CN113373194A - 一种能改善男性性功能的紫苏籽肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能改善男性性功能的紫苏籽肽及其制备方法。本发明第一方面提供了一种能改善男性性功能的紫苏籽肽，所述紫苏籽肽组成中至少包括肽段pER、AR以及MR；基于紫苏籽肽的质量，所述肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g。本发明提供的含有pER、AR以及MR这三个肽段的紫苏籽肽能够提高血清中睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)的浓度，具有改善男性性功能的作用。

Description

一种能改善男性性功能的紫苏籽肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种能改善男性性功能的紫苏籽肽及其制备方法，涉及紫苏深加工技术领域。
背景技术
紫苏(Perilla frutescens(L.)Britt.)是一种在亚洲特别是东亚及东南亚大范围野生或种植的唇形科一年生草本植物，由于紫苏具有良好的食用及药用价值，其茎叶(紫苏)和果实(紫苏籽)均被收录于卫生部颁布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》“药、食同源产品名录”中。
紫苏籽中富含不饱和脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸，因此紫苏籽也被公认为是一种高价值高营养的植物油类原料。目前，使用紫苏籽为原料提取油脂的制备工艺日渐成熟，紫苏籽提油脂后的残余组分中蛋白含量很高，尤其是经过脱壳处理的紫苏籽经过压榨法或二氧化碳超临界萃取法进行油脂提取后，剩余的紫苏籽粕中干基蛋白含量更高达40％以上。因此，研究如何进一步提高紫苏籽粕中蛋白的利用率有一定实际意义，也是紫苏加工的新方向。
目前，已有部分利用碱溶酸沉的原理对紫苏籽粕中的蛋白进行提取研究，但对于蛋白的精深加工及更深一步研究，还报道较少，这也限制了以紫苏为原料进行深加工的研究进程。
发明内容
本发明提供一种能改善男性性功能的紫苏籽肽，该紫苏籽肽通过其中包含的特定质量含量的功能肽段，焦谷氨酰精氨酸(pyroGlu-Arg，pER)、丙氨酰精氨酸(Ala-Arg，AR)以及甲硫氨酰精氨酸(Met-Arg，MR)，因而在改善男性性功能方面表现出良好的功效。
本发明还提供一种上述紫苏籽肽的制备方法，通过对紫苏籽蛋白粉酶解、初级纯化以及电场纯化工序的控制，使产物明确含有特定质量含量的焦谷氨酰精氨酸(pyroGlu-Arg，pER)、丙氨酰精氨酸(Ala-Arg，AR)以及甲硫氨酰精氨酸(Met-Arg，MR)等功能性肽段。
本发明还提供一种上述紫苏籽肽在改善男性性功能产品中的应用。
本发明提供了一种能改善男性性功能的紫苏籽肽，所述紫苏籽肽组成中至少包括肽段pER、AR以及MR；
具体地，本发明所提供的紫苏籽肽中，基于紫苏籽肽的质量，所述肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g。
此外，本发明提供的紫苏籽肽中，除具备上述特殊肽段外，所述紫苏籽肽中蛋白质的质量含量≥80％，肽的质量含量≥60％，表明该紫苏籽肽中蛋白纯度较高，具有较高的肽含量，因此，本发明提供的紫苏籽肽具有较高的产品价值，并且有利于被人体肠道完整吸收，更易在人体内发挥作用。
进一步地，所述紫苏籽肽是以紫苏籽蛋白粉为原料依次进行酶解、初级纯化以及电场纯化处理后获得；
其中，所述酶解处理包括同时使用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解。
在具体实施过程中，首先将紫苏籽蛋白粉与水混合形成匀浆，然后同时加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解结束后灭酶得到紫苏籽肽酶解液，其中，酶解的温度和pH根据酶所需的最佳酶解条件确定，例如，在紫苏籽蛋白粉与水混合形成匀浆后，调节pH为5.5-6.5，然后同时加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在45-55℃条件下酶解2-4h。在酶解处理中，除了需要对酶解的温度、pH环境以及时间进行控制外，还需要对酶的用量进行控制以尽可能保证产物中的肽段pER、AR以及MR具有较高质量含量。具体地，基于所述紫苏籽蛋白粉中的蛋白含量，酸性蛋白酶的用量为300-800U/g，中性蛋白酶的用量为1500-2000U/g，木瓜蛋白酶的用量为1500-2000U/g。酶解结束后，进行灭酶处理以得到紫苏籽肽酶解液，灭酶工艺可以利用本领域常用的灭酶技术进行，本发明在此不做赘述。
最后，为了进一步提高肽段pER、AR以及MR的质量含量，对紫苏籽肽酶解液进行初级纯化以及电场纯化处理，得到紫苏籽肽。
其中，初级纯化包括对紫苏籽肽酶解液进行离心、过滤、浓缩得到紫苏籽肽浓缩液，具体地，离心和浓缩均可使用本领域常见技术；过滤采用多级过滤，具体地，第一级过滤采用孔径为10-50nm的滤膜，对离心后的紫苏籽肽酶解液进行一级过滤，得到一级滤液；第二级过滤采用孔径为0.5-2nm的纳滤膜对所述一级滤液进行二级过滤，得到二级滤液，通过多级过滤的方式，可有效分级分离紫苏籽肽酶解液中分子量较大的成分和盐、游离氨基酸等小分子物质，提高功能肽段pER、AR以及MR的质量含量。
进一步地，发明人发现，在同时使用酸性蛋白酶、中蛋白酶以及木瓜蛋白酶酶解的基础上，配合使用电场纯化的手段才能够更好的提高功能肽段pER、AR以及MR的质量含量，得到含量不低于10mg/100g的pER肽段、40mg/100g的AR肽段以及10mg/100g的MR肽段的紫苏籽肽。具体地，在电场纯化处理中，采用长度与横截面积比为0.2-0.5cm-1的电场槽，并且基于每升所述紫苏籽肽浓缩液，所述电场纯化处理的纯化电压为5-25V。
