CN113368118B - 磷脂酰胆碱在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了磷脂酰胆碱在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，属于药学领域。本发明通过提供口服2.5％葡聚糖硫酸钠的小鼠结肠炎模型，探究发现PC 18:1/16:0具有良好的治疗活性；并通过实验证明，PC 18:1/16:0可以有效缓解溃疡性结肠炎导致的体重降低和结肠缩短，维持结肠上皮细胞和杯状细胞形态，缓解炎性浸润。另外，PC 18:1/16:0能够显著降低炎症因子表达，从而缓解溃疡性结肠炎的病变。具有潜在的制药应用前景。

Description

磷脂酰胆碱在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别是涉及磷脂酰胆碱在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)是一种慢性炎症性疾病，其病变多起于直肠，通常可累及部分乃至整个结肠，部分直肠炎和乙状结肠炎患者炎症也有可能发生在盲肠部位。血性腹泻为该疾病最典型的症状，病程漫长不定，常反复发作。且炎症性肠病病因尚不明确，对疾病诊疗带来了困难。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)是磷脂的一种，是细胞膜和细胞器膜的重要组成部分。磷脂酰胆碱由含胆碱的亲水头部和两条甘油磷酸酯尾部组成。构成PC(18:1/16:0)的脂肪酸链为十八碳单不饱和脂肪酸和十六烷酸。磷脂酰胆碱作为一种生物活性脂质，可作为信号通路中第二信使前体来源，参与抗炎调控过程。本申请通过进一步实验发现磷脂酰胆碱18:1/16:0(PC 18:1/16:0)对溃疡性结肠炎有显著治疗效果。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了磷脂酰胆碱在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
技术方案：本发明所述磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明所述磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗葡聚糖硫酸钠导致的溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明所述磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗鼠溃疡性结肠炎的药物中的应用。
进一步的，所述药物为磷脂酰胆碱18:1/16:0混悬液。所述药物注射给药，给药剂量为1-4mg/kg，优选2mg/kg。
有益效果：本发明通过提供口服2.5％葡聚糖硫酸钠的小鼠结肠炎模型，探究发现PC18:1/16:0具有良好的治疗活性；并通过实验证明，PC 18:1/16:0可以有效缓解溃疡性结肠炎导致的体重降低和结肠缩短，维持结肠上皮细胞和杯状细胞形态，缓解炎性浸润。另外，PC18:1/16:0能够显著降低炎症因子表达，从而缓解溃疡性结肠炎的病变。具有潜在的制药应用前景。
附图说明
图1是PC(18:1/16:0)改善体重下降结果；
图2是PC(18:1/16:0)缓解结肠缩短；
图3是PC(18:1/16:0)维持结肠上皮细胞和杯状细胞形态、缓解炎性浸润；
图4是PC(18:1/16:0)降低结肠炎小鼠体内炎症因子TNF-α的水平；
图5是PC(18:1/16:0)降低结肠炎小鼠体内炎症因子IL-1β的水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：PC(18:1/16:0)治疗葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎的应用研究
步骤一：实验分组(8周周龄C57雄鼠，n＝6)
i)对照组：开始造模后，每天腹腔注射生理盐水(0.2mL/20g)，自由进食、饮水。
ii)造模组：自由进食，自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。开始造模后，每天腹腔注射等体积生理盐水(0.2mL/20g)。
iii)治疗组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后，每天腹腔注射2mg/kg PC(18:1/16:0)混悬液。
iiii)阳性药组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后，每天灌胃100mg/kg柳氮磺吡啶(SASP)混悬液。
步骤二：建立溃疡性结肠炎模型
i)2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液配制：用电子天平称量葡聚糖硫酸钠12.5g，转移到500ml玻璃瓶中。加入500ml超纯水，超声15min溶解。
ii)溃疡性结肠炎造模：将配制好的2.5％葡聚糖水溶液置于造模组、治疗组小鼠笼盖上，让小鼠自由饮用7天。
步骤三：PC(18:1/16:0)对溃疡性结肠炎引起的体重降低的改善
开始造模后，每24h记录各小鼠的体重。
结果表明，PC(18:1/16:0)可以显著减缓小鼠的体重降低(图1)、维持结肠长度(图2)。
实施例2：PC(18:1/16:0)治疗葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎的药理研究
步骤一：实验分组(8周周龄C57雄鼠，n＝6)
i)对照组：开始造模后，每天腹腔注射生理盐水(0.2mL/20g)，自由进食、饮水。
ii)造模组：自由进食，自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。开始造模后，每天腹腔注射生理盐水(0.2mL/20g)。
iii)治疗组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后，每天腹腔注射2mg/kg PC(18:1/16:0)混悬液。
