监测应用。
在诸多NO检测方法中光谱学的方法最常用于NO浓度的测量，其具有高灵敏性和灵活性，如化学发光法可提供很高的灵敏度(Yao D,Vlessidis A G, Evmiridis N P,etal.Luminol chemiluminescense reaction:a new method for monitoring nitricoxide in vivo[J].Analytica Chimica Acta,2002,458(2):281-289)。目前，光谱学方法虽然被用于NO的检测，但其依赖复杂的仪器设备，且需要额外的试剂。电化学传感器具有响应快速、监测灵敏、易于设备集成性等特点和优势。基于此，Shibuki在1990年首次发展了一种电化学NO传感器，该传感器采用正电极电势来氧化和检测NO，这种传感器对亚硝酸盐具有一定的选择性，可以用于测量NO。(Shibuki K.An electrochemical microprobe fordetecting nitric oxide release in brain tissue[J].Neuroscience Research,1990,9(1):69-76.)。目前，已经有越来越多的电化学方法被用于NO的测量。固态的选择性渗透NO电极可以消除内部填充溶液，它的设计和结构使其比Shibuki型更易于小型化。通过在电极上分层放置多种类型的膜，可以调整传感器的选择性，以区分包括亚硝酸盐，多巴胺和对乙酰氨基酚在内的各种干扰，从而能够确定生物环境中的NO浓度，在此基础上的开发的固态催化电极可以进一步减少电活性干扰对NO选择电极的影响(Ciszewski A,MilczarekG.Electrochemical detection of nitric oxide using polymer modified electrodes[J].Talanta,2003,61(1):11-26.)，不过其灵敏度和选择性依然不能满足在生物样本中的高选择性检测。因此如何构建更加灵敏、更高选择性的传感器十分重要，NO传感器的构建仍将是活跃而富有成果的研究领域。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种一氧化氮电化学传感微电极，可以高选择性高灵敏度地检测复杂生物环境下的NO。
本发明还提供所述一氧化氮电化学传感微电极的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种一氧化氮电化学传感微电极，所述电极以碳纤维构成微电极内芯，所述电极内芯由内而外依次修饰包括金沉积层、NO电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层。
其中，所述NO电催化复合物层主要为G4-DNA/Hemin复合物，为一条可以形成四链结构的DNA寡核苷酸与亚铁血红素Hemin组成。
进一步地，所述可以形成四链结构的DNA寡核苷酸其通过5’端-SH与金沉积的碳纤维微电极进行共价连接，并在形成G4结构后与Hemin形成完整的 NO电催化复合物，即G4-DNA/Hemin复合物。
作为优选，所述DNA寡核苷酸含有22个碱基，序列为5’-SH-C6-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(G4-DNA)。
本发明所述的一氧化氮电化学传感微电极的制备方法，包括如下步骤：将预处理的碳纤维形成碳纤维微电极内芯，利用电沉积在上述碳纤维微电极上沉积金，得到沉积有金单质的碳纤维微电极，随后将NO电催化复合物连接到上述碳纤维微电极，最后包封氟化干凝胶
作为优选，所述的制备方法，包括如下步骤：
(1)碳纤维微电极的制备：将碳纤维于丙酮中浸泡过夜，待碳纤维晾干后依次在丙酮、无水乙醇、超纯水中超声，随后将碳纤维吸入毛细管中制备碳纤维微电极，将其拉至细尖，随后在环氧树脂中切割和密封微电极，然后固化，最后在碳纤维底部连接铜丝以建立电接触；
(2)金沉积层的修饰：将步骤(1)制备好的碳纤维微电极依次在超纯水，无水乙醇，超纯水中超声，清洗好的微电极置于氯金酸溶液中电沉积形成金沉积层，沉积完成后，用超纯水反复冲洗干净，得到含有金沉积层的碳纤维微电极，其中，电沉积电位一般为-0.2V，时间120s；
(3)NO电催化复合物层的修饰：将步骤(2)得到的微电极与G4-DNA在 DNA修饰缓冲液中室温孵育，退火后冷却至室温，室温条件下，将亚铁血红素 Hemin与上述电极在结合缓冲液(Binding buffer)中孵育，确保G4-DNA的正确折叠，并与Hemin之间能够平衡结合，电极上形成G4-DNA/Hemin复合物层，即NO电催化复合物层，其可实现NO的电催化信号向电信号的转换；
(4)氟化干凝胶屏蔽层的修饰：将步骤(3)修饰好的碳纤维微电极浸涂氟化干凝胶，在室温下干燥得到一氧化氮电化学传感微电极，通常室温下干燥12 小时，重复浸涂5次。
