CN113367130B - 一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于杀虫剂技术领域，公开了一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法，复配载药微球含有复配增效组合物，复配增效组合物为16%百里香酚·β‑石竹烯、17% β‑石竹烯·苦参碱或13%反式肉桂醛·印楝素中的任意一种；杀虫剂复配载药微球的制备方法包括：中空二氧化硅微球HMSN的制备；氨基修饰中空二氧化硅微球NH2‑HMSN的制备；β‑石竹烯·苦参碱@NH2‑HMSN载药微球的制备。本发明通过复配增强单剂杀蚜活性，利用中空二氧化硅微球负载复配剂制备缓释载药微球，提高防治金银花蚜虫的速效性、缓释性和持效性，使药物释放可以与蚜虫发生规律相匹配，起到抑制蚜虫种群增长的作用。

Description

一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法
技术领域
本发明属于杀虫剂技术领域，尤其涉及一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法。
背景技术
目前，金银花Lonicera japonica Thunb.是大宗药材之一，其优质高效栽培对中药产业发展尤为重要。在金银花种植过程中病虫害现象频发，其中蚜虫是最常见和危害性最大的害虫之一，繁殖力强，世代重叠现象突出，存在周期性的孤雌生殖等特点。蚜虫以吸食金银花汁液为生，使叶片和花蕾枯黄甚至脱落，分泌的蜜露会引起叶片煤污病，降低金银花的光合作用，严重影响金银花的产量和质量。
金银花是药食同源的常用中药材，需求量逐年增加，具有良好的经济效益，很多地区已开展规模种植。在实际种植中，金银花病虫害发生频繁，防治工作投入力度大，效果不理想，是制约金银花产业发展的瓶颈。蚜虫是金银花上最常见的害虫，危害严重。在蚜虫的防治过程中，化学农药占比大、不合理使用引发的问题也日益凸显，如农药残留、害虫抗性、土壤和水体被污染等。与有机合成农药相比，植物源物质因其作用方式多样、害虫不易产生抗药性且对非靶标生物毒性低等优势，常作为研发植物源农药的资源和先导化合物，近年来受到研究者的广泛青睐。但实际应用中也存在起效慢、持效期短和剂型单一等缺点。如何研发高效、安全、绿色和持效的植物源新型杀虫剂成为当前研究的热点。
现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)在蚜虫的防治过程中，化学农药占比大，由于不合理使用，引发农药残留、害虫抗性、土壤和水体被污染等问题；而植物源农药在实际应用中存在起效慢、持效期短和剂型单一等缺点。
(2)现有植物源物质种类少、产量低，应用成本较高；与化学农药相比，植物源物质存在活性结构单一、起效慢和受自然因素影响较大等不足，在实际生产中应用率较低；同时，目前对植物源杀虫物质的机理不明晰，已登记的产品数量少、品种单一。
(3)现有技术对植物源杀虫物质的筛选、增效及纳米缓释剂等新剂型的研发成果显著，如3.6％烟碱·苦参碱微囊悬浮剂和3％Microcare等，但在防治金银花蚜虫方面还未见此类研究报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种复配增效组合物，所述复配增效组合物为百里香酚·β-石竹烯、β-石竹烯·苦参碱或反式肉桂醛·印楝素中的任意一种；其中百里香酚·β-石竹烯质量配比范围为0.75:1-12:1，β-石竹烯·苦参碱质量配比范围是1:1-16:1，反式肉桂醛·印楝素质量配比范围是0.45:1-4.2:1。
进一步，所述的百里香酚·β-石竹烯质量配比为3:4、9:7、2:1、3:1、9:2、7:1、12:1或2.2:1；所述的β-石竹烯·苦参碱质量配比为1:1、12:7、8:3、4:1、6:1、28:3、16:1或2.4:1；所述的反式肉桂醛·印楝素质量配比为9:20、27:35、6:5、9:5、27:10、21:5或1.6:1。
进一步，所述百里香酚·β-石竹烯为质量百分含量为16％的百里香酚·β-石竹烯复配剂，百里香酚质量百分含量为11％、β-石竹烯质量百分含量为5％；所述β-石竹烯·苦参碱为质量百分含量为17％的β-石竹烯·苦参碱复配剂，β-石竹烯质量百分含量为12％、苦参碱质量百分含量为5％；反式肉桂醛·印楝素为质量百分含量为13％的反式肉桂醛·印楝素复配剂，反式肉桂醛质量百分含量为8％、印楝素质量百分含量为5％。
本发明的另一目的在于提供一种应用复配增效组合物的杀虫剂复配载药微球，所述杀虫剂复配载药微球的有效成分为复配增效组合物。
本发明的另一目的在于提供一种杀虫剂复配载药微球的制备方法，所述杀虫剂复配载药微球的制备方法包括：
步骤一，进行中空二氧化硅微球HMSN的制备；
步骤二，进行氨基修饰中空二氧化硅微球NH2-HMSN的制备；
步骤三，进行β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备。
进一步，步骤一中，所述中空二氧化硅微球HMSN的制备，包括：
(1)称取一定量的十六烷基三甲基溴化铵溶解于乙醇溶液中，磁力搅拌，加入浓氨水，充分混合后逐滴加入正硅酸四乙酯，室温下反应6h；
(2)用去离子水和无水乙醇洗涤3次，离心，将白色沉淀分散至混合溶液，密封放置烘箱3d，烘箱温度为60℃，抽滤，去离子水洗涤3次，冷冻干燥；
(3)放入马弗炉中，于550℃煅烧6h，除去十六烷基三甲基溴化铵，室温干燥下保存，记为HMSN。
进一步，步骤(1)中，所述正硅酸四乙酯用量为2mL，所述十六烷基三甲基溴化铵的用量为0.15-0.3mL，所述浓氨水的用量为1-2mL。
进一步，步骤三中，所述β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备，包括：
(1)精密称取100mg含量为17％的β-石竹烯·苦参碱，加入适量乙醇，超声处理至药剂溶解，配置成质量浓度为5mg/L的药液，于60℃水浴加热；
(2)按照β-石竹烯·苦参碱与NH2-HMSN质量比为1:1-2:1加入NH2-HMSN，超声30min充分分散，密封下搅拌3h，敞口继续搅拌1h，挥发有机溶剂；
(3)热乙醇洗涤残留药剂，冷冻干燥，即得不同比例的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球。
进一步，步骤三中，β-石竹烯·苦参碱：NH2-HMSN质量比为1：1。
本发明的另一目的在于提供一种杀虫剂复配载药微球在金银花蚜虫防治中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的杀虫剂复配载药微球，以金银花蚜虫为试虫、金银花为实验材料，筛选高活性和作用广的植物源物质，通过复配来增强单剂的杀蚜活性，并制备了缓释载药微球，可以提高植物源药液防治蚜虫速效性和高效性，延长持效期，降低蚜虫对金银花的危害，为绿色高效防治金银花蚜虫奠定了基础，为农药减施增效提供参考途径，对中药材优质高效栽培具有重要意义。
本发明以防治效果明显的17％β-石竹烯·苦参碱为对象，利用中空二氧化硅微球负载复配剂制备了缓释载药微球，选用金银花叶片作为靶标模型，对载药微球的表征、缓释性能及增效机制等进行了研究。结果如下：
(1)本发明通过实验得到制备β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球最佳条件为：0.3000g CTAB溶于混合液(60mL无水乙醇、100mL去离子水)，磁力搅拌，加入2mL浓氨水，充分混合后逐滴加入2mL TEOS，室温下反应6h。将洗涤离心后的白色沉淀通过环己烷扩孔，马弗炉煅烧后得到HMSN。经氨基修饰后，按照β-石竹烯·苦参碱：NH2-HMSN质量比为1：1制备载药微球，此条件下其载药量约为36.13％。载药微球具有明显的缓释效果，288h后累计释放率大于80％，可实现药物的缓慢释放，延长药物持效期。
(2)药效试验发现β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN防治金银花蚜虫速效性好、药效高且能持续发挥药效，可有效抑制金银花蚜虫种群增长。载药微球施药10d后校正防效大于90％，与10％吡虫啉乳油相比无显著差异，500倍液下施药15d后校正防效可达96％，显著高于β-石竹烯·苦参碱和10％吡虫啉乳油的校正防效。根据载药微球缓释特点，推荐在金银花蚜虫未发生时和发生初期等种群基数小的时候使用，可以持久长效地防治蚜虫。采集施药后的靶标叶片进行分析，发现蚜虫侵害后叶片4种有效成分含量均降低，载药微球喷施后四种成分含量随施药时间的增加逐渐恢复正常叶片水平。由此也说明β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN能缓慢释放药效，有效防治金银花蚜虫，可修复蚜虫对靶标叶片的伤害。
(3)叶片的蜡质层中含有大量亲脂性化合物及羧基、醛基和糖苷键等基团，因而叶片带有疏水性和负电荷，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球表面修饰的-NH2在溶液中带正电荷，可与蜡质层中的-OH发生氢键结合、与-COOH会有静电吸附及与-CHO产生共价结合作用。一系列复杂的互作机制可以增强载药微球在靶标叶面的亲和能力，提高其在靶标叶面的润湿性和滞留能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的杀虫剂复配载药微球的制备方法流程图。
图2(a)是本发明实施例提供的内标物十二烷的质谱图。
图2(b)是本发明实施例提供的邻苯二甲酸二环己酯的质谱图。
图2(c)是本发明实施例提供的标准品β-石竹烯的质谱图。
图2(d)是本发明实施例提供的苦参碱的质谱图。
图3(a)是本发明实施例提供的混合标准品的气质总离子流图；
图中：1、十二烷；2、β-石竹烯；3、苦参碱；4、邻苯二甲酸二环己酯。
