CN113373222A - 一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法 - Google Patents

一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，包括以下操作步骤：S1：选取100个早期胰腺导管腺癌（I或II期）人群和900名健康人群为试验检测对象，抽取检测对象的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的普通血液收集管收集。本发明所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，利用对血液中蛋白加DNA的多维度检测来判断胰腺导管腺癌（PDAC）的风险程度，可以应用于健康人群，早于传统检测方法平均8个月，更早期发现胰腺导管腺癌（PDAC），也可以用于对治疗中的胰腺导管腺癌的病人的动态监控病情发展，带来更好的使用前景。

Description

一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别涉及一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法。
背景技术
胰腺导管腺癌的早筛评估方法是一种进行胰腺癌检查的支撑方法，胰腺癌是一种恶性肿瘤，当现有检查手段确诊胰腺癌时，这种疾病往往已经发展到十分严重的阶段，这也导致胰腺癌患者的5年存活率仅为3%左右，是五年存活率最低的一种肿瘤类型，而如果早期可以发现，比如一期的胰腺导管腺癌（PDAC）, 其5年存活率可以达到70%，所以，PDAC的早期诊断和早筛对该疾病有重大的临床意义，随着科技的不断发展，人们对于胰腺导管腺癌的早筛评估方法的要求也越来越高。
现有的胰腺导管腺癌的早筛评估方法在使用时存在一定的弊端，早期PDAC的临床症状并不明显，影像学检测的灵敏度低，而基于体液（如血液）的检测没有可用的生物标记物，另外，胰腺导管腺癌（PDAC）和胰腺炎不好区别，临床上广泛使用血清学检测生物学标记物“癌抗原19-9”（英文：CA19-9）的特异性低（很多疾病都有CA19-9抬高的结果），即便在有症状的PDAC病人里，其灵敏性也只有79-81%，目前的诊断技术，均无法达到临床可以使用的早期诊断和早筛的目的的产品，不利于人们的使用，给人们的使用过程带来了一定的不利影响，为此，我们提出一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，可以应用于健康人群，早于传统检测方法平均8个月，更早期发现胰腺导管腺癌（PDAC），达到早发现，早治疗的目的；也可以用于对治疗中的胰腺导管腺癌的病人的动态监控病情发展，可以有效解决背景技术中的问题。
（二）技术方案
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，包括以下操作步骤：
S1：选取100个早期胰腺导管腺癌(I或II期)人群和900名健康人群为试验检测对象，抽取检测对象的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的普通血液收集管收集，之后通过冰袋运输即可；
S2：取血清1毫升，平均分为3份，分别对三个蛋白，包括CA19-9、THBS2、MUC5AC，进行用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准ELISA的方法进行；
S3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即CF-DNA）；
S4：CF-DNA产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，用多重PCR的方法捕获和富集7种常见的KRAS突变，捕获和扩增富集后的产物，按照ILLUMINA的测序文库搭建方法建立文库，在ILLUMINA测序仪（MYSEQ或NOVASEQ）上进行标准的测序过程；
S5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测，首先用亚硫酸氢盐处理对象DNA,甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
S6：根据机器学习模型的综合打分，给出胰腺导管腺癌（PDAC）的患病风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的是高危或患病人，建议积极的临床检测和随访。
作为一种优选的技术方案，所述S1步骤中的阳性样本为早期胰腺导管腺癌（I或II期）人群，阴性样本为健康人群。
作为一种优选的技术方案，所述S1步骤中的离心方法可以使用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟,离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
作为一种优选的技术方案，所述S2步骤中的THBS2为血小板反应蛋白2，所述MUC5AC为黏糖蛋白5AC。
作为一种优选的技术方案，所述S3步骤中的抽提是使用广州吉赛生物cfDNA提取试剂盒，所述S3步骤中的CF-DNA产物大约为50纳克左右，且其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测。
作为一种优选的技术方案，所述甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（BSP）的标准流程上的修改。
作为一种优选的技术方案，所述S4步骤中的测序深度为1万层。
作为一种优选的技术方案，所述S6步骤中机器学习模型采用的是随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数。
（三）有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，具备以下有益效果：该一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，利用对血液中蛋白加DNA的多维度检测来判断胰腺导管腺癌（PDAC）的风险程度，可以应用于健康人群，早于传统检测方法平均8个月，更早期发现胰腺导管腺癌（PDAC），达到早发现，早治疗的目的，也可以用于对治疗中的胰腺导管腺癌的病人的动态监控病情发展，根据对PDAC肿瘤的发生发展和对相关文献的调研理解，在蛋白层面，CA19-9, THBS2和 