CN113384604A - 用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤2,将步骤1所得产物与有机溶剂按照1g:20~40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌提取物。本发明提取出的提取物能够逆转抗肿瘤化疗药的耐药性,提高抗肿瘤药物的治疗效果。

Description

用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法及其应用
技术领域
本发明属于癌细胞抑制研究技术领域,涉及一种用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法。
背景技术
结肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,流行病学观察和实验研究提示肥胖和高脂、高蛋白、低纤维的饮食习惯是诱发结直肠癌的高危因素。此外,结直肠癌发病隐匿、生长缓慢,可能需要十几甚至几十年才表现出明显临床症状,我国结直肠癌发病的中位年龄为45岁左右,60-75岁达到峰值。随着我国社会经济水平的提高,城乡居民饮食结构中高脂低纤比例上升,加之社会人口老龄化趋势的加剧,结直肠癌有可能成为我国最严重的恶性肿瘤,严重影响人民群众健康的同时为家庭和国家造成沉重的经济负担。结肠癌发病早期没有明显症状,多数患者确诊时往往已经处于进展期,手术切除局部瘤块结合化疗成为临床治疗结肠癌的重要手段,以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为基础的多种药物联合治疗被认为是现阶段治疗结肠癌的标准化疗方案。但癌细胞对此类高选择性单靶点药物往往产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象,这正是恶性肿瘤化疗失败的主要原因,亦成为癌症治疗的瓶颈。化疗增敏剂(chemosensitizer,CS)可逆转耐药、增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用或降低其对正常组织细胞毒性,从而获得显著的临床疗效。因此,探寻低毒、高效的化疗增敏剂为开发新型抗肿瘤药物另辟蹊径,且被寄予厚望成为当前的研究热点和亟待解决的重大问题。
红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola(Swartz.:Fr.)Karst.为担子菌纲Basidiomycetes非褶菌目Aphyllophorales多孔菌科Polyporaceae拟层孔菌属Fomes,又名红缘层孔菌、红缘多孔菌、红缘树舌、红带菌等,其作为止血、消炎、降血糖、降血脂的传统用药在俄罗斯、日本、韩国等地区被人们熟知。《中国药用真菌》记载,红缘拟层孔菌味微苦、性平,无毒,能祛风除湿、解热、强心,补肺益肾、和胃健脾、安神定志、扶正培本。随着科技的发展,自20世纪60年代始,国内外学者从红缘拟层孔菌中分离出38种三萜类化合物,以及多糖类、脑苷脂类、芳香类化合物,还有单萜、倍半萜、油酸、亚油酸、棕榈酸、纤维素、半纤维素和果胶等成分。随着研究方法的不断进步,对红缘拟层孔菌抗肿瘤作用的报道也层出不穷,例如上世纪80年代,中日两国学者曾报道红缘拟层孔菌多糖能够通过激活机体非特异性免疫功能杀伤小鼠移植性肉瘤S180,发挥抗癌功效;2006年至今,多个研究组通过实验证明红缘拟层孔菌子实体及其体外培养的菌丝体的氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取物均能不同程度抑制体外培养的宫颈癌(Hela细胞)、乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231细胞)、肝癌(SMMC-7721、Hep 3B、SNU185、SNU354、HepG2细胞)、结肠癌(SW-480、HCT-116细胞)、胃癌、肺癌(A549细胞)细胞的增殖,同时还能够降低H22荷瘤小鼠体内肿瘤的增殖速率,延长其生存期,并激活非特异性免疫功能实现抗肿瘤作用。随着研究的深入,红缘拟层孔菌不仅能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,当它与顺铂联合作用后,小鼠肉瘤S180细胞的存活率下降至顺铂单独使用的半数以下。该研究结果提示红缘拟层孔菌可能具有化疗增敏的潜在价值,有可能为解决临床化疗瓶颈-肿瘤耐药提供新的治疗思路,然而截至目前,有关红缘拟层孔菌联合化疗药物的相关研究鲜有报道,就其逆转肿瘤耐药或化疗增敏的进一步研究证据和相关作用机制稀缺。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,该方法提取出的提取物能够逆转抗肿瘤化疗药的耐药性,提高抗肿瘤药物的治疗效果。
本发明所采用的技术方案是,用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;
步骤2,将步骤1所得产物与有机溶剂按照1g:20~40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌提取物;
步骤3,将步骤2得到的红缘拟层孔菌提取物进行浓缩,得到浸膏,向浸膏中按料液比1g:30mL加入去离子水,制备混悬液,向混悬液中加入石油醚进行萃取,制备红缘拟层孔菌石油醚提取物。
本发明的特点还在于:
步骤1中烘干温度为45~60℃。
步骤2中有机溶剂为乙醇。
步骤2中乙醇的体积分数为70%~90%。
步骤2中,超声处理的超声功率为280~360w;超声时间为30~90分钟。
本发明的有益效果是:本发明提出的方法建立了结肠癌多药耐药体外研究体系,并通过实验筛选出红缘拟层孔菌中具有逆转结肠癌MDR特性的活性组分,同时提供了该组分的制备方法,并阐明红缘拟层孔菌化疗增敏的作用靶点,为开发具有自主知识产权的新型抗癌药及化疗增敏剂提供前体物质,为临床治疗结肠癌提供科学参考,具有十分重大的科学价值与社会效益。
附图说明
图1是本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法提取到的红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药氟尿嘧啶(5-Fu)的逆转耐药效果图;