iiii)阳性药组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后每天灌胃100mg/kg柳氮磺吡啶(SASP)混悬液。
步骤二：建立溃疡性结肠炎模型
i)2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液配制：用电子天平称量葡聚糖硫酸钠12.5g，转移到500ml玻璃瓶中。加入500ml超纯水，超声15min溶解。
ii)溃疡性结肠炎造模：将配制好的2.5％葡聚糖水溶液置于造模组、治疗组小鼠笼盖上，让小鼠自由饮用7天。
步骤三：组织石蜡包埋切片
i)取材：新鲜结肠肠段固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织放入写有对应编号的脱水盒内。
ii)脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精2h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I1h-无水乙醇II 1h-二甲苯I 45min-二甲苯II 45min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
iii)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入不锈钢包埋模具，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入不锈钢包埋模具。于冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从不锈钢包埋模具中取出并修整蜡块。
iv)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机45℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进65℃烘箱内烤片。
步骤四：HE染色
i)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
ii)苏木素染细胞核：切片入冰冻苏木素染3-8min，自来水洗，促蓝液促蓝，流水冲洗。
iii)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
iv)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出稍微晾干，中性树胶封片。
结果表明，PC(18:1/16:0)能够维持结肠上皮细胞和杯状细胞形态、缓解炎性浸润(图3)。
实施例3：PC(18:1/16:0)治疗葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎的机制研究
步骤一：实验分组(8周周龄C57雄鼠，n＝6)
i)对照组：开始造模后，每天腹腔注射生理盐水(0.2mL/20g)，自由进食、饮水。
ii)造模组：自由进食，自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。开始造模后，每天腹腔注射等体积生理盐水(0.2mL/20g)。
iii)治疗组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后，每天腹腔注射2mg/kg PC(18:1/16:0)混悬液。
iiii)阳性药组：自由进食、自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液。成模后每天灌胃100mg/kg柳氮磺吡啶(SASP)混悬液。
步骤二：建立溃疡性结肠炎模型
i)2.5％葡聚糖硫酸钠水溶液配制：用电子天平称量葡聚糖硫酸钠12.5g，转移到500ml玻璃瓶中。加入500ml超纯水，超声15min溶解。
ii)溃疡性结肠炎造模：将配制好的2.5％葡聚糖水溶液置于造模组、治疗组小鼠笼盖上，让小鼠自由饮用7天。
步骤三：ELISA
i)工作液配置：从试剂盒中取出稀释液、生物素化抗体、浓缩酶结合物、浓缩洗涤液，并按说明书配制成工作液。
ii)提蛋白：将肠组织置于匀浆器中剪碎，加入RIPA(含PMSF)匀浆，静置30min，每5min混匀一次。然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清。用BCA试剂盒定蛋白。
iii)加样：取100μl匀浆上清液，加入孔中，再加入50μl生物素化抗体工作液。
iv)孵育：用封板胶纸封住反应孔，在振荡器上25℃孵育120min，振荡频率300rpm。
v)清洗：每孔加入洗涤液350μl，静置30s后甩干液体，重复5次。
vi)酶结合：每孔加入100μl酶结合物工作液，用封板胶纸封住反应孔。
vii)酶结合反应：在振荡器上25℃孵育60min，振荡频率300rpm。
viii)清洗：每孔加入洗涤液350μl，静置30s后甩干液体，重复5次。
ix)显色：每孔加入100μl显色底物，25℃避光孵育10min。
x)测定吸光度：每孔加入100μl终止液，混匀后立即测量OD450值。
结果表明，PC(18:1/16:0)能够下调TNF-α和IL-1β的表达，进而减轻肠道炎症。(图4-5)。

Claims (6)

1.磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
2.磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗葡聚糖硫酸钠导致的溃疡性结肠炎的药物中的应用。
3.磷脂酰胆碱18:1/16:0在制备治疗鼠溃疡性结肠炎的药物中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述应用，其特征在于，所述药物为磷脂酰胆碱18:1/16:0混悬液。
5.根据权利要求1-3中任一所述应用，其特征在于，所述药物给药方式为注射，给药剂量为1-4mg/kg。
6.根据权利要求1-3中任一所述应用，其特征在于，所述药物给药方式为注射，给药剂量为2mg/kg。
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