图3(b)是本发明实施例提供的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN微球的气质总离子流图；
图中：1、十二烷；2、β-石竹烯；3、苦参碱；4、邻苯二甲酸二环己酯。
图4(a)是本发明实施例提供的混合对照品溶液HPLC色谱图；
图中：1、绿原酸；2、木犀草苷；3、异绿原酸A；4、异绿原酸C。
图4(b)是本发明实施例提供的供试品溶液HPLC色谱图；
图中：1、绿原酸；2、木犀草苷；3、异绿原酸A；4、异绿原酸C。
图5是本发明实施例提供的温室中培养的金银花示意图。
图6(a)是本发明实施例提供的MSN的扫描电镜图。
图6(b)是本发明实施例提供的HMSN的扫描电镜图。
图7(a)是本发明实施例提供的MSN的透射电镜图。
图7(b)是本发明实施例提供的HMSN的透射电镜图。
图8是本发明实施例提供的不同CTAB用量下二氧化硅微球的SEM图。
图8(a)是本发明实施例提供的大倍数为14.57KX，CTAB用量为0.15mL的二氧化硅微球的SEM图。
图8(b)是本发明实施例提供的放大倍数为11.35KX，CTAB用量为0.3mL的二氧化硅微球的SEM图。
图8(c)是本发明实施例提供的放大倍数为13.69KX，CTAB用量为0.4mL的二氧化硅微球的SEM图。
图8(d)是本发明实施例提供的放大倍数为15.71KX，CTAB用量为0.6mL的二氧化硅微球的SEM图。
图9是本发明实施例提供的不同氨水用量下二氧化硅微球的SEM图。
图9(a)是本发明实施例提供的放大倍数为14.76KX，氨水用量为1mL的二氧化硅微球的SEM图。
图9(b)是本发明实施例提供的放大倍数为11.59KX，氨水用量为2mL的二氧化硅微球的SEM图。
图9(c)是本发明实施例提供的放大倍数为13.87KX，氨水用量为3mL的二氧化硅微球的SEM图。
图9(d)是本发明实施例提供的放大倍数为15.35KX，氨水用量为4mL的二氧化硅微球的SEM图。
图10是本发明实施例提供的不同温度下二氧化硅微球的SEM图。
图10(a)是本发明实施例提供的放大倍数为2.00KX，反应体系温度为室温的二氧化硅微球的SEM图。
图10(b)是本发明实施例提供的放大倍数为2.34KX，反应体系温度为35℃的二氧化硅微球的SEM图。
图10(c)是本发明实施例提供的放大倍数为5.00KX，反应体系温度为80℃的二氧化硅微球的SEM图。
图11是本发明实施例提供的MSN、NH2-HMSN和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的傅里叶红外光谱图。
图12是本发明实施例提供的NH2-HMSN和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的X-射线衍射图。
图13是本发明实施例提供的不同药载比下载药微球的载药量示意图。
图14是本发明实施例提供的NH2-HMSN、β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN、微球与药剂物理混合物热重分析图。
图15是本发明实施例提供的β-石竹烯·苦参碱复配原药、空白二氧化硅微球和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的释放曲线图。
图16是本发明实施例提供的施药前后靶标叶片4种有效成分含量变化图。
图17是本发明实施例提供的不同药剂在金银花叶面上的接触角图像。
图18是本发明实施例提供的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN在金银花叶片上的SEM图。
图18(a)是本发明实施例提供的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN在水冲刷前的金银花叶片上的SEM图。
图18(b)是本发明实施例提供的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN在水冲刷后的金银花叶片上的SEM图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于金银花的杀虫剂复配载药微球及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的复配增效组合物为百里香酚·β-石竹烯、β-石竹烯·苦参碱或反式肉桂醛·印楝素中的任意一种。
本发明实施例提供的百里香酚·β-石竹烯质量配比范围为0.75:1-12:1，β-石竹烯·苦参碱质量配比范围是1:1-16:1，反式肉桂醛·印楝素质量配比范围是0.45:1-4.2:1。
本发明实施例提供的百里香酚·β-石竹烯质量配比为3:4、9:7、2:1、3:1、9:2、7:1、12:1或2.2:1；所述的β-石竹烯·苦参碱质量配比为1:1、12:7、8:3、4:1、6:1、28:3、16:1或2.4:1；所述的反式肉桂醛·印楝素质量配比为9:20、27:35、6:5、9:5、27:10、21:5或1.6:1。
本发明实施例提供的百里香酚·β-石竹烯为质量百分含量为16％的百里香酚·β-石竹烯复配剂，百里香酚质量百分含量为11％、β-石竹烯质量百分含量为5％；所述β-石竹烯·苦参碱为质量百分含量为17％的β-石竹烯·苦参碱复配剂，β-石竹烯质量百分含量为12％、苦参碱质量百分含量为5％；反式肉桂醛·印楝素为质量百分含量为13％的反式肉桂醛·印楝素复配剂，反式肉桂醛质量百分含量为8％、印楝素质量百分含量为5％。如图1所示，本发明实施例提供的杀虫剂复配载药微球的制备方法包括以下步骤：
S101，进行中空二氧化硅微球HMSN的制备；
S102，进行氨基修饰中空二氧化硅微球NH2-HMSN的制备；
S103，进行β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
一、发明概述
本发明研究21种植物源物质对金银花蚜虫生物活性的影响，筛选具有较高杀蚜活性的植物源物质；对筛选出的植物源物质进行复配研究，明确具有增效作用的复配剂组合；利用中空二氧化硅微球负载复配剂制备成缓释微球，并探讨其在防治金银花蚜虫方面增效机制。
本发明采用毛细管点滴和圆片法测定21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀和胃毒活性；利用共毒因子和共毒系数法筛选最佳复配剂及配比，采用浸虫浸叶法测定复配剂毒力并判定复配剂的增效作用，通过盆栽和田间试验评价复配剂防治金银花蚜虫效果；采用软模板法合成中空二氧化硅微球，将其作为载体制备缓释载药系统；利用透射电镜和气质联用仪等仪器对微球进行相关表征和缓释性能分析，通过药效试验和靶标叶片成分变化分析载药微球防治金银花蚜虫的效果；利用接触角测量仪和扫描电镜测定载药微球在靶标叶片上的润湿性和滞留量，明确载药微球防治金银花蚜虫的增效机制。
本发明实验表明，21种植物源物质对金银花蚜虫有不同程度的触杀和胃毒活性，对处理后24、48和72h蚜虫校正死亡率进行分析，得到5种具有较强杀蚜活性的植物源物质：百里香酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、印楝素。2.对5种植物源物质进行复配研究，具有明显增效作用的3个复配组合如下：16％百里香酚β-石竹烯、17％β-石竹烯苦参碱和13％反式肉桂醛印楝素。毒力测定结果表明3种复配剂对金银花蚜虫的毒力增强，17％β-石竹烯苦参碱和13％反式肉桂醛印楝素对各自原药均有显著增效作用。田间试验发现17％β-石竹烯苦参碱防治金银花蚜虫效果最优，施药1d、10d后防治效果约61％、91％。3.实验得到β-石竹烯苦参碱@NH2-HMSN载药系统最佳制备条件如下：0.3000g CTAB溶解于混合液中(无水乙醇60mL、去离子水100mL)，磁力搅拌，加入2mL浓氨水，然后逐滴加入2mL TEOS，室温反应6h；离心得白色沉淀，经环己烷扩孔、马弗炉煅烧和氨基修饰后得到NH2-HMSN，按β-石竹烯苦参碱：NH2-HMSN质量比为1：1制备载药微球。结果表明，此条件下其载药量约为36.13％，288h后累计释放率大于80％，缓释效果明显；药效试验表明β-石竹烯苦参碱@NH2-HMSN不仅防治金银花蚜虫效果好、速效性快，还能够缓慢释放药物，起到延长药效时间的作用，施药15d后防治效果可达96％，还可修复蚜虫侵害对金银花叶片有效成分带来的损伤；增效性研究发现β-石竹烯苦参碱@NH2-HMSN可以通过提升药液在靶标叶面的润湿性和沉积性能，增强药液与靶标叶面的亲和力。
因此，21种植物源物质对金银花蚜虫具有不同程度的触杀和胃毒作用，实验筛选出具有高活性和作用广的植物源物质进行复配，增强了原药杀蚜活性。中空二氧化硅微球负载复配剂制备缓释载药微球，可有效保护药液活性成分，提高防治金银花蚜虫的速效性、缓释性和持效性，使药物释放可以与蚜虫发生规律相匹配，起到抑制蚜虫种群增长的作用，为安全、绿色和高效防治金银花蚜虫研究提供了重要方向。
本发明以金银花蚜虫为试虫、金银花为实验材料，筛选高活性和作用广的植物源物质，通过复配来增强单剂的杀蚜活性，并制备了缓释载药微球，可以提高植物源药液防治蚜虫速效性和高效性，延长持效期，降低蚜虫对金银花的危害。本发明为绿色高效防治金银花蚜虫奠定了基础，为农药减施增效提供参考途径，对中药材优质高效栽培具有重要意义。
二、21种植物源物质对金银花蚜虫生物活性的影响
随着使用化学农药弊端的日益凸显，绿色、高效和持效及后效等优点的绿色农药成为研究的热点内容。植物源物质因其安全低毒、来源广泛和作用机制多样等优势在害虫防治领域广受关注。前期实验发现，百里香油、牛至油和反式-2-己烯醛对金银花蚜虫具有较强活性，通过对百里香油、牛至油及同科植物活性成分进行分析，并阅读相关文献，确定了21种植物源物质进行实验研究。本发明测定了21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀和胃毒活性，以期筛选出具有较强杀蚜活性的植物源物质。