MUC5AC这三种蛋白在血液中的浓度在肿瘤发生或进展过程中有统计学上的显著抬升；而KRAS的突变在接近95%以上的PDAC里都有发现；另外，甲基化的信号也非常的明显；所以，综合了这3个维度（即蛋白，DNA突变，DNA甲基化）的信息，利用机器学习的原理对大规模数据进行分析和学习，得到预测肿瘤发生或进展的信号，抽取检测对象（健康人，或高危人群，即携带有高危因子的人，例如吸烟，有糖尿病，有肿瘤家族史；或已经在治疗中的PDAC病人，需要监控疾病的进展）的静脉全血10毫升，离心方法（一般可以使用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟,离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度）去掉血细胞，得到血清；如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸 （EDTA）的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可，取血清1毫升，平均分为3份，分别对三个蛋白，包括CA19-9, THBS2（即血小板反应蛋白2）,MUC5AC（黏糖蛋白5AC）进行用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准ELISA的方法进行，剩余的大约4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即cf-DNA），这里的抽提是使用广州吉赛生物cfDNA提取试剂盒，上面步骤的CF-DNA产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，首先，用多重PCR的方法捕获和富集7种常见的KRAS突变，捕获和扩增富集后的产物，按照ILLUMINA的测序文库搭建方法建立文库，在ILLUMINA测序仪（MYSEQ或NOVASEQ）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层，另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测，这里采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（BSP）的标准流程上的修改，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象DNA,甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后在PCR扩增后按照标准的测序方法进行建库，测序，根据机器学习模型（这里采用的随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（PDAC）的风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是高危或患病人，建议积极的临床检测和随访，相比传统的只用CA19-9或影像学结果而言，具有高灵敏性，高特异性和提前影像学6个月左右发现胰腺导管腺癌（PDAC）的获得或复发风险，当本产品用于区别胰腺导管腺癌（PDAC）早期（一期/二期）和健康人的时候，其准确率用AUC（ROC曲线下面积；ROC是指接受者操作特征曲线）衡量为0.89[95%信任区间为（CI）,0.84–0.94]，实验步骤（包括入组人群，收集样本，检测方法，模型建立和调整参数等）的目的是对健康人里有高危PDAC的早早期患者，起到一个早发现，早预防，早干预的作用，一旦形成肿瘤，早期治疗，大大提高检测PDAC阳性对象的治愈率，5年生存率，大大降低病人及国家的医疗负担，利国利民，整个胰腺导管腺癌的早筛评估方法结构简单，操作方便，使用的效果相对于传统方式更好。
附图说明
图1为本发明一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法的整体结构示意图。
图2为本发明一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法中健康水平的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，包括以下操作步骤：
S1：选取100个早期胰腺导管腺癌(I或II期)人群和900名健康人群为试验检测对象，抽取检测对象的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的普通血液收集管收集，之后通过冰袋运输即可；
S2：取血清1毫升，平均分为3份，分别对三个蛋白，包括CA19-9、THBS2、MUC5AC，进行用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准ELISA的方法进行；
S3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即CF-DNA）；
S4：CF-DNA产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，用多重PCR的方法捕获和富集7种常见的KRAS突变，这些突变对应有3对引物，捕获和扩增富集后的产物，按照ILLUMINA的测序文库搭建方法建立文库，在ILLUMINA测序仪（MYSEQ或NOVASEQ）上进行标准的测序过程；
S5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测，首先用亚硫酸氢盐处理对象DNA,甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
S6：根据机器学习模型的综合打分，给出胰腺导管腺癌（PDAC）的患病风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的是高危或患病人，建议积极的临床检测和随访。
进一步的，所述S1步骤中的检测对象中阳性样本为早期胰腺导管腺癌（I或II期）人群，阴性样本为健康人群。
进一步的，所述S1步骤中的离心方法可以使用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟,离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
进一步的，所述S2步骤中的THBS2为血小板反应蛋白2，所述MUC5AC为黏糖蛋白5AC。
进一步的，所述S3步骤中的抽提是使用广州吉赛生物cfDNA提取试剂盒，所述S3步骤中的CF-DNA产物大约为50纳克左右，且其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测。
进一步的，所述甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（BSP）的标准流程上的修改。
进一步的，所述S4步骤中的测序深度为1万层。
进一步的，所述S6步骤中机器学习模型采用的是随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数。