其中，步骤(3)中微电极在DNA修饰缓冲液中室温孵育8-12h，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液(Binding buffer)中孵育30-40min。
其中，步骤(3)中DNA修饰缓冲液中G4-DNA浓度为5-10μM，结合缓冲液中Hemin浓度为0.1-0.2mM。
其中，步骤(4)中氟化干凝胶由C2H5OH，MTMOS，17-FTMS，5mM HCl 组成。
作为优选，所述氟化干凝胶配比按体积百分比为：C2H5OH(65.9％)，MTMOS(13.2％)，17-FTMS(3.3％)，5mM HCl(17.6％)。
本发明所述的一氧化氮电化学传感微电极在检测复杂生物环境下的NO中的应用。
本发明是一种针对NO检测的电化学传感微电极，其制备过程包括：微电极制备、微电极修饰和反应体系，首先由碳纤维构成微电极内芯，接着由内而外进行三层修饰，分别为金沉积层、NO电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层，由上述结构形成完整的微电极。DNA为一段单链G4-DNA，G4-DNA链的5’端修饰有巯基，通过巯基与金沉积的碳纤维电极表面自组装形成金-巯键立于电极表面，室温条件下，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液(Binding buffer) 中孵育，确保G4-DNA的正确折叠，并与Hemin之间能够平衡结合，形成G4-DNA/Hemin复合物层，即NO电催化复合物层，其可实现NO的电催化信号向电信号的转换，再进行氟化干凝胶屏蔽层的修饰。反应体系包括DNA修饰缓冲液与结合必备的缓冲液体系。所述NO电催化复合物为G4-DNA/Hemin复合物，即一条可以形成四链结构的DNA寡核苷酸与亚铁血红素Hemin组成，所述 DNA寡核苷酸含有21个碱基，序列为5’-SH-C6-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’，通过5’端-SH与金沉积的碳纤维微电极进行共价连接，并在形成G4结构后与Hemin形成完整的NO电催化复合物，即 G4-DNA/Hemin复合物。
所述反应体系中包括：
DNA修饰缓冲液10mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP，pH 7.4。
DNA结合缓冲液1M HEPES(pH 8.0，4mL)，4M KCI(0.5mL)，1％Triton-X 100(5mL)，DMF(1mL)，ddH2O(39.5mL)。
作为优选，所述步骤(1)中碳纤维直径为7μm，毛细管为硼硅酸盐玻璃毛细管外径为1.2mm，内径为0.9mm。
步骤(1)用拉针仪将其拉至细尖，随后在环氧树脂(Epon 828)中切割和密封微电极。
步骤(2)中氯金酸溶液浓度为1.2mM，含有0.1M KCl。
步骤(3)中G4-DNA浓度为5μM，Hemin浓度为0.1mM，亚铁血红素孵育时间为30min。
本发明所述一氧化氮电化学传感微电极用于高选择性NO检测的方法，包括以下步骤：
(1)将制备的微电极在0V～1.0V范围内，用电化学常规差分脉冲伏安法进行NO检测，测得检测限；在+0.7V的电压下，评估电化学传感微电极的选择性。
(2)加入精氨酸(L-Arg)和脂多糖(LPS)刺激培养一段时间后的巨噬细胞，通过巨噬细胞在精氨酸和脂多糖的刺激下可以产生NO，用于刺激细胞内产生NO进行检测，并在同样条件进行电化学检测。
本发明利用NO电催化复合物层可实现NO的电催化信号向电信号的转换。传统的NO传感器灵敏度低，缺乏传感器特异性，相对于NO浓度生理变化的响应速度较慢或传感器小型化困难，此类电化学NO传感器在生物应用中的分析应用仍然受到很大限制。本发明提供了一种新的思路，利用碳纤维构成微电极内芯，由内而外依次修饰金沉积层、NO电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层，形成 G4-DNA/Hemin复合物层，可有效实现信号的增益效果。本发明的NO电化学传感微电极利用电化学分析方法实现NO的快速检测，其所需电化学仪器简单、选择性好、分析速度快、检测成本低、易于实现微型化，且响应快速、监测灵敏。该发明有助于解决现有NO检测选择性和灵敏度不高的问题，提供一种高性能的 NO微传感器，可进一步拓展NO的检测应用，为环境监测、NO生理功能的研究提供重要的检测与传感器件。本发明的微电极加入NO的时候马上可以检测到信号响应速度快，可以有效抗体内常见的NO检测的干扰物质。通过巨噬细胞添加了刺激物，刺激后的巨噬细胞内NO可在细胞水平检测到NO含量的变化，且微电极尺寸在微米级别，便于在胞内进行检测。