经过上述初级纯化处理后，能够提高酶解产物中pER、AR以及MR三个肽段的质量含量。随后，对电场纯化后的液体产物进行灭菌、干燥，即可得到所需要的紫苏籽肽产品，其中所述肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g。
研究表明：上述含有特定质量含量的肽段pER、AR以及MR的紫苏籽肽能够显著提高血清中睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)的浓度，具有明显改善男性性功能的作用。
本发明还提供了一种上述任一所述的紫苏籽肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将紫苏籽蛋白粉与水混合形成匀浆；
2)同时加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行2-4h的酶解后，灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3)对所述紫苏籽肽酶解液依次进行初级纯化以及电场纯化处理后得到所述紫苏籽肽。
本发明制备紫苏籽肽的原料为能提供紫苏籽蛋白的任何原料，例如紫苏籽蛋白粉，为了保证酶解处理的效率，本发明可以选用蛋白含量在80％-90％的紫苏籽蛋白粉作为原料。
首先，将紫苏籽蛋白粉与水混合形成匀浆，制浆处理能够将溶解性能不佳的紫苏籽蛋白粉与水充分混合，制备成具有一定流动性的浆液，有利于后续的酶解。
具体地，所述紫苏籽蛋白粉与水的质量比不高于1：5，即每1kg紫苏籽蛋白原料与至少5L水混合制备匀浆。加水过少会导致浆液流动性差，不利于酶制剂的作用，进而降低酶解效率。
在紫苏籽蛋白粉与水的质量比应不高于1：5的基础上，所述紫苏籽蛋白粉与水的质量比最好高于1：15。在制浆过程中，若加水过多则导致反应体积过大，后续酶解、纯化处理的负荷增加，处理成本也会相应增加，因此，紫苏籽蛋白粉与水的质量比应在1：(5-15)内。
本发明人对于如何使紫苏籽蛋白的酶解产物中能含有预期质量含量的肽段pER、AR以及MR进行了大量研究摸索，证明酶制剂的选择、酶处理的工艺以及相应的分离工艺对结果具有关键影响。发明人在研究过程中意外地发现，只有利用酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶进行复合酶解，并利用电场纯化的手段处理酶解产物，才能够有助于得到含有不低于10mg/100g的pER肽段、不低于40mg/100g的AR肽段及不低于10mg/100g的MR肽段的紫苏籽肽。
制浆完毕后，可以调节浆液的pH值至最佳酶解pH环境，例如5.5-6.5。具体可以根据原料制浆后的pH，利用盐酸或氢氧化钠的水溶液调节。
在本发明的酶解过程中，在调节pH后的匀浆中同时加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行2-4h的酶解，灭酶，得到紫苏籽肽酶解液。
在本发明的酶解中，基于所述紫苏籽蛋白粉中的蛋白含量，所述酸性蛋白酶的用量为300-800U/g，中性蛋白酶的用量为1500-2000U/g，木瓜蛋白酶的用量为1500-2000U/g。
此外，为了保证各酶的最佳酶解条件，可依据各酶的性质对体系的温度进行控制，具体地，可以控制温度为45-55℃。
酶解结束后，可对酶解液进行灭酶处理，灭酶可采用本领域常规灭酶手段进行。具体地，可以利用热加工的方式进行灭酶处理，例如在实验室中常压煮沸30min，或在生产中利用蒸汽高温灭酶的方式，在115-125℃并维持15-20s左右。
在对紫苏籽蛋白匀浆酶解、灭酶后得到紫苏籽肽酶解液，为了进一步提高短肽的质量含量，对所述紫苏籽肽酶解液依次进行初级纯化以及电场纯化处理后得到所述紫苏籽肽。
以下，对初级纯化以及电场纯化处理进行详细介绍。
所述初级纯化包括：对所述紫苏籽肽酶解液依次进行离心、过滤、浓缩后得到紫苏籽肽浓缩液。
首先，离心处理可使用本领域常见技术手段进行，含有功能肽段的成分留在上清液中，提高功能肽段的质量含量。例如常用的台式离心机或卧式螺旋沉降离心机。
其次，对离心后的紫苏籽肽离心液进行过滤处理。
具体地，所述过滤为多级过滤处理，包括：
采用孔径为10-50nm的滤膜，对离心后的紫苏籽肽酶解液进行一级过滤，截留紫苏籽肽离心液中分子量较大的成分，收集透过液得到一级滤液；
为了减少紫苏籽肽离心液中的盐含量，在一级过滤的基础上继续使用纳滤膜去除小分子物质，使后续纯化步骤中导电物质主要为带电氨基酸及短肽。可采用孔径为0.5-2nm的纳滤膜对所述一级过滤液进行二级过滤，对一级滤液中的小分子物质如盐、游离氨基酸等进行分离，收集截留液得到二级滤液。
具体地，一级过滤中可使用10-50nm的陶瓷膜。在控制过滤膜的孔径外，为了保证过滤效率，需对过滤处理的温度、压力进行控制。具体地，一级过滤中，控制温度为40-80℃，过滤压差为0.2-0.4MPa；二级过滤中，控制温度为30-60℃，过滤压差为1.8-2.5MPa。
最后，为了便于后续电场纯化处理，可对过滤处理后收集到的滤液进行蒸发浓缩，通过浓缩使得滤液在后续电场纯化处理中，导电介质密度增加，提高电场纯化效率，同时减少后续处理所需时间及能耗。经研究发现，当浓缩液中可溶性固形物浓度高于35％时，在后续加热浓缩过程中容易产生沉淀，而低于20％时，滤液体积过大，无法起到预期的效果，因此，可在温度为60-90℃、压力为0.02-0.06MPa条件下，对紫苏籽肽二级滤液进行浓缩，直至浓缩得到可溶性固形物浓度为20-35％的紫苏籽肽浓缩液。本领域技术人员可依据常规技术进行浓缩操作，例如可采用真空蒸发浓缩设备进行减压蒸发浓缩。
