CN115645464B - 一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物及其应用。目前治疗高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化的西药包括他汀类和贝特类药物，均存在一定的肝功能损伤副作用，用药期间应定期检查肝功能和磷酸激酶水平。本发明首次组合陈皮、牡丹皮、丁香为治疗方药，上述组合中，陈皮理气化痰化湿、牡丹皮清热凉血、丁香温胃降逆。经小鼠模型实验验证，该组合物能有效减轻高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化病变，且不产生肝功能损害的副作用。此外，本发明提供的治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物能够明显提高肠道中产短链脂肪酸的菌属，能够实现调节高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化的药效。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物及其应用。
背景技术
心脑血管疾病依然是致死率最高的疾病，心梗、脑梗、脑出血等疾病的基础主要是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是动脉壁发生的一种慢性炎症，开始于脂质沉积，再引起动脉壁巨噬细胞泡沫化，动脉平滑肌增生等病变，最后导致血管腔狭窄。目前预防和治疗动脉粥样硬化，将高血脂作为最大的危险因素，但血脂正常并不代表血管壁脂质就不会发生沉积。他汀类药物虽然能较好调整血脂，大样本的流调结果显示，他汀类药物对降低动脉粥样硬化相关疾病如心肌缺血、心梗、脑梗等疾病发病率并不理想，心脑血管疾病的发病率依然呈增长趋势。他汀类药物是治疗高脂血症的首选药物，也是动脉粥样硬化一线药物,他汀类药物每年市场300亿美元。脂肪肝治疗方面，目前仍以降脂药为主，但他汀类药物对肝功能存在一定的副作用，长期服用，存在一定风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物。本发明从数种中药中提取有效成分再组方，在降低血脂、调节肠道菌和保护血管两方面都超过他汀。
本发明的另一目的在于，提供上述治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物，由陈皮提取物、牡丹皮及丁香提取物组成。
所述的陈皮提取物为陈皮经乙醇回流浓缩得到或经超临界CO2萃取得到。
所述的牡丹皮及丁香提取物为牡丹皮及丁香经水蒸气蒸馏得到或经超临界CO2萃取得到。
所述的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)陈皮经乙醇回流提取，浓缩后得到陈皮提取液；
(2)将牡丹皮和丁香加水浸泡，水蒸气蒸馏后得到牡丹皮及丁香蒸馏液；
(3)将陈皮提取液和牡丹皮及丁香蒸馏液混合得到治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物。
步骤(1)所述的乙醇的体积与陈皮的质量比值为1～5mL：1g；优选为3mL：1g。
步骤(1)所述的乙醇浓度为50～70％；优选为50％。
步骤(1)所述的回流提取的时间为30min～2h；优选为1h。
步骤(1)所述的陈皮提取液的质量与陈皮的质量比为1～5:1；优选为1:1。
步骤(1)所述的陈皮提取液中还加入了增溶剂；优选为加入增溶剂吐温80。
所述的增溶剂的加入量为陈皮提取液质量的1～3％；优选为2％。
步骤(2)所述的牡丹皮的质量、丁香的质量和水的体积的比值为1～5g：1～5g：10mL；优选为1g:1g:10mL。
步骤(2)所述的浸泡为浸泡5～10h；优选为浸泡8h。
步骤(2)所述的水蒸气蒸馏为蒸馏到初始体积的50～70％；优选为蒸馏到初始体积的60％。
所述的陈皮、牡丹皮和丁香的质量比为1～3：1～3：1～3；优选为1：1：1。
上述治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物在制备用于治疗高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化病变的产品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、目前治疗高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化的西药包括他汀类和贝特类药物，均存在一定的肝功能损伤副作用，用药期间应定期检查肝功能和磷酸激酶水平。在中药治疗方面，未有同时治疗高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化药效的药物报道。本发明组合物由陈皮、牡丹皮、丁香三种中药组成，此三种中药从未有肝功能损害副作用报道。本发明首次组合陈皮、牡丹皮、丁香为治疗方药，上述组合中，陈皮理气化痰化湿、牡丹皮清热凉血、丁香温胃降逆。经小鼠模型实验验证，该组合物能有效减轻高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化病变，且不产生肝功能损害的副作用。