图2是本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法提取到的红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药奥沙利铂(L-OHP)的逆转耐药效果图;
图3是本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法提取到的红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药阿霉素(DOX)的逆转耐药效果图;
图4(a)~(d)为本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法中试验验证1的细胞数显微观察结果图;
图5为本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法中试验验证2的MTT试验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为45~60℃。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:20~40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌提取物。乙醇的体积分数为70%~90%。步骤2中,超声处理的超声功率为280~360w;超声时间为30~90分钟;
步骤3,将步骤2得到的红缘拟层孔菌提取物进行浓缩,得到浸膏,向浸膏中按料液比1g:30mL加入去离子水,制备混悬液,向混悬液中加入石油醚进行萃取,制备红缘拟层孔菌石油醚提取物。
实施例1
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为45℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:20mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为360W;超声时间为90分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为90%。
实施例2
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为50℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:30mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为320W;超声时间为30分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为90%。
实施例3
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为60℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为360W;超声时间为30分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为80%。
实施例4
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为60℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为320W;超声时间为90分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为70%。
实施例5
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为60℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为280W;超声时间为60分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为90%。
实施例6
用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;步骤1中烘干温度为60℃;拆块后的尺寸为1cm×1cm。
步骤2,将步骤1所得产物与乙醇按照1g:30mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,超声功率为360W;超声时间为30分钟;将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌粗提物;乙醇的体积分数为90%。
上述实施例1~6的试验数据结果如下表1所示,表1中的提取率为总甾醇的提取率。
表1
Figure BDA0003152007370000081
从上表1可知,实施例6为最佳提取工艺;
将实施例6得到红缘拟层孔菌提取物进行浓缩,得到浸膏,向浸膏中按料液比1g:30mL加入去离子水,制备混悬液,向混悬液中加入石油醚进行萃取,制备红缘拟层孔菌石油醚提取物(FPK)。
实验验证1
体外培养结肠癌耐药株HCT-8/Fu,培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度。细胞复苏经2~3次正常传代,收集细胞并调整细胞密度为1×105个/mL,按照100μl/孔接种于96孔细胞培养板;12h后,分别向上述细胞中加入红缘拟层孔菌石油醚提取物(FPK)和化疗药氟尿嘧啶(5-Fu),共培养48h;共培养结束后,向上述细胞中按照20μL/孔加入2.5mg/mL的MTT(噻唑蓝)溶液,避光孵育4h,弃去细胞培养液,按照150μL/孔加入二甲基亚砜,置于摇床震荡15min,待蓝紫色沉淀完全溶解后,于490nm读取吸光度值,按照存活率=(药物组吸光度值/对照组吸光度值)100%,计算细胞相对存活率,进行化疗增敏的活性评价;
