CN113376292B - 一种同时测定蜜丸或水蜜丸中3种兽药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药残留检测技术领域，具体涉及一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法。该方法将待测样品经过乙酸铅、吸附剂等前处理后，采用高效液相色谱‑串联质谱法进行测定，准确性、稳定性、灵敏度高，可以同时定性和定量；并且不需要对样品进行复杂的样品前处理，仪器使用成本低，对技术人员水平要求低，分析速度快，10min内即可完成一个样品的分析检测，极大的缩短了分析时间，大幅提高检测效率。

Description

一种同时测定蜜丸或水蜜丸中3种兽药残留的方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测技术领域。更具体地，涉及一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露酿蜜而成的天然甜性物质，蜂蜜作为药用在我国第一部本草著作《神农本草经》中就有记载，列为上品。蜂蜜广泛应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中，更是中药制剂、中药蜜炙过程中不可或缺的原辅料，其质量安全必须高度重视。目前，我国蜂产品兽药残留问题仍较为突出，根据2014-2018年农业部畜禽及蜂产品兽药残留监控计划结果显示，氯霉素、甲硝唑等兽药残留不合格率最高，已成为影响其食用安全的最主要因素之一。然而，以蜂蜜为主要原辅料的蜜丸、水蜜丸制剂并未对产品的兽药残留作相关规定，也没有相应的检测标准，因此，有必要对蜜丸、水蜜丸制剂的兽药残留问题开展方法开发、风险监测与评估工作。

目前，关于蜂蜜中兽药残留检测方法的报道较多，主要有高效液相色谱-串联质谱法、气相质谱法、酶联免疫法等，常用的前处理方法有固相萃取法、磁分散固相萃取法等。针对含有炼蜜或糖制成的半流体制剂，温家欣等公开了一种高效液相色谱-串联质谱法测定膏方中药制剂中多种兽药残留的方法(温家欣,陈俏,曹雅静,何嘉雯,赖宇红.高效液相色谱-串联质谱法测定膏方中药制剂中多种兽药残留[J].分析试验室,2021,40(05):541-546.)，但关于蜜丸、水蜜丸制剂中多种兽药残留问题的报道较少，现有的文献资料只有关于氯霉素残留的报道，未见甲硝唑、地美硝唑等常见不合格项目的研究；且受基质干扰的影响，现有方法氯霉素的检出限较高，未能满足风险监测工作的需求。由于中药制剂的成分与蜂蜜有很大差别，含有大量鞣质、树脂、粘液质、酚类、苷类、萜类、甾体等成分，基质更加复杂，参考蜂蜜的前处理方法不能除去其它中药材成分的严重基质干扰。因此，要必要针对蜂蜜和中药制剂的基质特点，开发适用于蜜丸、水蜜丸制剂的多种兽药残留检测方法，开展更广泛、深入的风险监测工作，为风险评估提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服没有针对蜜丸、水蜜丸制剂兽药残留检测或氯霉素残留检测检出限较高的缺陷和不足，提供一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法。

本发明的目的是提供一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法，采用高效液相色谱-串联质谱法进行测定，具体包括以下步骤：

S1、标准溶液制备：甲硝唑、地美硝唑、氯霉素标准物质用乙腈配置成混合标准溶液；地美硝唑氘代内标、氯霉素氘代内标用乙腈配置成内标标准溶液；

S2、试样制备：将蜜丸或水蜜丸粉碎，加入步骤S1所得内标标准溶液和乙酸铅溶液，所得上清液除水后用MWCNTs-NH除杂，所得上清液浓缩、复溶、过滤后，采用高效液相色谱-串联质谱法进行进样检测；

S3、所述高效液相色谱条件：C18色谱柱，柱温35～45℃，流速0.2～0.4mL/min；以水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度条件为0～2min，水85％；2～6min，水85～15％；6～7.5min，水15％；7.5～7.6min，15～85％；7.6～10min，水85％；

S4、所述质谱条件：离子源为电喷雾离子源；电喷雾电压：0～7.0min为正离子模式检测，电喷雾电压为5500V，7.0～10min为负离子模式检测，电喷雾电压为-4500V；离子源温度：550℃；雾化气压力：50psi；气帘气压力：40psi；碰撞气压力：9psi，采用多重反应监测。