1、供试材料
金银花蚜虫、金银花嫩梢，均来自山东中医药大学药圃。
2、仪器与试剂
2.1仪器
多功能恒温培养箱(北京福意联)，高温灭菌箱(MJ-78A，上海施都凯)。
2.2试剂
实验试剂详见表1。
表1实验试剂
Figure BDA0003143145930000101
Figure BDA0003143145930000111
3、实验方法
3.1 21种植物源物质对金银花蚜虫生物活性的影响
选取大小一致的无翅成蚜，将植物源物质用丙酮溶解，并用0.1％吐温-80的水溶液配制成实验药液。
3.1.1触杀活性测定
参照毛细管点滴法，以金银花蚜虫为试虫，每组20头蚜虫，每头点滴实验药液0.1ul，每个处理重复3次，以点滴丙酮为溶剂对照，点滴清水为空白对照，试验中若对照死亡率高于20％则本次试验作废。处理后将蚜虫挑入带有保湿的金银花叶片的培养皿内，每隔24h更换新鲜叶片，置于温度为(25±1)℃、相对湿度(60±5)％的恒温箱内继续培养，分别在处理后24、48、72h检查蚜虫存活情况，计算校正死亡率。
Figure BDA0003143145930000112
3.1.2胃毒活性测定
参考蚜虫生物活性测定的圆片法。2％的琼脂溶液经高温灭菌，倒入培养皿中(d＝9cm)，铺厚约0.5cm的保湿层。将金银花叶片在药液中浸5s，滤纸吸干多余药液，自然晾干后将叶片正面贴在琼脂上，叶柄插入琼脂中。挑取(20±5)头蚜虫于叶片上，封口膜密封培养皿，防止蚜虫逃逸，昆虫针扎孔，保证透气性，置于温度为(25±1)℃、相对湿度(60±5)％的恒温箱内继续培养。以丙酮为药剂对照，清水处理为空白对照，各处理重复3次，分别在24、48、72h后检查蚜虫存活情况，计算校正死亡率。
3.2不同植物源物质对金银花蚜虫的室内毒力测定
采用FAO推荐的浸虫浸叶法，剪取带蚜虫的金银花嫩梢，切口处用润湿脱脂棉和保鲜膜包裹保湿，每个嫩梢上保留(40±5)头无翅成蚜。将带蚜虫金银花嫩梢在药液中浸渍5s，用滤纸吸干多余药液，转移到铺有湿滤纸、直径9cm的培养皿中晾干，封口膜密封，防止蚜虫逃逸，昆虫针扎孔，保证培养皿透气性。随后置于温度为(25±1)℃、相对湿度(60±5)％的恒温箱内继续培养，每个处理重复3次。48h后检查蚜虫存活情况，使用SPSS 25计算不同植物源物质的LC50。
4、结果与分析
4.1 21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀活性
由表2可知，β-石竹烯对金银花蚜虫触杀活性最强，24h校正死亡率大于90％，48h校正死亡率约98％。24h校正死亡率大于70％的有5种植物源物质，分别为β-石竹烯、反式肉桂醛、百里香酚、苦参碱、印楝素，校正死亡率在50％～70％的有4种植物源物质，分别为香芹酚、α-蒎烯、香茅醛、烟碱；72h后校正死亡率大于80％的植物源物质有百里香酚、香芹酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、印楝素。综合来看，β-石竹烯和反式肉桂醛触杀活性较高，且杀虫速度较快。
表2 21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀活性
Figure BDA0003143145930000121
Figure BDA0003143145930000131
注：表中数据为3次重复平均值。烟碱、苦参碱、印楝素药液浓度为300mg/L；其余植物源物质药液浓度为1000mg/L。下同。
4.2 21种植物源物质对金银花蚜虫的胃毒活性
由胃毒活性结果可以看出，24h校正死亡率大于50％的植物源物质有百里香酚、β-石竹烯、苦参碱、印楝素；72h校正死亡率大于70％的有6种植物源物质，分别是百里香酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、烟碱、印楝素。综合来看，苦参碱对金银花蚜虫胃毒活性较好，但杀虫速度和强度有待提升。通过对比21种植物源物质触杀和胃毒活性结果可知，21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀活性总体略高于胃毒活性(见表3)。
表3 21种植物源物质对金银花蚜虫的胃毒活性
Figure BDA0003143145930000132
Figure BDA0003143145930000141
结合21种植物源物质触杀活性和胃毒活性测定结果，以触杀活性校正死亡率大于80％、胃毒活性校正死亡率大于70％作为筛选标准，得到5种杀蚜活性较强的植物源物质，分别是β-石竹烯、反式肉桂醛、百里香酚、苦参碱、印楝素。
4.3 5种植物源物质的室内毒力分析
由5种植物源物质室内毒力测定结果可知，苦参碱对金银花蚜虫毒力最高，LC50为26.859mg/L，其余4种植物源物质毒力由高到低为：印楝素LC50为90.377mg/L，β-石竹烯LC50为108.004mg/L，反式肉桂醛LC50为162.081mg/L，百里香酚LC50为303.833mg/L(见表4)。
表4 5种植物源物质对金银花蚜虫的毒力测定
Figure BDA0003143145930000142
Figure BDA0003143145930000151
5、讨论与小结
植物源物质对害虫的作用主要表现为毒杀、趋避和引诱等，本发明对21种植物源物质的毒杀作用(即触杀和胃毒)进行研究，得到如下结论：
21种植物源物质对金银花蚜虫主要是触杀活性较强，分析原因可能为蚜虫通过刺吸式口器吸食汁液为生，并非咀嚼取食，药液通过消化道或气管发挥胃毒作用较为困难，而药液直接接触蚜虫的方式多样，因而更容易发挥作用。对药液处理后24、48、72h结果分析，筛选出5种具有高活性、兼顾触杀和胃毒作用的植物源物质：百里香酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、印楝素。采用FAO推荐的浸渍法对5种植物源物质进行毒力测定，得到各植物源物质毒力大小为苦参碱＞印楝素＞β-石竹烯＞反式肉桂醛＞百里香酚。
三、不同植物源物质之间配伍试验
植物源农药在害虫防治过程中起到了重要作用，但由于药效低、作用时间短和药效缓慢等不足受到限制。近年来，科研工作者在复配增效方面发现，将具有杀虫活性的多种成分进行合理配伍，可显著提高原药的杀虫活性，增强作用效果，如虫菊·苦参碱可溶液剂、阿维·印楝素乳油等。基于此，本章对前期筛选出的5种杀蚜活性较高的植物源物质进行复配研究，利用共毒因子法对复配组合进行“定性”筛选，在此基础上利用共毒系数法对筛选出的复配组合进行“定量”分析，通过增效性和药效评价，以期得到高效防治金银花蚜虫的复配组合。
1、仪器与试剂
百里香酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱和印楝素参照“21种植物源物质对金银花蚜虫生物活性的影响”中“2.2试剂”；10％吡虫啉乳油，购自青岛正道药业有限公司。
2、实验方法
2.1植物源物质复配增效组合的筛选
参照Mansour等的方法进行改进，具体设计如下：以药剂单剂对金银花蚜虫的LC50值为基准，假设经毒力测定药剂A、B的LC50分别为a、b，选择等效线法中相加作用线的六等分点作为5个配比，表示为a/5b、a/2b、a/b、2a/b、5a/b，计算共毒因子，筛选具有增效作用的复配组合。
Figure BDA0003143145930000161
当共毒因子≥20时为增效作用，共毒因子≤-20时为拮抗作用，-20＜共毒因子＜20时为相加作用。
2.2复配组合最佳配比的确定
根据2.1实验结果，参照孙沛云的共毒系数(CTC)法和农药复配最佳增效配方筛选方法筛选出复配组合的最佳配比，选择等效线法中相加作用线的十等分点设置9个浓度配比，可表示为a/9b、a/4b、3a/7b、2a/3b、a/b、3a/2b、7a/3b、4a/b、9a/b，按1：9、1：4、3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1的体积比进行混合，得到复配剂的浓度梯度。利用共毒系数结合SPPSS数学模型筛选出复配组合最佳配比。
Figure BDA0003143145930000162
当CTC＜80时为拮抗作用，80＜CTC＜120为相加作用，CTC＞120时为增效作用，CTC＞200时则有显著增效作用。
2.3复配剂对金银花蚜虫的室内毒力测定
参照“3.2不同植物源物质对金银花蚜虫的室内毒力测定”方法，以10％吡虫啉EC为对照药剂，清水为空白对照，测定复配剂的LC50，并以95％置信区间不重叠作为复配前后有无显著增效判定标准，分析复配剂对各自原药是否有增效作用。
2.4复配剂药效试验
2.4.1盆栽试验
通过盆栽喷雾试验观察防治效果，具体步骤如下：盆栽金银花长至6～10片叶时，每株接种金银花蚜虫(40±5)头，罩防虫网，24h后调查虫口数，待虫口数稳定后，用小型手持喷雾器进行施药。处理组施药浓度分别为500倍液、750倍液和1000倍液，药剂对照10％吡虫啉EC按田间推荐浓度用药，清水为空白对照。每个处理1盆金银花，重复3次，于施药后1、3、7、10、15d记录存活蚜虫数量，通过虫口减退率计算校正防效。
Figure BDA0003143145930000171
Figure BDA0003143145930000172
2.4.2田间试验
于2019年4月2日在山东中医药大学药圃进行地上喷雾施药，施药当天天气晴朗。将施药地块划分为不同小区，面积各为15m2，采用五点取样法，每小区选取10株金银花，在每株金银花东、南、西、北、中5个方位随机选取长15cm、长势一致的枝条，挂牌标记。试验区四周及小区间设置1m保护行防止干扰。采用手动喷雾器施药，喷头偏植株下侧面，使叶片正反面被均匀喷湿但药液不滴落。根据盆栽试验结果选择田间试验复配剂浓度，以清水为空白对照，10％吡虫啉EC乳油为药剂对照，每个处理重复3次，施药后0、1、4、7、10、14d记录存活蚜虫数量，计算校正防效，方法同上。