工作原理：根据对PDAC肿瘤的发生发展和对相关文献的调研理解，在蛋白层面，CA19-9, THBS2和 MUC5AC这三种蛋白在血液中的浓度在肿瘤发生或进展过程中有统计学上的显著抬升；而KRAS的突变在接近95%以上的PDAC里都有发现；另外，甲基化的信号也非常的明显；所以，综合了这3个维度（即蛋白，DNA突变，DNA甲基化）的信息，利用机器学习的原理对大规模数据进行分析和学习，得到预测肿瘤发生或进展的信号，选取100个早期胰腺导管腺癌(I或II期)人群和900名健康人群为我们的试验检测对象，抽取每个检测对象的静脉全血10毫升，离心方法（一般可以使用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟,离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度）去掉血细胞，得到血清；如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸 （EDTA）的普通血液收集管收集，之后冰袋运输即可，取血清1毫升，平均分为3份，分别对三个蛋白，包括CA19-9, THBS2（即血小板反应蛋白2）, MUC5AC（黏糖蛋白5AC）进行用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准ELISA的方法进行，剩余的大约4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即cf-DNA），这里的抽提是使用广州吉赛生物cfDNA提取试剂盒，上面步骤的CF-DNA产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，首先，用多重PCR的方法捕获和富集7种常见的KRAS突变，捕获和扩增富集后的产物，按照ILLUMINA的测序文库搭建方法建立文库，在ILLUMINA测序仪（MYSEQ或NOVASEQ）上进行标准的测序过程，测序深度为1万层，另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测，这里采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（BSP）的标准流程上的修改，简单地说，就是首先用亚硫酸氢盐处理对象DNA,甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序，根据机器学习模型（这里采用的随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数）的综合打分，给出胰腺导管腺癌（PDAC）的患病风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的个人认为是高危或患病人，建议积极的临床检测和随访，相比传统的只用CA19-9或影像学结果而言，具有高灵敏性，高特异性和提前影像学6个月左右发现胰腺导管腺癌（PDAC）的获得或复发风险，当本产品用于区别胰腺导管腺癌（PDAC）早期（一期/二期）和健康人的时候，其准确率用AUC（ROC曲线下面积；ROC是指接受者操作特征曲线）衡量为0.992[95%信任区间为（CI）,0.987–0.997](图1)，P-value小于2.22e-16（图2），利用对血液中蛋白加DNA的多维度检测来判断胰腺导管腺癌（PDAC）的风险程度，可以应用于健康人群，早于传统检测方法平均8个月，更早期发现胰腺导管腺癌（PDAC），达到早发现，早治疗的目的，实验步骤（包括入组人群，收集样本，检测方法，模型建立和调整参数等）的目的是对健康人里有高危PDAC的早早期患者，起到一个早发现，早预防，早干预的作用，一旦形成肿瘤，早期治疗，大大提高检测PDAC阳性对象的治愈率，5年生存率，大大降低病人及国家的医疗负担，利国利民。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二（一号、二号）等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1：选取100个早期胰腺导管腺癌（I或II期）人群和900名健康人群为试验检测对象，抽取检测对象的静脉全血10毫升，采用离心方法，去掉血细胞，得到血清，如果对象离中心实验室离心处理有4个小时的间隔，可以采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的普通血液收集管收集，之后通过冰袋运输即可；
S2：取血清1毫升，平均分为3份，分别对三个蛋白，包括CA19-9、THBS2、MUC5AC，进行用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测，这里所用的抗体为商业化抗体，操作按照标准ELISA的方法进行；
S3：剩余的大约4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即CF-DNA）；
S4：CF-DNA产物大约为50纳克左右，其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，用多重PCR的方法捕获和富集7种常见的KRAS突变，捕获和扩增富集后的产物，按照ILLUMINA的测序文库搭建方法建立文库，在ILLUMINA测序仪（MYSEQ或NOVASEQ）上进行标准的测序过程；
S5：另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测，首先用亚硫酸氢盐处理对象DNA,甲基化的胞嘧啶碱基不变，而未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后按照标准的测序方法进行建库，测序；
S6：根据机器学习模型的综合打分，给出胰腺导管腺癌（PDAC）的患病风险得分，该得分的阈值根据数学统计模型得出，在阈值以上的是高危或患病人，建议积极的临床检测和随访。
2.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S1步骤中的阳性样本为早期胰腺导管腺癌（I或II期）人群，阴性样本为健康人群。
3.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S1步骤中的离心方法可以使用低速离心的方法，转速可设置在4000转/分钟,离心时间设置5分钟，温度设置在4摄氏度。
4.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S2步骤中的THBS2为血小板反应蛋白2，所述MUC5AC为黏糖蛋白5AC。
5.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S3步骤中的抽提是使用广州吉赛生物cfDNA提取试剂盒，所述S3步骤中的CF-DNA产物大约为50纳克左右，且其中的10纳克进行对KRAS基因的下一代测序（NGS）检测突变检测，另外的40纳克对两个甲基化位点进行NGS的甲基化的检测。
6.根据权利要求5所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述甲基化的检测采用的方法是在亚硫酸氢盐测序法（BSP）的标准流程上的修改。
7.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S4步骤中的测序深度为1万层。
8.根据权利要求1所述的一种用于胰腺导管腺癌的早筛评估方法，其特征在于：所述S6步骤中机器学习模型采用的是随机森林的方法，该方法的参数使用默认参数。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116463420A (zh) * 2023-05-09 2023-07-21 苏州津渡生物医学科技有限公司 一种发现胰腺导管腺癌相关游离rna生物标志物的方法
CN117344014A (zh) * 2023-07-19 2024-01-05 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种胰腺癌早期诊断试剂盒、方法及其装置

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