进一步地，步骤S1中，所述混合标准溶液中，甲硝唑、氯霉素浓度为0.05～0.15μg/mL，地美硝唑浓度为0.1～0.3μg/mL。

更进一步地，步骤S1中，所述内标标准溶液中，地美硝唑氘代内标浓度为0.1～0.3μg/mL，氯霉素氘代内标浓度为0.05～0.15μg/mL。

进一步地，步骤S2中，所述乙酸铅溶液的浓度为150～250g/L。优选地，所述乙酸铅溶液的浓度为200～250g/L；更优选地，所述乙酸铅溶液的浓度为200g/L。

更进一步地，步骤S2中，所述除水所用试剂为无水硫酸镁和无水氯化钠。

进一步地，步骤S2中，所述进样检测的进样量为5～20μL。

更进一步地，步骤S3中，所述C18色谱柱为Agilent EC-C18色谱柱，规格为100mm×2.1mm，2.7μm。

优选地，步骤S3中，所述柱温40～45℃，流速0.2～0.3mL/min；更优选地，所述柱温40℃，流速0.3mL/min。

进一步地，所述甲硝唑、氯霉素的定量限为0.25μg/kg，所述地美硝唑的定量限为0.50μg/kg。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法，将待测样品经过乙酸铅、吸附剂等前处理后，采用高效液相色谱-串联质谱法进行分离、测定，准确性、稳定性、灵敏度高，可以同时定性和定量；并且不需要对样品进行复杂的样品前处理，仪器使用成本低，对技术人员水平要求低，分析速度快，10min内即可完成一个样品的分析检测，极大的缩短了分析时间，大幅提高检测效率。

附图说明

图1为实施例1-1.5定性分析中高效液相色谱分离、质谱测定所得甲硝唑、地美硝唑、氯霉素的提取离子流图。

图2为实施例2-2.3吸附剂的选择中用500mg PSA对样品进行前处理后高效液相色谱分离、质谱测定所得地美硝唑提取离子流图。

图3为实施例2-2.3吸附剂的选择中用100mg MWCNTs-NH对样品进行前处理后高效液相色谱分离、质谱测定所得地美硝唑提取离子流图。

图4为实施例2-2.4色谱条件的选择中以0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈作为流动相体系所得地美硝唑提取离子流图。

图5为实施例2-2.4色谱条件的选择中以水-甲醇作为流动相体系所得地美硝唑提取离子流图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

其中，氨基化多壁碳纳米管(MWCNTs-NH)：外径8～15nm，官能团含量0.45wt％。

甲硝唑、地美硝唑、氯霉素标准物质：纯度≥99.0％。

地美硝唑氘代内标(地美硝唑-D₃)、氯霉素氘代内标(氯霉素-D₅)物质：纯度≥99.0％。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1蜜丸、水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素残留的测定方法

1.1溶液的配置

1.1.1乙酸铅溶液(200g/L)：称取200g三水合乙酸铅用水溶解，加入5.0mL冰醋酸，加水至1 000mL，混匀。

1.1.2标准储备溶液：分别准确称取适量的甲硝唑、地美硝唑、氯霉素标准物质(精确至0.1mg)，用乙腈配成500μg/mL的标准储备溶液(4℃避光保存可使用6个月)。

1.1.3混合标准中间溶液：分别准确移取适量的甲硝唑、地美硝唑、氯霉素标准储备溶液，用乙腈稀释成甲硝唑、氯霉素浓度为5μg/mL，地美硝唑浓度为10μg/mL的混合标准中间溶液(4℃避光保存可使用3个月)。

1.1.4混合标准使用溶液：准确移取适量的混合标准中间溶液，用乙腈稀释成甲硝唑、氯霉素浓度为0.1μg/mL，地美硝唑浓度为0.2μg/mL的标准使用溶液(临用现配)。

1.1.5内标储备溶液：分别准确称取适量的地美硝唑氘代内标、氯霉素氘代内标(精确至0.1mg)，用乙腈配成100μg/mL的标准储备溶液(4℃避光保存可使用12个月)。