3、结果与分析
3.1复配增效组合的筛选结果
根据共毒因子测定结果可得，百里香酚·β-石竹烯复配在28：5配比时共毒因子为21.18，具有增效作用，百里香酚和其它3种植物源物质复配多为相加作用。β-石竹烯·苦参碱复配在4：5配比时共毒因子大于20，具有增效作用，β-石竹烯和其它2种植物源物质复配均为相加作用。反式肉桂醛·印楝素复配在9：10和9：5配比时具有增效作用，反式肉桂醛·苦参碱复配共毒因子均小于20，无增效作用(见表5)。
表5百里香酚各复配组合对金银花蚜虫的共毒因子测定结果
Figure BDA0003143145930000181
Figure BDA0003143145930000191
注：百里香酚、石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、印楝素的配置浓度分别为300、108、180、30、90mg/L。下同。
3.2复配组合最佳配比的确定
3.2.1百里香酚·β-石竹烯的最佳配比
由共毒系数测定结果可知，百里香酚·β-石竹烯配比为3：4、9：7、2：1、3：1、9：2、7：1和12：1时，实际共毒系数大于120，有增效作用。利用SPSS拟合将共毒系数Y与β-石竹烯百分含量反正弦转换值X之间的关系，得到一元二次数学模型y＝-0.169X2+11.410X+17.650，检验结果说明方程具有代表性(见表6-2)。由方程可求得理论最大共毒系数为157.60，此时β-石竹烯的百分含量为30.80％，百里香酚和β-石竹烯配比为(1-30.80％)：30.80％≈2.2：1即为最佳配比。
表6-1百里香酚和β-石竹烯不同配比对金银花蚜虫的共毒系数测定结果
Figure BDA0003143145930000192
Figure BDA0003143145930000201
表6-2二次回归的方差分析表
Figure BDA0003143145930000202
注：查表知F(2,6)0.05＝5.14；F(2,6)0.01＝10.92。下同。
3.2.2β-石竹烯·苦参碱的最佳配比
由测定结果可知，β-石竹烯·苦参碱配比为1：1、12：7、8：3、4：1、6：1、28：3和16：1时，具有增效作用。将共毒系数y与苦参碱百分含量反正弦转换值X之间的关系用SPSS数据处理软件进行拟合，得一元二次数学模型y＝-0.221X2+14.545X-35.544，检验结果说明方程具有代表性(见表7-2)。由方程可求得理论最大共毒系数为203.77，此时苦参碱的百分含量为29.52％，苦参碱和β-石竹烯配比为29.52％：(1-29.52％)≈1：2.4即为最佳配比。
表7-1β-石竹烯和苦参碱不同配比对金银花蚜虫的共毒系数测定结果
Figure BDA0003143145930000203
表7-2二次回归的方差分析
Figure BDA0003143145930000204
Figure BDA0003143145930000211
3.2.3反式肉桂醛·印楝素的最佳配比
由测定结果可知，反式肉桂醛·印楝素配比为9：20、27：35、6：5、9：5、27：10和21：5时，具有增效作用。将共毒系数y与印楝素百分含量反正弦转换值X之间的关系用SPSS数据处理软件进行拟合，得一元二次数学模型y＝-0.132X2+10.216X-14.768，检验结果说明方程具有代表性(见表8-2)。由方程可求得理论最大共毒系数为182.90，此时印楝素的百分含量为39.09％，印楝素和反式肉桂醛配比为39.09％：(1-39.09％)≈1：1.6即为最佳配比。
表8-1反式肉桂醛和印楝素不同配比对金银花蚜虫的共毒系数测定结果
Figure BDA0003143145930000212
表8-2二次回归的方差分析
Figure BDA0003143145930000213
通过复配实验得到结果如下：当百里香酚·β-石竹烯配比为2.2：1、β-石竹烯·苦参碱配比为2.4：1、反式肉桂醛·印楝素配比为1.6：1具有最佳增效作用，因此将3种复配药剂分别配制成含量为16％的百里香酚·β-石竹烯复配剂(其中百里香酚含量为11％、β-石竹烯含量为5％)、含量为17％的β-石竹烯·苦参碱复配剂(其中β-石竹烯含量为12％、苦参碱含量为5％)、含量为13％的反式肉桂醛·印楝素复配剂(其中反式肉桂醛含量为8％、印楝素含量为5％)。
3.3复配剂防治金银花蚜虫的毒力分析
由表9可知，3种复配剂中以17％β-石竹烯·苦参碱毒力最高，LC50为13.997mg/L，其次是13％反式肉桂醛·印楝素和16％百里香酚·β-石竹烯，LC50分别为61.098mg/L、91.093mg/L，三种复配剂毒力较原药相比均得到增强。对比表5结果可得，β-石竹烯·苦参碱复配剂和反式肉桂醛·印楝素复配剂对原药均有显著增效作用，百里香酚·β-石竹烯仅对百里香酚有显著增效作用。
表9 3种复配剂对金银花蚜虫的毒力测定结果
Figure BDA0003143145930000221
3.4盆栽试验
由表10-1、10-2可知，单剂经复配后提高了防治金银花蚜虫的速效性，增强了药剂杀蚜活性。与百里香酚和β-石竹烯单剂相比，16％百里香酚·β-石竹烯复配剂防治金银花蚜虫效果分别提高约7％～14％、2％～3％；与β-石竹烯和苦参碱单剂相比，17％β-石竹烯·苦参碱复配剂防治金银花蚜虫效果分别提高约13％～19％、6％～15％；与反式肉桂醛和印楝素单剂相比，13％反式肉桂醛·印楝素复配剂防治金银花蚜虫效果分别提高约10％～16％、3％～9％。3种复配药剂在施药1～10d后防治效果逐渐增加，而后防治效果开始下降，以16％百里香酚·β-石竹烯复配剂稀释300倍、17％β-石竹烯·苦参碱复配剂稀释300和500倍、13％反式肉桂醛和印楝素复配剂稀释300倍施药后防治效果较优，施药10d后防治效果分别为83.94％、92.33％和91.24％、87.58％，其中17％β-石竹烯·苦参碱复配剂防治蚜虫效果与化学农药吡虫啉相差不大。
综上，选择16％百里香酚·β-石竹烯复配剂300倍液、17％β-石竹烯·苦参碱复配剂500倍液、13％反式肉桂醛·印楝素复配剂300倍液进行田间试验。
表10-1 5种单剂防治金银花蚜虫的盆栽试验
Figure BDA0003143145930000231
Figure BDA0003143145930000241
注：表中数据为平均值±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法在P＜0.05水平差异显著。下同。
表10-2 3种复配剂防治金银花蚜虫的盆栽试验
Figure BDA0003143145930000242
3.5田间试验
由表11可知，植物源物质经复配后防治金银花蚜虫的速效性和效果得到提高，其中以17％β-石竹烯·苦参碱复配剂防治效果最佳，施药1d后防治效果约61％、10d后防治效果达91％，显著高于其它两种复配药剂(P＜0.05)；16％百里香酚·β-石竹烯速效性最差，效果较低，无法有效防治蚜虫。与10％吡虫啉EC相比，17％β-石竹烯·苦参碱复配剂的速效性和高效性有待加强。
表11 3种复配剂对金银花蚜虫的田间防治效果
Figure BDA0003143145930000251
4、讨论与小结
植物源杀虫剂应用历史悠久，具有安全、低毒和作用多样等优点，但往往由于剂型单一、起效慢和作用效果短等缺点很难满足防治害虫的需要。基于此，本章结合前人对农药复配增效筛选的判定方法，对5种药剂进行复配增效研究，结果如下：
首先利用共毒因子对5种药剂的9个复配组合进行“定性”筛选，得到3个有增效作用的复配组合，即百里香酚·β-石竹烯、β-石竹烯·苦参碱、反式肉桂醛·印楝素；然后利用共毒系数结合数学拟合模型分析对3个复配组合进行“定量”分析，得到复配组合的最佳配比为百里香酚·β-石竹烯(配比为2.2：1)、β-石竹烯·苦参碱(配比为2.4：1)、反式肉桂醛·印楝素(配比为1.6：1)。基于此，分别配制了16％百里香酚·β-石竹烯复配剂(百里香酚含量为11％、β-石竹烯含量为5％)、17％β-石竹烯·苦参碱复配剂(β-石竹烯含量为12％、苦参碱含量为5％)、13％反式肉桂醛·印楝素复配剂(反式肉桂醛含量为8％、印楝素含量为5％)。
毒力测定结果表明：3种复配剂对金银花蚜虫的毒力增强，以17％β-石竹烯·苦参碱毒力最强，LC50为13.997mg/L；17％β-石竹烯·苦参碱和13％反式肉桂醛·印楝素对各自原药均有显著增效作用，而16％百里香酚·β-石竹烯对百里香酚原药有显著增效作用，但对β-石竹烯可能有增效或相加作用。
药效试验表明，单剂经复配后防治蚜虫效果增强，速效性得到提高，其中17％β-石竹烯·苦参碱复配剂防治效果最优，这也与其高毒力有关，可能是复配后的复配剂兼具较高的触杀和胃毒活性，因而防治金银花蚜虫效果较好。田间试验结果与盆栽试验结果略有出入，分析原因为田间施药时受温度、光照、风力等环境影响较大，药液喷施后损失较大，叶片附着药液少，在高温和光照下经过分解，起作用的药效浓度低，因而防治效果较盆栽试验略低。
四、植物源物质复配剂的增效研究
目前常用的农药制剂主要是乳油和水剂等传统剂型，有机溶剂用量大、分散性差和易分解等问题突出，存在农药利用率差、药效低和污染环境等弊端。近年来，研究者结合纳米材料和技术合成有效载体，将具有难溶性、易分解和持效期短等缺点的原药经过包埋或吸附等途径制备成新型缓控释制剂，可有效改善农药的分散性和稳定性，促进药液和靶标叶面的粘附性和润湿性，使其快速铺展成膜，延长农药防治的持效期，大大提高了农药利用率，减少环境污染。基于此，本发明以具有最佳防治效果的17％β-石竹烯·苦参碱为对象，利用中空二氧化硅微球制备缓释微球新剂型，并进行了药效试验和增效机制分析，以期提高植物源复配剂田间防治金银花蚜虫的速效性、高效性和持效性，为研发绿色农药新剂型提供思路。
1、仪器与试剂