2、肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸，与脂肪肝和动脉粥样硬化发病密切相关，目前尚无该方面药物报道。本发明提供的治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物可以明显提高肠道中产短链脂肪酸的菌属，能够实现调节高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化的药效。
附图说明
图1是实施例3中小鼠主动脉的油红O染色图。
图2是实施例3中小鼠肝脏切片HE染色图。
图3是实施例3中小鼠血液中LDL-C浓度测定结果图。
图4是实施例3中小鼠肠道菌群分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
(1)取陈皮100克，加入300ml 50％乙醇回流提取一小时，挥去乙醇后，浓缩至98ml(约100g)，再加入2ml吐温80增溶，得到陈皮提取液。
(2)取牡丹皮100克、丁香100克，加入纯水1000ml，浸泡8小时，再用水蒸气蒸馏得到蒸馏液，终体积600ml，得到牡丹皮及丁香蒸馏液。
(3)将步骤(1)得到的陈皮提取液和步骤(2)得到的牡丹皮及丁香蒸馏液混合，得到治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物(陈丹丁提取物)，作为试验药物进行后续实验。
实施例2
取陈皮、丁香、牡丹皮各400克，总共1200克药材，中药粉碎机粉碎成细末，进行超临界CO2萃取，萃取工艺条件为萃取时间2h,温度35℃,压力30MPa,流速20Kg/h。重复萃取一次，共得到萃取物300克。
由于陈皮、丁香和牡丹皮中有效成分的极性均较小，可以通过超临界CO2萃取高效获得含有这些有效成分。在超临界萃取釜中，高压下的液态CO2作为溶媒，将中药内可溶的成分带出。
实施例3
ApoE-/-小鼠模型组给予高脂饲养8周诱导动脉粥样硬化模型。将小鼠随机分为3组，分别为模型组、阿托伐他汀钙组、陈丹丁提取物组，每组8只，给药组小鼠从给第8周开始灌胃给药，每天一次，在第28周取材进行后续实验。
(1)实验动物
无特定病原体(SPF)级7～8周龄雄性ApoE-/-小鼠21只，体重量18～22g，购自广州中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证:SYXK(粤)2018-0085。小鼠单笼饲养，自由饮水，室温20～25℃。
(2)实验药物
阿托伐他汀钙(辉瑞制药有限公司生产，批号：GC2759)；WD饮食(纯化)饲料购自广东省医学实验动物中心(许可证号：粤饲证(2019)05073)。
(3)给药剂量
取实施例1的陈丹丁提取物，按照临床用量为陈丹丁各15g，按公式小鼠灌胃剂量＝人临床用量×换算系数(0.0026)/成人体质量(60kg)计算，同时结合陈丹丁得率，确定陈丹丁提取物给药剂量为以小鼠体重计10g·kg-1。
(4)ApoE-/-小鼠造模、分组、给药
ApoE-/-小鼠适应性喂养1周后给予高脂饲料，连续喂养8周。将高脂饲料喂养8周后的ApoE-/-小鼠随机处死3只，大体油红O观察确认已形成动脉粥样硬化病变。其余18只随机分为3组，分别为模型组、阿托伐他汀钙组和陈丹丁提取物组，每组各6只。共灌胃20周，每天1次。
模型组:高脂饲料喂养，同时给予灌服等体积生理盐水；
阿托伐他汀钙组:在高脂饲料喂养基础上，经灌胃给药阿托伐他汀钙(5mg·kg-1)；
陈丹丁提取物组：在高脂饲料喂养基础上，经灌胃给药陈丹丁提取物10g·kg-1。
实施例4
(1)样本采集与处理
取实施例2中实验结束得到的小鼠，采集前禁食12h，不禁水，称重，摘眼球取血；解剖开腹腔和胸腔，充分游离胸主动脉及腹主动脉，至双侧髂动脉分支。用PBS缓冲液冲洗干净留取的组织后，将组织按浸泡在4％多聚甲醛中，或者液氮速冻30分钟后冻于-80℃冰箱保存。取下肝脏组织，将部分肝脏组织放入4％多聚甲醛中固定，余下肝脏组织液氮速冻30min后-80℃保存备用；同时收集小鼠盲肠内容物。收集的血液置于1.5mL离心管中，室温静置1～2h，于4℃，3500r·min-1离心15min，取上清，-80℃保存备用。收集的盲肠内容物置干燥灭菌的冻存管内，液氮速冻后-80℃冻存，便于后续肠道菌群测序分析。
(2)主动脉大体油红O染色，主动脉瓣和肝脏HE染色，
将主动脉组织从4％多聚甲醛中取出，自来水洗。体视显微镜下剔除动脉周围脂肪、结缔组织，并延主动脉长轴将其剖开。将血管置入配置好的油红O染液中，染色30分钟，弃去油红O染液，蒸馏水冲洗，入75％乙醇脱去浮色，至正常血管处无色为止。再次蒸馏水冲洗。将主动脉固定在黑板上，拍摄存图，如图1所示。