本发明的一氧化氮电化学传感微电极中氟化干凝胶屏蔽层主要是屏蔽干扰物分子，提高选择性(特异性)，NO电催化复合物层可以直接结合NO分子，通过氧化还原中心和电极之间的电子转移将NO信号转变为电信号，大大提高微电极的灵敏度，金沉积层一方面增加了电极表面的电子转移速率，另一方面起 NO电催化复合物层和电极的连接作用。本发明中检测信号作用的主要是NO电催化复合物层，但是需要金沉积层让其稳定地修饰在微电极表面，且金沉积层具有放大信号的作用，关键层中包括是G4和Hemin两种物质，通过这两种物质形成的G4-Hemin复合物进行NO信号响应，信号出现的关键在于G4-Hemin复合物的形成，没有Hemin不会产生信号，没有G4效果将明显降低。
本发明制备的一氧化氮电化学传感微电极检测限可以达到皮摩尔级别，检测范围为皮摩尔到微摩尔，并且可达到复杂生物环境中检测的要求。而现有NO传感器，检测限只有纳摩尔级别，检测范围为皮摩尔到纳摩尔或纳摩尔到微摩尔或者更窄，并且无法满足复杂生物环境中检测的要求。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明依靠于碳纤维构成微电极内芯，由内而外依次修饰金沉积层、NO 电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层，响应快速、监测灵敏，保证了微电极传感器在复杂生物环境下仍具有高度的选择性，可以实时检测胞内NO。
2、本发明可以直接检测到亚纳摩尔级别的NO并且具有很广的检测范围，有助于解决现有NO检测选择性和灵敏度不高的问题，可进一步提升NO的检测应用，为多种疾病的研究和在体监测提供重要的工具。
3、本发明的微电极制备简单，使用方便仅需要短时间的孵育和修饰过程，操作简单，均在室温下进行，避免了复杂的实验步骤，操作者无需特别训练。
4、本发明检测时可以利用便宜且便携的电化学工作站，适合于偏远地区及资源贫乏的地区使用。
附图说明
图1为NO电化学传感微电极的制备流程图。
图2为NO电化学传感微电极的扫描电镜表征。
图3为体外NO检测的标准曲线图。
图4为体外NO检测的线性拟合图。
图5为不同程度修饰的微电极检测效果比较图。
图6为NO检测的选择性系数示意图。
图7为巨噬细胞释放NO的检测示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中，MTMOS为甲基三甲氧基硅烷，17FTMS为十七氟癸基三甲氧基硅烷，TCEP为三(2-羧乙基)膦盐酸盐，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Hemin为亚铁血红素。序列5’-SH-C6-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
图1是本发明NO电化学传感微电极的构建原理图。NO电化学传感微电极的制备包含几个步骤，首先用预处理的碳纤维制备碳纤维微电极，利用电沉积在上述碳纤维微电极上沉积金，得到沉积有金单质的碳纤维微电极，随后将NO电催化复合物连接到上述碳纤维微电极，最后包封氟化干凝胶，完成所述高选择和高灵敏NO微传感电极的制备。
实施例1
1、剪取15-20cm的碳纤维束于丙酮中浸泡过夜(保证长度能穿过玻璃管即可)，然后置于铝箔纸上晾干，晾干后的碳纤维依次在丙酮、无水乙醇、超纯水中超声10-20min，随后将碳纤维吸入硼硅酸盐玻璃毛细管中制备碳纤维电极，用玻璃拉丝机将其拉至细尖。在环氧树脂(Epon 828)中切割和密封微电极，然后在80℃下固化2h，在150℃下固化2h，最后在碳纤维底部连接铜丝以建立电接触。将处理好的电极置于1mM K3[Fe(CN)6]中，在-0.3～0.7V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速为100mV/s，直到电流稳定，得到碳纤维微电极。
2、将步骤(1)制备好的碳纤维微电极尖端依次在超纯水，无水乙醇，超纯水中超声5min。清洗好的电极置于氯金酸溶液(浓度为1.2mM，含有0.1M KCl) 中，以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极(Pt)为对电极，电沉积电位为-0.2V，电沉积120s，沉积完成后，用超纯水反复冲洗干净，得到金沉积的碳纤维微电极(Au-CFEs)。
3、将Au-CFEs与5μM(终浓度)G4-DNA在DNA修饰液(10mM Tris-HCl， 300mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP，pH 7.4)中室温孵育10h，95℃下退火5min后冷却至室温。室温条件下，将G4-DNA修饰后的Au-CFEs在含0.1 mM Hemin的结合缓冲液(4mL 1M HEPES，0.5mL 4MKCI，5mL 1％Triton-X100，1mL DMF，39.5mL ddH2O)中孵育30min，确保G4-DNA的正确折叠，并与Hemin之间能够平衡结合，电极上形成G4-DNA/Hemin复合物。