1.1仪器
实验仪器详见表12。
表12实验仪器
Figure BDA0003143145930000261
Figure BDA0003143145930000271
1.2试剂
实验试剂详见表13。
表13实验试剂
Figure BDA0003143145930000272
2、实验方法
2.1缓释载药微球的制备及表征
2.1.1中空二氧化硅微球(HMSN)的制备
参照文献方法并加以修改。称取一定量的十六烷基三甲基溴化铵溶解于乙醇溶液中(60mL无水乙醇、100mL去离子水)，磁力搅拌，加入浓氨水，充分混合后逐滴加入正硅酸四乙酯，室温下反应6h。用去离子水和无水乙醇洗涤3次，离心，将白色沉淀分散到60mL去离子水、60mL无水乙醇和9ml环己烷的混合溶液中，密封放置烘箱3d，烘箱温度为60℃，抽滤，去离子水洗涤3次，冷冻干燥。放入马弗炉中550℃煅烧6h，除去十六烷基三甲基溴化铵，室温干燥下保存，记为HMSN。通过改变反应条件，分别探究TEOS/CTAB用量、氨水浓度、温度对微球形貌的影响。
2.1.1.1 CTAB用量对二氧化硅微球形貌的影响
氨水浓度和温度不变，TEOS用量为2mL，改变CTAB用量分别为0.15、0.3、0.4、0.6mL，于SEM下观察形貌。
2.1.1.2氨水用量对二氧化硅微球形貌的影响
CTAB、TEOS用量和温度不变，分别添加氨水(28％)1、2、3、4mL，于SEM下观察形貌。
2.1.1.3温度对二氧化硅微球形貌的影响
CTAB、TEOS用量和氨水浓度不变，分别控制反应温度为室温、35℃和80℃，于SEM下观察形貌。
2.1.2氨基修饰中空二氧化硅微球(NH2-HMSN)的制备
参照文献，取100mg HMSN，无水乙醇中分散30min，将含有500μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和125μL无水乙醇的混合液加入到分散液中，室温下搅拌24h，经离心、洗涤、真空干燥后得到白色粉末，记为NH2-HMSN。
2.1.3β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备
精密称取100mg含量为17％β-石竹烯·苦参碱，加入适量乙醇，超声处理至药剂溶解，配置成质量浓度为5mg/L的药液，于60℃水浴加热，按照β-石竹烯·苦参碱与NH2-HMSN质量比为1：2、2：3、1：1、2：1加入NH2-HMSN，超声30min充分分散，密封下搅拌3h，敞口继续搅拌1h，挥发有机溶剂。热乙醇洗涤残留药剂，冷冻干燥，即得不同比例的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球。
2.1.4载药微球的相关表征
2.1.4.1形貌观察
将MSN和HMSN镀金，于扫描电镜(SEM)下观察形态；将MSN和HMSN加入适量乙醇中，超声分散，取少量溶液滴于带碳膜的铜网上，置红外线灯下干燥，随后将附有MSN和HMSN的铜网放置于透射电镜(TEM)下观察形貌。
2.1.4.2傅里叶红外光谱分析
取样品1mg与150mg溴化钾(KBr)研磨均匀，压成透明薄片，红外灯下烘干，进行结构分析，测试范围400～4000cm-1，分辨率2cm-1，扫描次数60次。
2.1.4.3粒径和电位测定
将制备的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球用去离子水稀释至0.1μg/μL，吸取1.5mL样品溶液加入比色皿中，利用多角度粒度及高灵敏Zeta电位分析仪测定其水合粒径分布和Zeta电位情况。
2.1.4.4 X射线衍射(XRD)分析
使用铜靶考察NH2-HMSN和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的晶体结构。
2.1.4.5载药量测定
精密称取100mg不同药载比制备的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球粉末置于50mL具塞锥形瓶中，加入适量50％乙醇溶液，超声分散2h，取适量上清液经处理后通过GC-MS测定载药量。
2.1.4.6热重(TG)分析
称取0.2180gβ-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN，在N2氛围下以10℃/min的升温速率，从室温升至800℃，采用热重分析仪进行分析。
2.1.5载药微球缓释性能测定
以50％无水乙醇作为释放介质。将100mgβ-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN装入透析袋中，置于含30mL释放介质的离心管中，将离心管放入摇床中，温度25℃，振荡速率200r/min。于一定时间后取出2mL溶液，并补充同体积释放介质。采用GC-MS进行分析，计算累计释放量。
Figure BDA0003143145930000301
其中，E是累积释放量(％)，V为取出释放介质的体积(2mL)，Ci(mg/mL)为取样i时药物的浓度，Cn(mg/mL)为取样n时药物的浓度，V0为释放介质的体积(30mL)，M(mg)为负载到NH2-HMSN中药物的总质量。
2.1.5.1色谱条件
Agilent HP-5ms，30m×250μm×0.25μm，FID检测器；柱温为100℃，进样口温度为250℃，流速为1mL/min，进样量为1μL，分流比为20：1。质谱条件：离子源为EI，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电子能量为70eV，扫描质量范围为50～400amu，溶剂延迟2min。程序升温见表14。
表14程序升温梯度
Figure BDA0003143145930000302
2.1.5.2内标物溶液的制备
取十二烷适量于100mL容量瓶中，50％乙醇溶解并定容至刻度线，制成8g/L的内标溶液1。
取邻苯二甲酸二环己酯适量于100mL容量瓶中，50％乙醇溶解并定容至刻度线，制成4g/L的内标溶液2。
2.1.5.3对照品溶液的制备
分别精密称取β-石竹烯对照品0.04g、苦参碱对照品0.01g于10mL容量瓶中，加50％乙醇制备成β-石竹烯质量浓度为4g/L、苦参碱质量浓度为1g/L的对照品溶液。
吸取过0.22μm微孔滤膜的β-石竹烯对照品溶液60μL、苦参碱对照品溶液300μL于气相进样瓶中，分别加入100μL内标溶液1、50μL内标溶液2，50％乙醇稀释至1mL，制成混合对照品溶液。
2.1.5.4供试溶液的制备
取“4.5.1”制备的上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，吸取500μL于气相进样瓶中，分别加入100μL内标溶液1、50μL内标溶液2，50％乙醇稀释至1ml，制成供试品溶液。
内标物十二烷、邻苯二甲酸二环己酯与标准品β-石竹烯、苦参碱质谱图如图2所示，混合标准品(a)和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN微球(b)气质总离子流图如图3所示。
2.1.5.5方法学考察
2.1.5.5.1线性关系的考察
分别吸取β-石竹烯对照品溶液8、20、60、80、160、200μL，苦参碱对照品溶液10、50、150、200、300、400μL，置于气相进样瓶中，各加入100μL内标溶液1、50μL内标溶液2，50％乙醇稀释至1mL，按照“2.1.5.1”下色谱条件进样测定。以β-石竹烯和十二烷峰面积的比值作为纵坐标Y，β-石竹烯和十二烷含量的比值作为横坐标X，得到线性回归方程Y＝2.091X+0.1058(r＝0.9995)，β-石竹烯浓度在0.032～0.800mg/mL线性关系良好；以苦参碱和邻苯二甲酸二环己酯峰面积的比值作为纵坐标Y，苦参碱和邻苯二甲酸二环己酯含量比作为横坐标X，得到线性回归方程Y＝0.6175X+0.1069(r＝0.9995)，苦参碱浓度在0.010～0.400mg/mL线性关系良好。
2.1.5.5.2精密度试验
取β-石竹烯浓度为0.72mg/mL、苦参碱浓度为0.04mg/mL的混合对照品溶液，按照“2.1.5.1”下色谱条件连续进样6次，根据色谱结果分别计算β-石竹烯与内标物1峰面积的比值、苦参碱与内标物2峰面积的比值，得到RSD值为0.84％、0.68％，说明仪器的精密性良好。
2.1.5.5.3稳定性试验
取同一批供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24h按“2.1.5.1”下色谱条件连续进样6次，根据色谱结果分别计算β-石竹烯与内标物1峰面积的比值、苦参碱与内标物2峰面积的比值，得到RSD值为1.29％、1.50％，说明β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN在24h内稳定性良好。
2.1.5.5.4重复性试验
取同一批供试品溶液，按“2.1.5.1”下色谱条件连续进样6次，根据色谱结果分别计算β-石竹烯与内标物1峰面积的比值、苦参碱与内标物2峰面积的比值，得到RSD值为0.58％、1.53％，说明该方法重复性良好。
2.1.5.5.5加样回收率试验
准确吸取已知含量的样品溶液500μL共6份，加入相同含量的β-石竹烯和苦参碱，各加入100μL内标溶液1、50μL内标溶液2，用50％乙醇稀释至1mL，按“2.1.5.1”下色谱条件进样测定，根据色谱结果计算得到β-石竹烯、苦参碱的平均回收率分别为99.73％、103.87％，RSD为0.86％、1.12％(见表15)。
表15β-石竹烯、苦参碱加样回收试验结果
Figure BDA0003143145930000321
2.1.5.6样品含量测定
将定时取样的样品溶液过0.22μm微孔滤膜，准确吸取500μL溶液于气相进样瓶中，加入100μL内标溶液1、50μL内标溶液2，用50％乙醇稀释至1mL，按“2.1.5.1”下色谱条件进行测定，计算不同取样时间的样品释放含量。