为了进一步提高目标肽段的质量含量，在初级纯化处理后进行电场纯化处理，采用长度与横截面积比为0.2-0.5cm-1的电场槽，并且基于每升所述紫苏籽肽浓缩液，所述电场纯化处理的纯化电压为5-25V。
具体地，可以利用长度与横截面积比L/(W*H)在0.2-0.5cm-1的长方体电场槽，以每升紫苏籽肽浓缩液对应富集电压5-25V进行富集。例如：实验室所用电场槽为聚丙烯材质，电场槽尺寸为12cm*5cm*5cm(L*W*H)，铜材质电极，工作电压5-220V，通过整流器形成直流电。工业生产可使用的电场槽材质及电极与实验所用相同，尺寸为250cm*30cm*30cm(L*W*H)，通过整流器与可连续变压的升压变压器实现220-2200V的直流工作电压。在将紫苏籽肽浓缩液泵入电场槽后，连通电路，通电20-30min后，由电场槽上方正中插入厚度为0.5cm的聚丙烯隔板，将电场槽内液体分为正极及负极两部分，断电后将负极端的溶液泵出。
电场纯化处理后，负极端存在电解出的氢离子，导致溶液pH下降，因此，在电场纯化处理后，调节负极端溶液pH至6.6-7.0。具体地，可以使用NaOH溶液进行调节。
在电场纯化处理后，还包括对其进行灭菌、干燥处理，得到紫苏籽肽。
具体地，灭菌条件可以采用蒸汽换热的方式在115-125℃下维持15-20s。干燥可使用冷冻干燥或喷雾干燥的方式，具体地，喷雾干燥中设置干燥条件为进风温度140-180℃，出风温度90-110℃。
通过上述酶解工艺与分离纯化工艺，不仅能够保留紫苏籽蛋白粉中的pER、AR以及MR肽段，更通过适宜的工艺参数能够使肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g。
本发明还提供了上述任一所述的紫苏籽肽在改善男性性功能产品中的应用。
通过大量研究数据证明，本发明的肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g的紫苏籽肽具有明显改善男性性功能的作用，可以认为，除常规意义上的食品应用外，更可用于保健品、功能性药品原料等，从而拓宽了紫苏籽蛋白的应用范围，为紫苏的深加工提供了新的方向。
并且，该紫苏籽肽中，蛋白质的质量含量≥80％，肽的质量含量≥60％，具有较高的产品价值，并且有利于被人体肠道完整吸收，更易在人体内发挥作用。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明提供的紫苏籽肽，明确含有pER、AR以及MR的功能肽段，并且pER的含量≥10mg/100g、AR的含量≥40mg/100g、MR的含量≥10mg/100g，具有明显改善男性性功能的作用，可用于常规食品、保健品、功能性药品等原料中，拓宽了紫苏籽蛋白的应用范围，为紫苏的深加工提供了新的方向。
2、本发明提供的紫苏籽肽的制备方法，通过采用特殊的酶解、初级纯化以及电场纯化处理，得到具有pER含量≥10mg/100g，AR含量≥40mg/100g，MR含量≥10mg/100g的紫苏籽肽。
附图说明
图1为本发明实施例及对比例中鉴定pER、AR以及MR所用的1μg/mL标样质谱图；
图2为本发明800μg/mL实施例1中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图3为本发明800μg/mL实施例2中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图4为本发明800μg/mL实施例3中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图5为本发明800μg/mL对比例1中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图6为本发明800μg/mL对比例2中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图7为本发明800μg/mL对比例3中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
图8为本发明各试验组与血清睾酮浓度的关系图；
图9为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清睾酮浓度的关系图；
图10为本发明各试验组与血清黄体生成素浓度的关系图；
图11为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清黄体生成素浓度的关系图；
图12为本发明各试验组与血清卵泡刺激素浓度的关系图；
图13为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清卵泡刺激素浓度的关系图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例中，酸性蛋白酶(酶活力为20万U/g)、中性蛋白酶(酶活力为30万U/g)，生产厂商为杜邦丹尼斯克；木瓜蛋白酶(酶活力为80万U/g)，购自南宁庞博生物工程有限公司。
实施例1
本实施例的紫苏籽肽按照以下方法制备得到：