肝脏组织在4％多聚甲醛溶液中固定24小时之后，取出组织流动水冲洗过夜，经自动脱水浸蜡处理后进行石蜡包埋，石蜡切片机切片，切片厚度为4um，65℃烘箱烘烤2小时，置于室温下保存备用。石蜡切片经自动染色机脱蜡至水，切片入Harris苏木素染液染5分钟，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，直至胞浆深蓝色，胞核无着色，流动水冲洗；切片依次入85％乙醇、95％乙醇脱水各5分钟，入伊红染液染色5分钟；切片依次入100％乙醇I 5min、100％乙醇II 5min、100％乙醇III 5min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯II 5min；中性树胶封片，显微镜下拍照，结果如图2所示。
(3)血脂水平检测
取上述制备好的血清样本，用试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号:A113-1-1)检测小鼠血清中LDL-C水平，结果如图3所示。
(4)16S rRNA扩增子测序检测肠道菌群
提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库(SMRT Bell)，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用PacBio Sequel进行测序。PacBio Sequel下机数据为bam格式，通过smrtlink分析软件导出CCS文件,根据Barcode序列识别不同样品的数据并转化为fastq格式数据，结果显示了样品中菌群的分布。该实验委托北京百迈客生物技术开展，结果如图4所示。
(5)实验结果
1、图1为3组主动脉油红O染色结果，红色区域代表脂质沉积。实验结果显示，与模型组比，陈丹丁提取物组和阿托伐他汀钙组均有改善动脉脂质沉积作用，陈丹丁提取物组与阿托伐他汀钙组效果接近。
2、图2为3组肝脏切片HE染色切片图，图中白色区域代表脂质沉积。结果显示，与模型组比，陈丹丁提取物组和阿托伐他汀钙组均有改善脂肪肝病变作用，陈丹丁提取物组较阿托伐他汀钙组更明显，陈丹丁提取物组肝细胞排列更规则，肝内脂肪沉积最少，证明陈丹丁提取物能更有效缓解脂肪肝病变，且没有产生肝功能损害副作用。
3、图3中血清中LDL-C水平检测结果显示，与模型组比，陈丹丁提取物组和阿托伐他汀钙组均有改善血液低密度脂蛋白作用，效果接近。
4、图4为肠道菌群分析结果，与模型组(M)相比，陈丹丁提取物(CDD)组和阿托伐他汀钙组(ATV)，肠道样本中Lachnospiraceae菌属和Allobaculum菌属明显增加，这两种菌属均可以产生短链脂肪酸，如：丁酸等，可以有效减轻高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化病变。实验结果证明，陈丹丁提取物调节肠道菌群的作用效果超过阿托伐他汀钙组。
患有代谢性疾病和炎症疾病的人的肠道中产生丁酸盐的细菌水平往往较低。现有研究中用合成的微生物群落定植无菌载脂蛋白e缺陷小鼠，给予高产丁酸酯的菌，能引导代谢从糖酵解转向脂肪酸利用，降低系统性炎症和改善动脉粥样硬化。此外，肠道给丁酸能减少内毒素血症和动脉粥样硬化的发展。本发明提供的治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物能够明显提高肠道中产短链脂肪酸的菌属，有助于实现调节高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物在制备调节肠道菌群产品中的应用，其特征在于：
该中药组合物由陈皮提取物、牡丹皮及丁香提取物组成；
所述的陈皮提取物为陈皮经乙醇回流浓缩得到或经超临界CO2萃取得到；
所述的牡丹皮及丁香提取物为牡丹皮及丁香经水蒸气蒸馏得到或经超临界CO2萃取得到；
所述的调节肠道菌群为提高肠道中产短链脂肪酸的菌属的活性和数量；
所述的中药组合物的制备方法包括如下步骤：
（1）陈皮经乙醇回流提取，浓缩后得到陈皮提取液；
（2）将牡丹皮和丁香加水浸泡，水蒸气蒸馏后得到牡丹皮及丁香蒸馏液；
（3）将陈皮提取液和牡丹皮及丁香蒸馏液混合得到治疗动脉粥样硬化和脂肪肝的中药组合物；
步骤（1）所述的乙醇的体积与陈皮的质量比值为1～5mL：1g；
步骤（1）所述的乙醇浓度为50～70%；
步骤（1）所述的回流提取的时间为30min～2h；
步骤（1）所述的陈皮提取液的质量与陈皮的质量比为1～5:1；
步骤（1）所述的陈皮提取液中还加入了增溶剂；
所述的增溶剂的加入量为陈皮提取液质量的1～3%；
步骤（2）所述的牡丹皮的质量、丁香的质量和水的体积的比值为1～5g：1～5g：10mL；
步骤（2）所述的浸泡为浸泡5～10h；
步骤（2）所述的水蒸气蒸馏为蒸馏到初始体积的50～70%；
所述的陈皮、牡丹皮和丁香的质量比为1～3：1～3：1～3。
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