2.1.6载药微球在不同储藏温度下的稳定性测定
参照农药热贮和低温稳定性测定方法(GB-T 19136-2003、GB-T 19137-2003)，称取1gβ-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球置于干净的棕色小瓶中，密封后分别放于0℃冰箱、室温干燥器和54℃恒温箱内进行稳定性实验，储藏1h后取出看有无油析现象，储藏14d后取出，配置为0.1％的待测溶液，测定其粒径。
2.2载药微球药效试验
2.2.1盆栽试验
试验方法同前述“2.4.1盆栽试验”。
2.2.2载药微球对靶标叶片有效成分的影响
2.2.2.1样品处理
β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN施药处理，取施药后0、1、3、7、10、15d的金银花叶片，洗净后于50～60℃下鼓风干燥，粉碎，过60目筛，密封干燥保存。
2.2.2.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)，洗脱梯度见表16，柱温：30℃，进样量：10μL；检测波长：327nm、350nm。
表16洗脱程序
Figure BDA0003143145930000331
2.2.2.3对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，加50％甲醇配制成质量浓度分别为绿原酸259.2μg/mL、异绿原酸A360.0μg/mL、异绿原酸C 192.0μg/mL、木犀草苷100.0μg/mL的混合对照品溶液。
2.2.2.4供试品溶液的制备
精密称取样品0.2500g，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量后超声(100W，100kHZ)，处理30min，放冷后再称重，50％甲醇溶液补足重量，摇匀后离心取上清液，过0.22μm有机微孔滤头，取续滤液作为供试品溶液。
混合对照品(A)和供试品(B)溶液HPLC色谱图如图4所示。
2.2.2.5样品含量测定
取不同处理的样品粉末，按照“2.2.2.4”下的方法制备样品溶液，按照“2.2.2.2”下的条件进样测定，分析色谱图，计算得到金银花叶片中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A和异绿原酸C的含量变化。
2.2.2.6方法学考察
2.2.2.6.1线性关系考察
取混合对照品溶液适量，用50％甲醇溶液配置成系列浓度的混合对照品溶液，按照“2.2.2.2”下的色谱条件进样测定，分析色谱图。以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，结果见表17。
表17金银花叶片4种成分线性关系
Figure BDA0003143145930000341
2.2.2.6.2精密度试验
取混合对照品溶液适量，按照“2.2.2.2”下的色谱条件连续进样6次，分析色谱图。计算后得到绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.33％、0.14％、0.55％、0.53％，表明仪器的精密度良好。
2.2.2.6.3重复性试验
取同一批供试品6份，每份0.25g，按照“2.2.2.4”下的方法制备供试品溶液，按照“2.2.2.2”下的色谱条件进样，分析色谱图。计算得到绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD分别为1.10％、1.44％、1.29％、1.21％，表明该方法重复性良好。
2.2.2.6.4稳定性试验
取同一批供试品溶液，按照“2.2.2.2”下的色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h进样，分析色谱图。计算得到绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.14％、0.19％、0.30％、0.39％，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.2.5.6.5加样回收试验
分别取已知成分含量的供试品6份，每份精密称定0.25g，各加入相同量的绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C，按照“2.2.2.4”下的方法制备供试品溶液，按照“2.2.2.2”下的色谱条件进样，分析色谱图。计算得到绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C的平均回收率分别为101.85％、100.82％、100.11％、101.27％，对应峰面积的RSD分别为1.18％、1.49％、1.28％、1.15％(见表18)。
表18 4种成分加样回收率试验结果(n＝3)
Figure BDA0003143145930000351
2.3载药微球增效研究
为保证材料一致性，降低实验误差，本实验选取的金银花均在温室中使用相同培养条件，生长周期一致，故实验中可忽略材料不同造成的差异。采集旺盛生长期的金银花叶片，去离子水清洗叶面浮尘，注意不要破坏金银花叶片的结构形态，自然状态下晾干，备用(见图5)。
2.3.1润湿性测定
参照文献，用解剖刀剪去金银花主叶脉与边缘之间的部分作为样品，将其用双面胶固定在载玻片上，然后将其放在仪器载物台上，吸取5μL的去离子水或待测样品均匀滴到金银花叶片上，待液滴状态稳定，捕捉图像并记录数值，为保证精确度，测量3次取平均值。
2.3.2沉积性能测定
将处理后的金银花叶片用保鲜膜沿着主叶脉进行包裹，将叶片一分为二，使用β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN溶液进行均匀喷雾，待自然晾干后采集叶片，取下保鲜膜后用解剖刀沿着主叶脉剪成两半，一半放置在干净的滤纸上，另一半用去离子水进行冲洗，置于烘箱内6h，取出喷金，于扫描电镜下观察载药微球在金银花叶上的沉积现象。
3结果与分析
3.1β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的制备及表征
3.1.1载药微球制备条件及形貌观察
从SEM图中可清晰观察到合成的二氧化硅微球(a)大小均一，呈实心球形；中空二氧化硅微球(b)破裂后呈空心构造，且微球壁有一定厚度，整体形貌与二氧化硅微球相差不大(见图6)。透射电镜下观察MSN经煅烧除去CTAB后呈现出蠕虫状孔道结构，HMSN空心结构和球壁厚度明显可见，且蠕虫孔道结构更加有序(见图7)。
3.1.1.1 CTAB用量对二氧化硅微球形貌的观察
CTAB用量主要影响形成微球的球壁厚度和分散程度，实验中TEOS用量为2mL，CTAB用量分别为0.15、0.3、0.4、0.6mL，在SEM下观察合成二氧化硅微球的形貌。当CTAB用量为0.15mL时，合成的二氧化硅微球大小均匀，分散性较好；当CTAB用量为0.3mL时，微球大小较均匀，微球之间稍有粘连；当CTAB用量为0.4和0.6mL时，微球之间粘连严重，大小不均匀，这是由于CTAB用量大形成的正胶束多，加入TEOS后水解带负电在静电吸附作用下快速与正胶束结合，从而导致微球多粘连，分散性差。因此二氧化硅微球合成反应中CTAB用量比为0.3mL(见图8)。
3.1.1.2氨水用量对二氧化硅微球形貌的影响
氨水用量会影响反应体系中OH-的浓度，OH-会直接发动亲核进攻，影响TEOS水解速度产生更多的微核，促进微球缩聚反应，使生成的微球粒径增大。实验中氨水用量分别为1、2、3、4mL，合成的微球形貌如图9所示。当氨水用量为1、2mL时，微球粒径相差不大，但氨水用量为2mL时分散性较好；氨水用量为3、4mL，OH-浓度变大，TEOS水解速度快，形成的二氧化硅微球不均匀，粒径差距较大，团聚现象明显。因此反应体系中氨水用量选取2mL。
3.1.1.3温度对二氧化硅微球形貌的影响
温度的高低会直接影响微球成核速率，或者通过影响体系中氨水的挥发速度，从而影响TEOS水解速度和二氧化硅微球成核速率。当反应体系温度为室温和35℃时，二氧化硅微球粒径相差不大，但随着温度升高微球粒子团聚现象明显；当反应体系温度为80℃时，二氧化硅微球粒径减小，但大部分微球均团聚在一起，分散性极差。因此二氧化硅微球的合成均在室温下进行(见图10)。
综上，得到中空二氧化硅微球最佳制备条件如下：0.3000g(精确到0.0002)CTAB溶于混合液(60mL无水乙醇、100mL去离子水)，磁力搅拌，加入2mL浓氨水，混匀后逐滴加入TEOS 2mL，室温下反应6h。用去离子水和无水乙醇洗涤3次，离心洗涤，将白色沉淀重新分散到60mL去离子水、60mL无水乙醇和9mL环己烷的混合溶液中，密封放置烘箱3d，离心、洗涤，真空干燥。放入马弗炉中550℃煅烧6h，除去CTAB，室温干燥下放置，记为HMSN。
3.1.2傅里叶红外光谱分析
从图11可以看出，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN在456cm-1、805cm-1处的峰为Si-O键的对称伸缩振动峰，1070cm-1处的强而宽的峰为Si-O-Si的反对称伸缩振动；3275cm-1处的吸收峰为N-H的不对称伸缩振动峰与二氧化硅中的Si-OH峰相互重叠造成的，表明氨基已修饰到HMSN上，并且在NH2-HMSN的红外谱图中未发现CTAB的特征峰，表明表面活性剂已被除去。1617cm-1为C＝O的伸缩振动峰，1455cm-1处有C＝C骨架，2928cm-1和2800cm-1左右有-CH2的不对称和对称伸缩振动峰，说明NH2-HMSN已经成功负载β-石竹烯·苦参碱。
3.1.3粒径和电位分析