1、将100g蛋白质量含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于1000mL温度为50℃的水中搅拌均匀，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节匀浆的pH至6.0后，在50℃保温条件下，同时加入酸性蛋白酶0.2g，中性蛋白酶0.4g，木瓜蛋白酶0.15g，在搅拌下酶解3小时后，煮沸30min进行灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3、采用台式离心机对该紫苏籽肽酶解液进行离心，在离心速度3000rpm下离心10min，得到约800mL的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在50℃且膜进出口压力差为0.25MPa下，采用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对紫苏籽肽酶解离心液进行一级过滤，期间补约1000mL温度为50℃的纯净水，得到约1600mL的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.0MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，得到约1000mL的二级滤液，此外，对二级滤液进行折光度检测，其中，可溶性固形物浓度约为6％；
5、在温度为80℃、压力为0.02MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到200mL的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为31％；
6、将紫苏籽肽浓缩液倒入尺寸为12cm*5cm*5cm(L*W*H)、材质为聚丙烯的直流电场槽中，使用铜电极，在5V直流电压下，处理30min后，插入分离隔板，断电后抽出负极端液体，约100mL，并调节pH至6.8，随后在冷阱温度-60℃，真空度为0.09-0.098MPa条件下，冷冻干燥负极端液体24小时，得到紫苏籽肽。
产物测定
1、紫苏籽肽成分分析
采用GB/T 5009.5中的实验方法检测紫苏籽肽中蛋白含量，GB/T 5009.3中的实验方法检测紫苏籽肽中的水分，GB/T 5009.4中的实验方法检测紫苏籽肽中的灰分，GB/T22492-2008大豆肽粉中附录规定的实验方法检测紫苏籽肽中的低聚肽含量。
经检测，本实施例制得的紫苏籽肽质量为31.2g，蛋白含量为88.20％(干基)，水分3.05％，灰分6.11％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为70.58％，收率31.2％。
2、紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量检测
利用超高效液相色谱仪Nexera X2与三重四极杆质谱仪联用系统(岛津，日本)对本实施例中的紫苏籽肽中的肽组分进行鉴定。
液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3(5μm，2.1*250mm)；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液；二元梯度洗脱程序：0-15min，B 0-50％；15-20min，B 50-100％；20-25min，B 100％；25-35min，B 0％；流速：0.2mL/min；进样体积：1μL；柱温：40℃。
质谱条件：离子化模式：ESI，正离子模式；离子喷雾电压：+4.5kV；雾化气流速：氮气3.0L/min；加热气流速：氮气10L/min；干燥气流速：氮气10L/min；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；离子源温度：300℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：100ms；延迟时间：3ms；MRM参数：见表1。
表1
Figure BDA0002406367890000101
*表示定量离子
肽段标准品配制：分别准确称取pER、AR以及MR标准品粉末20.0mg，加水溶解，涡旋混匀，定容至100mL，即为200μg/mL的标准储备液。分别取500μL上述标准储备液，定容至10mL，即得混合标准母液10μg/mL。将上述混合标准母液用纯水逐级稀释至0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2.5、5和10μg/mL的系列标准工作溶液。
图1为本发明实施例及对比例中鉴定pER、AR以及MR所用的1μg/mL标样质谱图，图2为本发明800μg/mL实施例1中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图。
通过图2和图1的比对可知，本实施例1中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分析并对比标准曲线可知：本实施例1制备的紫苏籽肽中pER含量为10.45mg/100g，AR含量为41.78mg/100g，MR含量为10.44mg/100g。
实施例2
本实施例的紫苏籽肽按照以下方法制备得到：
1、将100kg蛋白质含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于装有800L温度为52℃纯水的酶解罐中，搅拌并定容至1.2m3，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节匀浆pH至6.0后，在51℃保温条件下，同时加入酸性蛋白酶200g，中性蛋白酶400g，木瓜蛋白酶150g，在搅拌下酶解3小时后使用板式换热器以蒸汽为热介质对酶解体系进行加热灭酶后，得到紫苏籽肽酶解液，灭酶条件为125℃，20s；