图1为红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药氟尿嘧啶(5-Fu)的逆转耐药效果图,细胞存活率越低,表示逆转耐药作用越明显。图1中对照组为不加药物的细胞,FPK的浓度为20μg/mL,5-Fu-15表示氟尿嘧啶的浓度为15μg/mL,FPK+Fu15表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与15μg/mL的氟尿嘧啶联合作用,5-Fu-25表示氟尿嘧啶的浓度为25μg/mL,FPK+Fu25表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与25μg/mL的氟尿嘧啶联合作用。
图4为试验验证1的细胞数显微观察结果;其中图4(a)为不加药物的细胞对照组;图4(b)为化疗药氟尿嘧啶单独作用组;图4(c)为红缘拟层孔菌石油醚提取物的单独作用组;图4(d)为化疗药氟尿嘧啶与红缘拟层孔菌石油醚提取物共同作用组。
实验验证2
体外培养结肠癌耐药株HCT-8/Fu,培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度。细胞复苏经2~3次正常传代,收集细胞并调整细胞密度为1×105个/mL,按照100μl/孔接种于96孔细胞培养板;12h后,分别向上述细胞中加入红缘拟层孔菌石油醚提取物(FPK)和化疗药奥沙利铂(L-OHP),共培养48h;共培养结束后,向上述细胞中按照20μL/孔加入2.5mg/mL的MTT(噻唑蓝)溶液,避光孵育4h,弃去细胞培养液,按照150μL/孔加入二甲基亚砜,置于摇床震荡15min,待蓝紫色沉淀完全溶解后,于490nm读取吸光度值,按照存活率=(药物组吸光度值/对照组吸光度值)x100%,计算细胞相对存活率,进行化疗增敏的活性评价;图2为红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药奥沙利铂(L-OHP)的逆转耐药效果图,细胞存活率越低,表示逆转耐药作用越明显。图2中对照组为不加药物的细胞,FPK的浓度为20μg/mL,L0.5表示奥沙利铂的浓度为0.5μg/mL,FPK+L0.5表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与0.5μg/mL的奥沙利铂联合作用,L1表示奥沙利铂的浓度为1.0μg/mL,FPK+L1表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与1.0μg/mL的奥沙利铂联合作用,L2表示奥沙利铂的浓度为2.0μg/mL,FPK+L2表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与2.0μg/mL的奥沙利铂联合作用。图5为试验验证2的MTT试验结果图;图中的颜色越浅,活细胞数量越少。
实验验证3
体外培养结肠癌耐药株HCT-8/Fu,培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度。细胞复苏经2~3次正常传代,收集细胞并调整细胞密度为1×105个/mL,按照100μl/孔接种于96孔细胞培养板;12h后,分别向上述细胞中加入红缘拟层孔菌石油醚提取物(FPK)和化疗药阿霉素(DOX),共培养48h;共培养结束后,向上述细胞中按照20μL/孔加入2.5mg/mL的MTT(噻唑蓝)溶液,避光孵育4h,弃去细胞培养液,按照150μL/孔加入二甲基亚砜,置于摇床震荡15min,待蓝紫色沉淀完全溶解后,于490nm读取吸光度值,按照存活率=(药物组吸光度值/对照组吸光度值)x100%,计算细胞相对存活率,进行化疗增敏的活性评价;图3为红缘拟层孔菌石油醚提取物对化疗药阿霉素(DOX)的逆转耐药效果图,细胞存活率越低,表示逆转耐药作用越明显。图3中对照组为不加药物的细胞,FPK的浓度为20μg/mL,Dox-15.625表示阿霉素的浓度为15.625μg/mL,FPK+Dox-15.625表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与15.625μg/mL的阿霉素联合作用,Dox-31.25表示阿霉素的浓度为31.25μg/mL,FPK+Dox-31.25表示20μg/mL的红缘拟层孔菌石油醚提取物与31.25μg/mL的阿霉素联合作用。
上述实验验证1~实验验证3即可证明本发明方法提取出的红缘拟层孔菌石油醚提取物逆转抗肿瘤化疗药的耐药性。
图1~图3采用SPSS 25.0软件对数据进行分析,结果以
Figure BDA0003152007370000111
表示,组间显著性差异分析采用Duncan法,多重比较结果采用字母法标记,a~z表示P<0.05,不同字母表示组间差异显著。

Claims (6)

1.用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,其特征在于:具体包括如下步骤:
步骤1,将红缘拟层孔菌子实体洗净、烘干、拆块、粉碎,得到絮状的红缘拟层孔菌粉体;
步骤2,将步骤1所得产物与有机溶剂按照1g:20~40mL的比例混合均匀,得到混合物;将混合物超声提取得到超声处理混合物,将超声处理混合物抽滤、浓缩,得到红缘拟层孔菌提取物;
步骤3,将步骤2得到的红缘拟层孔菌提取物进行浓缩,得到浸膏,向浸膏中按料液比1g:30mL加入去离子水,制备混悬液,向混悬液中加入石油醚进行萃取,制备红缘拟层孔菌石油醚提取物。
2.根据权利要求1中所述的用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,其特征在于:所述步骤1中烘干温度为45~60℃。
3.根据权利要求1中所述的用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,其特征在于:所述步骤2中有机溶剂为乙醇。
4.根据权利要求3中所述的用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,其特征在于:所述步骤2中乙醇的体积分数为70%~90%。
5.根据权利要求1中所述的用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物的提取方法,其特征在于:所述步骤2中,超声处理的超声功率为280~360w;超声时间为30~90分钟。
6.用于抗肿瘤的红缘拟层孔菌提取物,其特征在于:用于逆转抗肿瘤化疗药的耐药性。
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