根据测定结果，MSN平均粒径约540nm，Zeta电位约-19.52；经氨基修饰的HMSN平均粒径约554nm，Zeta电位约27.67，粒径稍有增大，可能是由于环己烷扩孔和氨基修饰过程中导致，电位为正值是由于微球表面修饰了带正电荷的氨基粒子；而载药微球的平均粒径约628nm，Zeta电位约为47.79，粒径增大是由于负载药物后微球粒子出现团聚现象，电位增加是负载药物导致的(见表19)。
表19 MSN、NH2-HMSN和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的平均粒径和zeta电位
Figure BDA0003143145930000381
3.1.4 X-射线衍射(XRD)分析
NH2-HMSN和β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的XRD图谱如下(见图12)。NH2-HMSN在24°左右有一个圆丘峰，无明显的晶体衍射峰，这是非晶态二氧化硅的特征峰；β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN与NH2-HMSN的X-射线衍射图基本一致，仅有一个圆丘峰，说明β-石竹烯·苦参碱以无定形状态完全负载于微球内，且装载过程没有破坏微球的结构。
3.1.5载药量测定
由图13可知，随着药载比的增加，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的载药量逐渐增大。当药载比为1：1和2：1时制备的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药量相差不大，此时载药量分别为β-石竹烯23.38％、24.05％，苦参碱10.96％、11.20％。结合成本考虑，实验选择药物与载体比例为1：1进行载药微球的制备。
3.1.6热重(TG)分析
通过NH2-HMSN的热重曲线可以看出(见图14)，NH2-HMSN热稳定性较好，100℃之前NH2-HMSN质量损失变化明显，这是由于样品中吸附水的损失引起的，之后温度升高质量损失几乎没有变化。药剂与微球物理混合物在230℃以下质量损失明显，这是由于样品中的吸附水和微球表面的β-石竹烯·苦参碱分解引起的，而后随温度上升质量几乎没有损失，说明此时药物并未负载到微球中。β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的质量损失主要有以下4个过程，100℃之前为样品中吸附水的损失引起；100～250℃的质量损失为样品表面吸附的β-石竹烯·苦参碱高温分解；250～420℃的质量损失为载药微球内部负载的β-石竹烯·苦参碱发生分解；420℃以上质量损失几乎没有变化，这4个失重过程也进一步说明β-石竹烯·苦参碱已负载到微球中。通过计算可得，100℃以上NH2-HMSN、β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN、微球与药剂物理混合物的质量损失率分别为4.45％、40.58％、42.25％。同时根据质量损失率也可以计算得到载药微球的载药量为36.13％。
3.2缓释性能测定
中空二氧化硅微球为壳层包裹、内部中空的结构，大部分药物进入后分布不均形成浓度差，释放初期内外浓度差较大，释药速率较快，随着时间增加，载药微球释放速率趋于平缓，呈现出持续缓释的效果。由图15可知，复配原药释放速率较快，释放速率呈直线增加，β-石竹烯、苦参碱在48h的累计释放率分别为80.02％、76.77％；而β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN可以在乙醇-水中缓慢释放，β-石竹烯、苦参碱在288h的累计释放率分别为88.85％、84.24％，缓释效果良明显，可以延长药效时间。以缓释时间为横坐标，药物累计释放率为纵坐标，经过Origin9.0拟合分析得到β-石竹烯释放动力学模型为y＝-86.631e-0.00129x+91.799(r＝0.992)，苦参碱释放动力学模型为y＝-91.105e-0.00797x+04.293(r＝0.994)，相关系数均大于0.99，符合一级动力学模型。
3.3β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN的稳定性分析
稳定性对药效发挥具有重要意义，也是农药剂型的评价指标之一，基于此，本实验测定了载药微球在不同储藏温度下的粒径及形貌，测得结果如下：载药微球在0℃、室温和54℃下储藏14d后，其平均粒径分别为631.29±12.01、629.83±13.24、621.94±19.86，0℃和室温下载药微球平均粒径变化不大，说明载药微球在此温度下稳定性良好，载药微球在54℃下储藏两周后平均粒径略有变化，可能是由于温度升高其表面残存的药物发生损失导致粒子变化。因此，载药微球在0℃和室温下稳定性良好，可以长期储藏。
3.4盆栽试验
由表20可知，与β-石竹烯·苦参碱复配剂相比，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN防治金银花蚜虫的速效性快、防治效果高、持效期长，施药3d后防治效果与化学农药10％吡虫啉EC近似一致，500倍液下校正防效可达81％；施药后1～15d防治效果呈递增趋势，施药后10d、15d校正防效约为94.87％、96.55％，持效期优于10％吡虫啉EC。药效试验表明，经NH2-HMSN负载后的β-石竹烯·苦参碱防治金银花蚜虫的速效性快、防治效果高，并且具有缓释效果，可高效持久的发挥作用。
表20载药微球防治金银花蚜虫的盆栽试验
Figure BDA0003143145930000401
注：同列数字后的字母表示经Duncan氏新复极差法在P＜0.05水平差异显著。
3.5载药微球对靶标叶片有效成分的影响
由图16可知，蚜虫危害靶标叶片后其4种有效成分的含量均降低，且差异性显著(P＜0.05)。施药1d后绿原酸和木犀草苷含量较虫害后的含量有所增加，但仍低于正常叶片含量；施药3d后异绿原酸A含量较虫害后增加显著，绿原酸含量恢复至正常水平；施药10d后绿原酸和异绿原酸C含量稍高于正常叶片含量，木犀草苷和异绿原酸A含量与正常叶片含量相近；施药15d后绿原酸含量稍有下降但与正常叶片含量相近，其余3种成分含量高于正常叶片含量。总之，蚜虫危害靶标叶片后使其4种有效成分含量显著降低，施药处理后4种有效成分随着施药时间的延长含量增加，逐渐恢复到正常水平，也说明药剂对蚜虫有一定防治效果，同时可以修复蚜虫危害给金银花叶片带来的损伤。
3.6润湿性能分析
通过增强农药制剂在叶片表面的粘附性、润湿性和沉积量是提高农药利用率和药效的重要途径。叶面的润湿性表现了叶片对水的亲和能力，可以通过测定气、固、液界面的接触角大小确定，接触角θ＜110°的为润湿，θ＞130°的为不润湿，表现斥水性，药液会在润湿性强的叶面上铺展成膜，在不润湿的叶面上形成药珠滚落。实验测定了β-石竹烯原药、苦参碱原药、β-石竹烯·苦参碱复配剂、β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN及水在金银花叶面上的接触角及浸润行为，β-石竹烯原药由于是油状液体，测得接触角为91.27±1.46，小于水和苦参碱原药在金银花叶面的接触角；β-石竹烯·苦参碱复配剂的接触角为87.33±1.99，相比原药接触角有所降低，而β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN接触角值为81.97±1.85，与其它药剂在金银花叶面上的接触角相比最小，且差异显著(P＜0.05)，说明复配剂经微球负载后其润湿性得到较大改善(见图17和表21)。
表21不同药剂在金银花叶面上的接触角平均值
Figure BDA0003143145930000411
Figure BDA0003143145930000421
3.7沉积性能分析
农药的有效利用率除与药液在靶标叶面上的粘附性、润湿性有关外，还与药液在叶片表面上沉积性能密切相关。为了真实模拟药液在金银花叶面的沉积情况，采用环境扫描电镜进行拍摄，从图18可以看出经过水多次冲刷后，仍有大量β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球滞留在叶表面的绒毛、蜡质层和细胞间隙处，说明β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球在金银花叶片上具有亲和沉积的能力。
4、讨论与小结
本发明以防治效果明显的17％β-石竹烯·苦参碱为对象，利用中空二氧化硅微球负载复配剂制备了缓释载药微球，选用金银花叶片作为靶标模型，对载药微球的表征、缓释性能及增效机制等进行了研究。结果如下：
通过实验得到制备β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球最佳条件为：0.3000gCTAB溶于混合液(60mL无水乙醇、100mL去离子水)，磁力搅拌，加入2mL浓氨水，充分混合后逐滴加入2mL TEOS，室温下反应6h。将洗涤离心后的白色沉淀通过环己烷扩孔，马弗炉煅烧后得到HMSN。经氨基修饰后，按照β-石竹烯·苦参碱：NH2-HMSN质量比为1：1制备载药微球，此条件下其载药量约为36.13％。载药微球具有明显的缓释效果，288h后累计释放率大于80％，可实现药物的缓慢释放，延长药物持效期。
药效试验发现β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN防治金银花蚜虫速效性好、药效高且能持续发挥药效，可有效抑制金银花蚜虫种群增长。载药微球施药10d后校正防效大于90％，与10％吡虫啉乳油相比无显著差异，500倍液下施药15d后校正防效可达96％，显著高于β-石竹烯·苦参碱和10％吡虫啉乳油的校正防效。根据载药微球缓释特点，推荐在金银花蚜虫未发生时和发生初期等种群基数小的时候使用，可以持久长效地防治蚜虫。采集施药后的靶标叶片进行分析，发现蚜虫侵害后叶片4种有效成分含量均降低，载药微球喷施后四种成分含量随施药时间的增加逐渐恢复正常叶片水平。由此也说明β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN能缓慢释放药效，有效防治金银花蚜虫，可修复蚜虫对靶标叶片的伤害。