3、采用卧式螺旋沉降离心机在主电机转速3480rpm，副电机转速2860rpm下对紫苏籽肽酶解液进行离心，得到约1050L的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在40℃且膜工作压力差为0.3MPa下，采用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对紫苏籽肽酶解离心液进行一级过滤，期间补约800L温度为40℃的纯净水，得到约1600L的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.5MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，过滤过程中补约200L温度为40℃的纯净水，得到约1850L的二级滤液，此时，二级滤液中可溶性固形物浓度约为3.2％；
5、在温度为85℃、压力为0.04MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到约210L的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为28％；
6、将紫苏籽肽浓缩液倒入尺寸为250cm*30cm*30cm(L*W*H)、材质为聚丙烯的直流电场槽中，使用铜电极，在2200V直流电压下，处理30min后，插入分离隔板，断电后泵出负极端液体，约105L，并加入预先调配的30％浓度的NaOH，调节pH至6.8，随后使用板式换热器以蒸汽为热介质对收集到的负极端液体进行灭菌，灭菌条件为125℃，20s，并进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为进风温度160℃，出风温度90℃，得到紫苏籽肽。
产物测定
1、采用与实施例1相同的方法对本实施例得到的紫苏籽肽进行成分分析，结果显示，本实施例制得的紫苏籽肽质量为29.5kg，蛋白含量为85.3％(干基)，水分5.15％，灰分6.11％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为74.1％，收率29.5％。
2、采用与实施例1相同的方法对紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量进行检测。
图3为本发明800μg/mL实施例2中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图。
通过图3和图1的比对可知，本实施例2中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分析并对比标准曲线可知：本实施例2制备的紫苏籽肽中pER含量为10.37mg/100g，AR含量为40.58mg/100g，MR含量为10.19mg/100g。
实施例3
1、将100kg蛋白质含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于装有800L温度为52℃纯水的酶解罐中，搅拌并定容至1.2m3，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节匀浆pH至6.0后，在51℃保温条件下，同时加入酸性蛋白酶320g，中性蛋白酶530g，木瓜蛋白酶200g，在搅拌下酶解3小时后使用板式换热器以蒸汽为热介质对酶解体系进行加热灭酶后，得到紫苏籽肽酶解液，灭酶条件为125℃，20s；
3、采用卧式螺旋沉降离心机在主电机转速3480rpm，副电机转速2860rpm下对紫苏籽肽酶解液进行离心，得到约1050L的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在40℃且膜工作压力差为0.3MPa下，采用孔径为50nm的无机陶瓷滤膜对紫苏籽肽酶解离心液进行一级过滤，期间补约800L温度为40℃的纯净水，得到约1850L的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.5MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，过滤过程中补约200L温度为40℃的纯净水，得到约2000L的二级滤液，此时，二级滤液中可溶性固形物浓度约为3.1％；
5、在温度为85℃、压力为0.04MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到约250L的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为25.0％；
6、将紫苏籽肽浓缩液倒入尺寸为250cm*30cm*30cm(L*W*H)、材质为聚丙烯的直流电场槽中，使用铜电极，在2200V直流电压下，处理30min后，插入分离隔板，断电后泵出负极端液体，约125L，并加入预先调配的30％浓度的NaOH，调节pH至7.0，随后使用板式换热器以蒸汽为热介质对收集到的负极端液体进行灭菌，灭菌条件为125℃，20s，并进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为进风温度160℃，出风温度90℃，得到紫苏籽肽。
产物测定
1、采用与实施例1相同的方法对本实施例得到的紫苏籽肽进行成分分析，结果显示，本实施例制得的紫苏籽肽质量为32.3kg，蛋白含量为82.4％(干基)，水分4.05％，灰分5.11％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为73.5％，收率32.3％。
2、采用与实施例1相同的方法对紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量进行检测。
图4为本发明800μg/mL实施例3中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图。
通过图4和图1的比对可知，本实施例3中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分析并对比标准曲线可知：本实施例3制备的紫苏籽肽中pER含量为10.08mg/100g，AR含量为41.22mg/100g，MR含量为10.37mg/100g。