4、随后将修饰好的碳纤维电极浸泡在氟化干凝胶溶液中(65.9％C2H5OH， 13.2％MTMOS，3.3％17-FTMS，17.6％5mM HCl)，在室温下干燥12小时，重复5次，得到一氧化氮电化学传感微电极。
实施例2
1、将实施例1制备的一氧化氮电化学传感微电极进行电镜扫描，其扫描电镜下进行形貌表征如图2所示，由图2可以看出，微电极表面在纳米尺度上有明显的球状凸起，表明在微电极表面成功沉积了金单质，改善了电极表面的电化学活性。
2、NO电化学传感微电极检测巨噬细胞释放NO反应流程：
(1)在0.1×PBS溶液(pH＝7.4)中通入氮气20-30min去除氧气，将标准 DEANONOate溶液(50mM)稀释后按一定比例依次加入，建立NO的终浓度梯度(0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、 100nM、200nM、500nM、1000nM、2000nM、5000nM)。利用三电极体系(实施例1制备的修饰后的碳纤维电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)，以常规差分脉冲伏安法(DNPV)检测PBS溶液中的NO信号，具体是将制备的碳纤维微电极在0V～1.0V范围内，用差分脉冲伏安法进行NO 检测，测得检测限。由图3可以看出，在PBS溶液中加入NO后测到了明显的 NO信号峰，且随着PBS溶液中NO浓度的升高，DNPV检测所得NO信号的峰值电流也逐渐升高。随后选取DNPV检测的峰值电流，进行线性拟合(图4)，线性拟合的结果表明，NO的检测信号与NO浓度的对数值(lgCNO)在0.1-5000 nM范围内呈现良好的线性关系，检测限为13.5pM，优于当前NO传感器纳摩尔级别的检测限。
(2)在0.1×PBS溶液(pH＝7.4)中通入氮气20-30min去除氧气，将标准DEANONOate溶液(50mM)稀释后加入，使得NO的终浓度为100nM。利用三电极体系(实施例1制备的修饰后的碳纤维电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)，以常规差分脉冲伏安法(DNPV)检测PBS溶液中的NO信号，具体是将制备的碳纤维微电极在0V～1.0V范围内，用差分脉冲伏安法进行NO检测。检测完毕后更换工作电极重复上述步骤进行NO检测，工作电极依次更换为未修饰Hemin的电极(其中未修饰Hemin的电极采用实施例1的方法，不同之处在于：在步骤(3)中未修饰Hemin)和未修饰G4-DNA 的电极(其中未修饰G4-DNA的电极采用实施例1的方法，不同之处在于：在步骤(3)中未修饰G4-DNA的电极)。图5表明实施例1制备的修饰后的碳纤维电极可以测得明显的NO信号，而未修饰Hemin的电极测不到NO信号，未修饰G4-DNA的电极检测效果显著降低。
(3)在0.1×PBS溶液(pH＝7.4)中通入氮气20-30min去除氧气，将标准 DEANONOate溶液(50mM)稀释后按一定比例加入，然后分别加入干扰物抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、双氧水(H2O2)四种干扰物进行检测，之后再合并各干扰物共同检测，使得NO终浓度为100nM，干扰物终浓度均为50μM。利用三电极体系(实施例1制备的修饰后的碳纤维电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)，在+0.7V的电压下，以常规差分脉冲伏安法(DNPV)检测PBS溶液中的NO信号，如图5所示，纵坐标log kNO，j是相对于干扰物j的NO的选择性系数，图6的结果表明实施例1制备的修饰后的碳纤维电极在加入干扰物后仍能有效测得NO信号，且选择性较未经完整修饰的电极(其中未经完整修饰的电极为采用实施例1的方法，不同之处在于：没有经过步骤(4)氟化干凝胶层的修饰)有了显著提高。
(4)在培养皿(中皿)中加入6×105—8×105个巨噬细胞100μl(Raw 264.7)，补加培养液至细胞完全覆盖，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养。第二天向皿中加入L-Arg和LPS使其终浓度分别为10ng mL-1和20ng mL-1。将细胞置于培养箱中继续培养，继续培养2h。用三电极体系(实施例1制备的修饰后的碳纤维电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极)，以常规差分脉冲伏安法(DNPV)检测细胞培养液中的NO信号，图7的结果显示，在巨噬细胞内测到了NO信号，且在经过L-Arg和LPS刺激的巨噬细胞内检测到了更高的NO信号，说明可在细胞水平检测到NO含量的变化，且微电极尺寸在微米级别，便于在胞内进行检测。