叶片的蜡质层中含有大量亲脂性化合物及羧基、醛基和糖苷键等基团，因而叶片带有疏水性和负电荷，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球表面修饰的-NH2在溶液中带正电荷，可与蜡质层中的-OH发生氢键结合、与-COOH会有静电吸附及与-CHO产生共价结合作用。一系列复杂的互作机制可以增强载药微球在靶标叶面的亲和能力，提高其在靶标叶面的润湿性和滞留能力。
五、总结
蚜虫是金银花种植过程中危害最严重的害虫之一，繁殖速度快，以吸食金银花汁液为生，使叶片卷曲、发黄甚至脱落，侵害花蕾导致其发育停滞，严重影响金银花的产量和质量。随着化学农药使用弊端的日益凸显，研发高效、安全和绿色的植物源农药逐渐成为研究的热点。本发明测定了21种植物源物质对金银花蚜虫生物活的影响，对筛选出的植物源物质进行复配研究，制备缓释载药微球，并探讨了增效机制，以期获得安全、高效和持效的植物源农药，有效防治金银花蚜虫。主要研究结果如下：
1.对金银花蚜虫四种状态—卵、若蚜、成蚜及有翅蚜的发生规律进行了系统调查，为分期施药和有效防治提供了基础导向。
2.测定了21种植物源物质对金银花蚜虫的触杀和胃毒活性，筛选出了5种具有较高触杀和胃毒活性的植物源物质：百里香酚、β-石竹烯、反式肉桂醛、苦参碱、印楝素。5种植物源物质的毒力分别为苦参碱＞印楝素＞β-石竹烯＞反式肉桂醛＞百里香酚。
3.利用共毒因子、共毒系数法结合SPSS数学拟合模型筛选出具有明显增效作用的3种复配组合，分别配制成16％百里香酚·β-石竹烯、17％β-石竹烯·苦参碱和13％反式肉桂醛·印楝素复配剂。与原药相比，3种复配剂对金银花蚜虫的毒力增强，且17％β-石竹烯·苦参碱和13％反式肉桂醛·印楝素对各自原药有显著增效作用。3种复配剂中以17％β-石竹烯·苦参碱防治金银花蚜虫速效性较好，防治效果较高。
4.首次以中空二氧化硅微球负载复配剂制备了缓释载药微球，有效保护了活性成分，288h累计释放率大于80％，缓释性能良好，打破了传统农药剂型的弊端。β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN防治金银花蚜虫速效性快、防效高、缓释效果明显且持效期长，施药15d防治效果仍高达96％，可高效持久防治金银花蚜虫。此外，β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN对受侵害的金银花叶片有修复作用，施药后10～15d靶标叶片有效成分含量可逐渐恢复至正常叶片水平。
5.β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN可提高药液与靶标叶面的亲和能力，施药时药液损失小、利用率高，药效能够得到有效发挥，增效作用明显。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复配增效组合物，其特征在于，所述复配增效组合物为β-石竹烯·苦参碱；其中β-石竹烯·苦参碱质量配比范围是1:1-16:1。
2.根据权利要求1所述的一种复配增效组合物，其特征在于，所述的β-石竹烯·苦参碱质量配比为1:1、12:7、8:3、4:1、6:1、28:3、16:1或2.4:1。
3.根据权利要求2所述的一种复配增效组合物，其特征在于，所述β-石竹烯·苦参碱为质量百分含量为17%的β-石竹烯·苦参碱复配剂，β-石竹烯质量百分含量为12%、苦参碱质量百分含量为5%。
4.一种应用如权利要求1-3所述的复配增效组合物的杀虫剂复配载药微球，其特征在于，所述杀虫剂复配载药微球的有效成分为权利要求1-3中任一项所述的复配增效组合物。
5.一种根据权利要求4所述杀虫剂复配载药微球的制备方法，其特征在于，所述杀虫剂复配载药微球的制备方法包括：
步骤一，进行中空二氧化硅微球HMSN的制备；
步骤二，进行氨基修饰中空二氧化硅微球NH2-HMSN的制备；
步骤三，进行β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备。
6.根据权利要求5所述的杀虫剂复配载药微球的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述中空二氧化硅微球HMSN的制备，包括：
（1）称取十六烷基三甲基溴化铵溶解于乙醇溶液中，磁力搅拌，加入浓氨水，充分混合后逐滴加入正硅酸四乙酯，室温下反应6h；
（2）用去离子水和无水乙醇洗涤3次，离心，将白色沉淀分散至混合溶液，密封放置烘箱3d，烘箱温度为60℃，抽滤，去离子水洗涤3次，冷冻干燥；
（3）放入马弗炉中，于550℃煅烧6h，除去十六烷基三甲基溴化铵，室温干燥下保存，记为HMSN。
7.根据权利要求6所述的杀虫剂复配载药微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述正硅酸四乙酯用量为2mL，所述十六烷基三甲基溴化铵的用量为0.15-0.3mL，所述浓氨水的用量为1-2mL。
8.根据权利要求5所述的杀虫剂复配载药微球的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球的制备，包括：
（1）精密称取100mg含量为17%的β-石竹烯·苦参碱，加入适量乙醇，超声处理至药剂溶解，配置成质量浓度为5mg/L的药液，于60℃水浴加热；
（2）按照β-石竹烯·苦参碱与NH2-HMSN质量比为1:1-2:1加入NH2-HMSN，超声30min充分分散，密封下搅拌3h，敞口继续搅拌1h，挥发有机溶剂；
（3）热乙醇洗涤残留药剂，冷冻干燥，即得不同比例的β-石竹烯·苦参碱@NH2-HMSN载药微球。
9.根据权利要求8所述的杀虫剂复配载药微球的制备方法，其特征在于，步骤三中，β-石竹烯·苦参碱：NH2-HMSN质量比为1：1。
10.一种如权利要求4所述的杀虫剂复配载药微球在金银花蚜虫防治中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3127367A1 (fr) * 2021-09-29 2023-03-31 Xeda International S.A. Procede de traitement phytosanitaire au moyen de caryophyllene
CN116327756A (zh) * 2023-03-02 2023-06-27 天津大学 一种纳米制剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030134003A1 (en) * 2001-10-09 2003-07-17 Medigreen Biotechnology Inc. Method of using geranium oil and sophora root extracts as a supporting composition in cancer treatments
US20060199736A1 (en) * 2002-12-16 2006-09-07 Vertec Biosolvents, Inc. Environmentally benign bioactive formulation
FR2852204A1 (fr) * 2003-03-14 2004-09-17 Georges Camprasse Insectifuge et insecticide universel son procede de fabrication
MX2012015011A (es) * 2010-06-24 2013-01-29 Plant Impact Plc Mezclas de pepticidas que producen efectos pesticidas sinergisticos.
CN102310966A (zh) * 2010-07-01 2012-01-11 郑州大学 一种仓储防霉防虫包装麻袋布及其制备方法
ES2952649T3 (es) * 2011-10-04 2023-11-02 0903608 B C Ltd Formulaciones para el control de plagas y métodos de fabricación y uso de las mismas
CN103548891B (zh) * 2013-10-24 2015-11-18 湖南中烟工业有限责任公司 一种防治烟蚜的植物源农药及其应用
CN104488998A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 馥稷生物科技发展（上海）有限公司 一种含苦参碱的增效复配杀蚜剂及其制备方法
AU2018340844B2 (en) * 2017-09-29 2023-12-21 0903608 B.C. Ltd. Synergistic pesticidal compositions and methods for delivery of active ingredients
CN108477148A (zh) * 2018-01-29 2018-09-04 浙江帮帮环境科技集团有限公司 一种烟草甲驱避剂及其制备方法、应用
CN109796019B (zh) * 2019-02-21 2020-12-15 华中科技大学 一种空心二氧化硅纳米球及其制备方法和应用

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