对比例1
本对比例的紫苏籽肽按照以下方法制备得到：
1、将100g蛋白质量含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于1000mL温度为50℃的水中搅拌均匀，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节匀浆的pH至6.0后，在50℃保温条件下，加入中性蛋白酶0.4g，木瓜蛋白酶0.15g，在搅拌下酶解3小时后，煮沸30min进行灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3、采用台式离心机对该紫苏籽肽酶解液进行离心，在离心速度3000rpm下离心10min，得到约800mL的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在50℃且膜进出口压力差为0.25MPa下，采用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对紫苏籽肽酶解离心液进行一级过滤，期间补约1000mL温度为50℃的纯净水，得到约1600mL的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.0MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，得到约1000mL的二级滤液，此时，二级滤液中可溶性固形物浓度约为5.5％；
5、在温度为80℃、压力为0.02MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到200mL的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为29.2％；
6、将紫苏籽肽浓缩液倒入尺寸为12cm*5cm*5cm(L*W*H)、材质为聚丙烯的直流电场槽中，使用铜电极，在5V直流电压下，处理30min后，插入分离隔板，断电后抽出负极端液体，约100mL，并调节pH至6.8，随后在冷阱温度-60℃，真空度为0.09-0.098MPa条件下，冷冻干燥负极端液体24小时，得到紫苏籽肽。
产物检测：
1、采用与实施例1相同的方法对本对比例得到的紫苏籽肽进行成分分析，结果显示，本对比例制得的紫苏籽肽质量为28.5g，蛋白含量为83.1％(干基)，水分2.27％，灰分4.26％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为74.8％，收率28.5％。
2、采用与实施例1相同的方法对紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量进行检测。
图5为本发明800μg/mL对比例1中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
通过图5和图1的比对可知，本对比例1中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分析并对比标准曲线可知：本对比例制备的紫苏籽肽中pER含量为7.56mg/100g，AR含量为30.84mg/100g，MR含量为7.44mg/100g。
对比例2
本对比例的紫苏籽肽按照以下方法制备得到：
1、将100g蛋白质量含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于1000mL温度为50℃的水中搅拌均匀，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节匀浆的pH至6.0后，在50℃保温条件下，加入酸性蛋白酶0.2g，中性蛋白酶0.4g，木瓜蛋白酶0.15g，在搅拌下酶解3小时，煮沸30min灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3、利用台式离心机对该紫苏籽肽酶解液进行离心，在离心速度3000rpm下离心10min，得到约800mL的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在50℃且膜进出口压力差为0.25MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对离心液进行一级过滤，期间补约1000mL温度为50℃的纯净水，保留透过液，得到约1600mL的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.0MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，得到约1000mL的二级滤液，此外，对二级滤液进行折光度检测，其中，可溶性固形物浓度约为6％；
5、在温度为80℃、压力为0.02MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到200mL的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为30.2％；
6、在不进行电场纯化的情况下，在冷阱温度-60℃，真空度为0.09-0.098MPa条件下，冷冻干燥负极端液体24小时，得到紫苏籽肽。
产物检测：
1、采用与实施例1相同的方法对本对比例得到的紫苏籽肽进行成分分析，结果显示，本对比例制得的紫苏籽肽质量为59.1g，蛋白含量为80.9％(干基)，水分2.54％，灰分4.11％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为71.1％，收率59.1％。