1.1.6混合内标中间溶液：分别准确移取适量的地美硝唑氘代内标、氯霉素氘代内标储备溶液，用乙腈稀释成地美硝唑氘代内标浓度为2μg/mL，氯霉素氘代内标浓度为1μg/mL的内标中间溶液(4℃避光保存可使用6个月)。

1.1.7混合内标使用溶液：准确移取适量的混合内标中间溶液，用乙腈稀释成地美硝唑氘代内标浓度为0.2μg/mL，氯霉素氘代内标浓度为0.1μg/mL的内标中间溶液(4℃避光保存可使用2周)。

1.1.8混合标准工作溶液：准确移取适量的混合标准使用溶液于5mL容量瓶中，准确加入0.5mL混合内标使用溶液，用水稀释成合适的标准工作溶液(临用现配)。

1.2试样溶液制备

取蜜丸5粒混合搓成条状，剪碎，作供试样品；取水蜜丸粉碎，混匀，作供试样品。

称取试样2g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，加入200μL混合内标使用溶液和10mL水，涡旋振荡20min使试样充分分散；加入乙酸铅溶液(蜜丸加入5mL、水蜜丸加入7.5mL)，涡旋5min，8 000r/min离心5min；上清液倾入另一50mL离心管，加入15mL乙腈，涡旋振荡1min，加入6g MgSO₄、1.5g NaCl，涡旋振荡5min，8 000r/min离心5min；取上层清液10mL至15mL离心管中，加入900mg MgSO₄、100mg MWCNTs-NH，涡旋振荡3min，8000r/min离心5min；准确吸取7.5mL上清液，氮气吹干后用1.0mL水复溶；复溶液通过0.22μm滤膜至样品瓶，待测。

1.3高效液相色谱条件

1.3.1色谱柱：Agilent EC-C18(100mm×2.1mm，2.7μm)或相当者。

1.3.2流速：0.3mL/min。

1.3.3柱温：40℃。

1.3.4进样量：10μL。

1.3.5流动相：水-甲醇。

1.3.6梯度洗脱程序见表1。

表1梯度洗脱程序

时间(min)	水(％)	甲醇(％)
			0.00	85	15
2.00	85	15
			6.00	15	85
7.50	15	85
			7.60	85	15
10.0	85	15

1.4质谱/质谱条件

1.4.1离子源：电喷雾离子源。

1.4.2电喷雾电压：0～7.0min为正离子模式检测，电喷雾电压为5500V，7.0～10min为负离子模式检测，电喷雾电压为-4500V。

1.4.3离子源温度：550℃。

1.4.4雾化气压力：50psi。

1.4.5气帘气压力：40psi。

1.4.6碰撞气压力：9psi。

1.4.7检测方式：多重反应监测(MRM)，监测条件见表2。

表2多重反应监测(MRM)的条件

注：*为定量离子。

1.5定性分析

按照1.1～1.4的条件测定样品和混合标准使用溶液，如果样品的质量色谱峰保留时间与混合标准使用溶液一致；离子对的相对丰度与浓度相当的混合标准使用溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。混合标准使用溶液的液相色谱-串联质谱提取离子流图参见图1。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度/％	>50	>20-50	>10-20	≤10
					允许的相对偏差/％	±20	±25	±30	±50

1.6定量分析

将试样溶液和混合标准系列工作溶液分别注入液相色谱-质谱/质谱仪中，测定相应的峰面积，内标法定量(甲硝唑、地美硝唑以地美硝唑-D₃为内标，氯霉素以氯霉素-D₅为内标)，根据标准曲线得到样品溶液中的目标物浓度。

试样中目标物的含量X，按式(1)计算：

式中：

X——试样中目标物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；

c——从标准曲线查得试样溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升(ng/mL)；

V——试样稀释总体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

实施例2实验条件筛选

2.1沉淀剂的选择

蜜丸、水蜜丸多为补益类中药，以中药药粉直接入药，尽管基质组成主要是蜂蜜，仍含有大量核苷、多糖、氨基酸、皂苷、黄酮类、木脂素类、鞣质等物质，针对蜂蜜基质开发的前处理技术并不能有效去除样品中大量的中药活性成分。本发明拟使用高浓度的盐溶液进行沉淀(如铅盐沉淀法、明矾沉淀法)。