实施例3
实施例3采用实施例1的方法，不同之处在于：步骤(3)中微电极在DNA 修饰缓冲液中室温孵育12h，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液 (Binding buffer)中室温孵育40min。步骤(3)中DNA修饰缓冲液中G4-DNA 浓度为10μM，结合缓冲液中Hemin浓度为0.2mM。
实施例4
实施例4采用实施例1的方法，不同之处在于：步骤(3)中微电极在DNA 修饰缓冲液中室温孵育8h，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液 (Binding buffer)中室温孵育30min。步骤(3)中DNA修饰缓冲液中G4-DNA 浓度为8μM，结合缓冲液中Hemin浓度为0.15mM。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种一氧化氮电化学传感微电极及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggttaggg ttagggttag gg 22
Claims (10)
1.一种一氧化氮电化学传感微电极，其特征在于，所述电极以碳纤维构成微电极内芯，所述电极内芯由内而外依次修饰包括金沉积层、NO电催化复合物层和氟化干凝胶屏蔽层。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮电化学传感微电极，其特征在于，所述NO电催化复合物层主要为G4-DNA/Hemin复合物，为一条可以形成四链结构的DNA寡核苷酸与亚铁血红素Hemin组成。
3.根据权利要求2所述的一氧化氮电化学传感微电极，其特征在于，所述可以形成四链结构的DNA寡核苷酸通过其5’端-SH与金沉积的碳纤维微电极进行共价连接，并在形成G4结构后与Hemin形成完整的NO电催化复合物，即G4-DNA/Hemin复合物。
4.根据权利要求2或者3所述的一氧化氮电化学传感微电极，其特征在于，所述DNA寡核苷酸含有22个碱基，序列优选为5’-SH-C6-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’。
5.一种权利要求1所述的一氧化氮电化学传感微电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将预处理的碳纤维形成碳纤维微电极内芯，利用电沉积在上述碳纤维微电极上沉积金，得到沉积有金单质的碳纤维微电极，随后将NO电催化复合物连接到上述碳纤维微电极，最后包封氟化干凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)碳纤维微电极的制备：将碳纤维于丙酮中浸泡过夜，待碳纤维晾干后将碳纤维吸入毛细管中制备碳纤维微电极，拉至细尖切割和密封，然后固化，最后在碳纤维底部连接铜丝以建立电接触；
(2)金沉积层的修饰：将步骤(1)制备好的碳纤维微电极依次在超纯水，无水乙醇，超纯水中超声，清洗好的微电极置于氯金酸溶液中电沉积形成金沉积层，沉积完成后，用反复冲洗干净，得到含有金沉积层的碳纤维微电极；
(3)NO电催化复合物层的修饰：将步骤(2)得到的微电极与G4-DNA在DNA修饰缓冲液中室温孵育，退火后冷却至室温，室温条件下，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液(Binding buffer)中孵育，在电极上形成G4-DNA/Hemin复合物层，即NO电催化复合物层；
(4)氟化干凝胶屏蔽层的修饰：将步骤(3)修饰好的碳纤维微电极浸涂氟化干凝胶，在室温下干燥得到一氧化氮电化学传感微电极。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中微电极在DNA修饰缓冲液中室温孵育8-12h，将亚铁血红素Hemin与上述电极在结合缓冲液(Binding buffer)中室温孵育30-40min。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中DNA修饰缓冲液中G4-DNA浓度为5-10μM，结合缓冲液中Hemin浓度为0.1-0.2mM。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中氟化干凝胶由C2H5OH，MTMOS，17-FTMS，HCl组成。
10.一种权利要求1所述的一氧化氮电化学传感微电极在检测复杂生物环境下的NO中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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