2、采用与实施例1相同的方法对紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量进行检测。
图6为本发明800μg/mL对比例2中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
通过图6和图1的比对可知，本对比例2中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分，对比标准曲线可知：本实施例制备的紫苏籽肽中pER含量为4.27mg/100g，AR含量为16.36mg/100g，MR含量为4.29mg/100g。
对比例3
本对比例的紫苏籽肽按照以下方法制备得到
1、将100g蛋白质量含量为80％的紫苏籽蛋白粉溶于1000mL温度为50℃的水中搅拌均匀，得到紫苏籽蛋白匀浆；
2、用10％的HCl溶液调节浆液pH至6.0后，在50℃保温条件下，同时加入酸性蛋白酶0.2g，中性蛋白酶0.4g，木瓜蛋白酶0.15g，在搅拌下酶解3小时后，煮沸30min进行灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3、采用台式离心机对该紫苏籽肽酶解液进行离心，在离心速度3000rpm下离心10min，得到约800mL的紫苏籽肽酶解离心液；
4.1、在50℃且膜进出口压力差为0.25MPa下，采用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对紫苏籽肽酶解离心液进行一级过滤，期间补约1000mL温度为50℃的纯净水，得到约1600mL的一级滤液；
4.2、采用孔径为2nm的纳滤膜，在2.0MPa的压力，40℃的温度下，对一级滤液进行二级过滤，得到约1000mL的二级滤液，此外，对二级滤液进行折光度检测，其中，可溶性固形物浓度约为6％；
5、在温度为80℃、压力为0.02MPa条件下，对二级滤液进行减压浓缩，得到200mL的紫苏籽肽浓缩液，其中，可溶性固形物约为30％；
6、向紫苏籽肽浓缩液中加入15g预处理好的罗门哈斯Amberlite IRA402Cl阴离子交换树脂，处理1小时，离心去除树脂，收集上清液，随后在冷阱温度-60℃，真空度为0.09-0.098MPa条件下，冷冻干燥上清液24小时，得到紫苏籽肽。
产物检测：
1、采用与实施例1相同的方法对本对比例得到的紫苏籽肽进行成分分析，结果显示，本对比例制得的紫苏籽肽质量为55g，蛋白含量为76.80％(干基)，水分2.05％，灰分9.95％，紫苏籽肽的低聚肽的质量含量为70.68％，收率55％。
2、采用与实施例1相同的方法对紫苏籽肽中功能肽段pER、AR以及MR的含量进行检测。
图7为本发明800μg/mL对比例3中紫苏籽肽中pER、AR以及MR质谱图；
通过图7和图1的比对可知，本对比例3中的紫苏籽肽中同时存在肽段pER、AR以及MR。通过对实验谱图进行峰面积分，对比标准曲线可知：本实施例制备的紫苏籽肽中pER含量为7.78mg/100g，AR含量为31.62mg/100g，MR含量为7.68mg/100g。
利用下述方法对紫苏籽肽样品的改善男性性功能作用进行评价：
雄性SD大鼠110只，随机分为11组，分别为空白组，模型组，阳性对照组，实施例1-低剂量组(0.3g/kg BW)，实施例1-中剂量组(0.45g/kg BW)，实施例1-高剂量组(0.6g/kgBW)，实施例2(0.45g/kg BW)，实施例3(0.45g/kg BW)，对比例1(0.45g/kg BW)，对比例2(0.45g/kg BW)，对比例3(0.45g/kg BW)，共11组，每组10只。除空白组外，其余各组每天腹腔注射环磷酰胺(CP)20mg/kg，连续7天，建立生殖功能损伤大鼠模型，空白组每天注射等体积生理盐水，之后8组处理组分别灌胃相应剂量的紫苏籽肽，阳性对照组灌胃5mg/kg西地那非，空白组与模型组灌胃等体积的生理盐水，连续灌胃42d，之后禁食1d。采用眼眶采血法收集大鼠血液，3000rpm离心20min后收集血清，ELISA法测定大鼠血清中睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)的浓度。
1、血清睾酮(T)浓度测定
睾丸素又称睾酮、睾丸酮或睾甾酮，男性由睾丸分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。睾酮对男子生殖器官及其它重要器官的作用相当复杂，可影响许多身体系统和功能，包括：血生成，体内钙平衡，骨矿化作用，脂代谢，糖代谢和前列腺增长。它是主要的男性性激素及同化激素，拥有包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功效。
图8为本发明各试验组与血清睾酮浓度的关系图，图9为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清睾酮浓度的关系图。
如图8所示，模型组显著降低了大鼠血清睾酮的浓度，空白组血清睾酮浓度是模型组的1.23倍，阳性组和实施例1-3组(其中，实施例1为中剂量组结果)均能显著提升血清睾酮浓度，而对比例1-3组提升血清睾酮浓度的作用并不明显。如图9所示，实施例1的各剂量中，中剂量提升血清睾酮浓度的能力最强。
2、血清黄体生成素(LH)浓度测定
促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)也称黄体生成素，是腺垂体产生的一种激素，成分为糖蛋白，可刺激睾丸间质细胞发育并促进其分泌睾酮，故又称间质细胞促进素，作用于睾丸间质细胞促进睾酮分泌时同时可控制间质细胞的数量，任何因素造成前者结构和功能的改变，都会影响睾酮的生成。