经过比较100g/L明矾溶液、100g/L乙酸铅溶液、200g/L乙酸铅溶液对蜜丸中药成分的沉淀去除效果，结果发现，明矾溶液与中药活性成分主要形成水溶性络合物，沉淀效果不理想；乙酸铅溶液的沉淀效果显著，且经浓度较高的乙酸铅溶液处理后，试液颜色更浅。因此，本发明优选采用200g/L乙酸铅溶液作为沉淀剂。与蜜丸制剂相比，水蜜丸制剂中药药粉的比例更高，因此，需加入更大量的200g/L乙酸铅溶液(即7.5mL)才可获得良好的沉淀净化效果。

2.2提取溶剂的选择

多类兽药残留测定常用的提取溶剂有乙腈、丙酮、甲醇、乙酸乙酯等。尽管使用丙酮、甲醇更有利于试液中的多糖发生沉淀而去除，但后续盐析步骤两相较难分层，使用丙酮时提取液颜色较深，说明丙酮提取液的共萃取物较多；当使用乙酸乙酯作为提取溶剂时，提取溶液浑浊，颜色深，乳化现象明显。因此本发明优选采用乙腈作为提取溶剂，所得提取溶液澄清透亮，颜色较浅，有利于进一步净化。

2.3吸附剂的选择

蜜丸以药粉入药，样品中含有大量酚类、苷类、萜类、甾体、糖类等活性成分，在萃取过程中与目标化合物共提取，因此选择合适的吸附剂减少基质干扰尤为重要。

常用的净化吸附剂有十八烷基键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、氨基吸附剂(NH₂)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化铝、酸性氧化铝、二氧化锆等，其中C18能吸附脂类、蛋白质等化合物，而本发明通过乙酸铅浓溶液沉淀、乙腈提取等方式基本去除了此类物质干扰，因此不选择C18作为吸附剂。GCB可以吸附甾醇和色素，对颜色较深的复杂样品有较好的净化能力。中性氧化铝也是常用的吸附剂，对色素、芳香族、含负电基团(如硫、磷等)化合物有较好的吸附作用，但在回收试验中发现净化液颜色较深，净化效果一般。酸性氧化铝加强了氧化铝的路易斯酸特性，对碱性化合物的吸附能力减弱，主要用于吸附极性化合物和具有阴离子官能团的化合物，但目标化合物也被明显吸附，可能与氧化铝吸附剂极性较强有关。二氧化锆是同时具有表面酸性位和碱性位的过渡金属氧化物，具有路易斯酸-碱的特性，对富含羟基、巯基的化合物有较好的吸附作用，但应用于中药制剂时净化效果较其他吸附剂差。PSA与NH₂相比，同时含有一级和二级胺，离子交换能力更强，对糖类、有机酸、酚类等物质具有更好的吸附效果，但所需用量较大，对于水蜜丸制剂需达500mg以上才有较理想的净化效果。

多壁碳纳米管(MWCNTs)属新型的吸附材料，是由几层到几十层石墨稀片同轴卷曲而成的纳米级中空管。与C18、PSA、NH₂、GCB、中性氧化铝、酸性氧化铝、二氧化锆等相比，它具有更大的比表面积，吸附容量和吸附能力更强。经过氨基修饰后的MWCNTs-NH，除了具有较大的比表面积，氨基的键合量也高于PSA和NH₂吸附剂，离子交换能力更突出，因此在较小的用量下即可获得理想的净化效果，特别适用于中药制剂等复杂基质中痕量兽药残留的检测。本发明比较了不同净化材料对基质样品中目标化合物的吸附情况，回收率参见表4。

表4不同净化材料对基质样品中目标化合物的回收率

另外，本发明比较了500mg PSA和100mg MWCNTs-NH的基质去除效果，结果参见图2～3。由图可见，对于测定离子对质荷比较小的地美硝唑，MWCNTs-NH的基质去除效果更好，而PSA净化的样品在地美硝唑峰前有明显的干扰峰。

2.4色谱条件的选择

本发明比较了0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈、水-甲醇两种流动相体系的洗脱效果，结果参见图4～5。