图10为本发明各试验组与血清黄体生成素浓度的关系图，图11为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清黄体生成素浓度的关系图。如图10所示，模型组显著降低了血清黄体生成素水平，空白组血清黄体生成素的浓度是模型组的3.50倍，阳性组和实施例1-3组(其中，实施例1为中剂量组结果)及对比例1-3组都可显著提升血清黄体生成素浓度，其中实施例1组的提升效果最明显。如图11所示，实施例1的各剂量中，中剂量对血清黄体生成素的提升效果最明显。
3、血清卵泡刺激素(FSH)浓度测定
卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)，是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白，与黄体生成素统称促性腺激素。卵泡刺激素调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程，刺激生殖细胞的成熟。作用于睾丸曲细精管时，可促进精子形成，在形成精子过程中起到至关重要的作用。LH与FSH联合检测，可用于鉴别男性原发性或继发性睾丸功能低下。
图12为本发明各试验组与血清卵泡刺激素浓度的关系图，图13为本发明实施例1的紫苏籽肽在不同剂量下与血清卵泡刺激素浓度的关系图。如图12所示，模型组显著降低了血清卵泡刺激素水平，空白组血清卵泡刺激素的浓度是模型组的1.23倍，阳性组和实施例1组(为中剂量组结果)都可显著提升血清卵泡刺激素水平，而对比例1-3组对血清卵泡刺激素的提升作用并不明显。如图13所示，实施例1各剂量中，中剂量和高剂量都可显著提升血清中卵泡刺激素水平，但中剂量和高剂量组之间并无显著性差异。
图8-图13中，“*”代表与模型组比较，P<0.05。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种能改善男性性功能的紫苏籽肽，其特征在于，所述紫苏籽肽组成中至少包括肽段pER、AR以及MR；
基于紫苏籽肽的质量，所述肽段pER的含量≥10mg/100g、肽段AR的含量≥40mg/100g、肽段MR的含量≥10mg/100g。
2.根据权利要求1所述的紫苏籽肽，其特征在于，所述紫苏籽肽中蛋白质的质量含量≥80％，肽的质量含量≥60％。
3.根据权利要求1所述的紫苏籽肽，其特征在于，所述紫苏籽肽是以紫苏籽蛋白粉为原料依次进行酶解、初级纯化以及电场纯化处理后获得；
其中，所述酶解处理包括同时使用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解。
4.一种权利要求1-3任一项所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将紫苏籽蛋白粉与水混合形成匀浆；
2)同时加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行2-4h的酶解，灭酶，得到紫苏籽肽酶解液；
3)对所述紫苏籽肽酶解液依次进行初级纯化以及电场纯化处理后得到所述紫苏籽肽。
5.根据权利要求4所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，所述紫苏籽蛋白粉与水的质量比不高于1：5。
6.根据权利要求4所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，基于所述紫苏籽蛋白粉中的蛋白含量，每克蛋白对应所述酸性蛋白酶的用量为300-800U，中性蛋白酶的用量为1500-2000U，木瓜蛋白酶的用量为1500-2000U。
7.根据权利要求4所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，所述初级纯化包括：对所述紫苏籽肽酶解液依次进行离心、过滤、浓缩后得到紫苏籽肽浓缩液。
8.根据权利要求7所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，所述过滤为多级过滤处理，包括：
采用孔径为10-50nm的滤膜，对离心后的紫苏籽肽酶解液进行一级过滤，得到一级滤液；
采用孔径为0.5-2nm的纳滤膜对所述一级滤液进行二级过滤，得到二级滤液。
9.根据权利要求8所述的紫苏籽肽的制备方法，其特征在于，采用长度与横截面积比为0.2-0.5cm-1的电场槽进行所述电场纯化处理，并且基于每升所述紫苏籽肽浓缩液，所述电场纯化处理的纯化电压为5-25V。
10.权利要求1-3任一项所述的紫苏籽肽在改善男性性功能产品中的应用。
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KIM JM等: "Purification and identification of an antioxidant peptide from perilla seed (Perilla frutescens) meal protein hydrolysate", 《FOOD SCI NUTR》 *
MINGLIANG LI等: "Perilla peptides delay the progression of kidney disease by improving kidney apoptotic injury and oxidative stress and maintaining intestinal barrier function", 《FOOD BIOSCIENCE》 *
李明亮 等: "紫苏籽肽对环磷酰胺致性功能损伤大鼠的改善作用", 《食品科学》 *
王雨晴等: "紫苏籽低聚肽中营养及特征成分研究", 《食品与发酵工业》 *

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