由图可见，采用0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈体系时，目标化合物保留时间较短，丸剂的中药成分对测定存在较大干扰，以地美硝唑为例，目标化合物与基质干扰物未实现基线分离；而采用水-甲醇流动相体系，目标化合物和基质干扰物的分离显著改善，基线也更平整。

实施例3方法学考察

3.1检出限和定量限

通过逐级稀释，按信噪比不少于3:1和10:1确定检出限和定量限：甲硝唑、氯霉素的仪器检出限为0.1ng/mL，定量限为0.25ng/mL，当称样量为2.0g，稀释倍数为2时，方法检出限为0.1μg/kg，定量限为0.25μg/kg；地美硝唑的仪器检出限为0.2ng/mL，定量限为0.5ng/mL，当称样量为2.0g，稀释倍数为2时，方法检出限为0.20μg/kg，方法定量限为0.50μg/kg。

3.2校准曲线

将混合标准使用液用水逐级稀释成标准系列工作溶液，加入适量内标溶液，内标法定量，回归方程、相关系数见表5。

表5目标化合物的线性方程、相关系数和线性范围

化合物	回归方程	相关系数	线性范围(μg/L)
				甲硝唑	y＝0.99934x+0.00670	0.9998	0.25～5
地美硝唑	y＝0.99972x+0.00035	1.0000	0.5～20
				氯霉素	y＝0.99961x+0.00042	0.9999	0.25～10

3.3回收率与精密度

本方法对蜜丸、水蜜丸基质进行考察，各基质在2倍定量限浓度水平重复进行6次回收试验，方法回收率见表6。

表6目标化合物的回收率、重复性

由表可见，本发明方法回收率(要求为60～120％)和重复性均较好，完全符合要求。

实施例4样品检测

应用本发明方法，根据实施例1的具体方法参数，对13个品种29批蜜丸、3个品种9批水蜜丸制剂进行测定，其中4批蜜丸检出氯霉素，含量范围在0.32～0.48μg/kg，结果见表7。

表7样品检测结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种同时测定蜜丸或水蜜丸中甲硝唑、地美硝唑、氯霉素3种兽药残留的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-串联质谱法进行测定，具体包括以下步骤：

S1、标准溶液制备：甲硝唑、地美硝唑、氯霉素标准物质用乙腈配制成混合标准溶液；地美硝唑氘代内标、氯霉素氘代内标用乙腈配制成内标标准溶液；

S2、试样制备：将蜜丸或水蜜丸粉碎，加入步骤S1所得内标标准溶液和乙酸铅溶液，所得上清液除水后用MWCNTs-NH除杂，所得上清液浓缩、复溶、过滤后，采用高效液相色谱-串联质谱法进行进样检测；

S3、所述高效液相色谱的条件：C18色谱柱，柱温40~45℃，流速0.2~0.3mL/min；以水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度条件为0~2min，水85%；2~6min，水85~15%；6~7.5min，水15%；7.5~7.6min，15~85%；7.6~10min，水85%；

S4、所述质谱的条件：离子源为电喷雾离子源；电喷雾电压：0～7.0min为正离子模式检测，电喷雾电压为5500 V，7.0～10min为负离子模式检测，电喷雾电压为-4500 V；离子源温度：550 ℃；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：40 psi；碰撞气压力：9 psi，采用多重反应监测；

步骤S2中，所述乙酸铅溶液的浓度为150~250 g/L。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述混合标准溶液中，甲硝唑、氯霉素浓度为0.05~0.15 μg/mL，地美硝唑浓度为0.1~0.3 μg/mL。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述内标标准溶液中，地美硝唑氘代内标浓度为0.1~0.3 μg/mL，氯霉素氘代内标浓度为0.05~0.15 μg/mL。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述乙酸铅溶液的浓度为200~250g/L。

5.据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述除水所用试剂为无水硫酸镁和无水氯化钠。

6.据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述进样检测的进样量为5~20 μL。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述C18色谱柱为Agilent EC-C18色谱柱，规格为100mm×2.1 mm，2.7 μm。

8.根据权利要求1~7任一所述方法，其特征在于，所述甲硝唑、氯霉素的定量限为0.25μg/kg，所述地美硝唑的定量限为0.50 μg/kg。

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