CN113332321A - 含人参皂苷的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含人参皂苷的组合物及其制备方法和用途，所述组合物中包括人参提取物和复合菌株；其中，基于200mg人参提取物，复合菌株的活菌数量为1.43×108～9×1011CFU/mL；所述复合菌株由植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8组成。本发明的组合物可以提高人参皂苷Rg3和20R‑Rg3的吸收利用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种含人参皂苷的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效，用于改善治疗体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、气血亏虚、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等症状。两千多年来，人参一直被我国作为传统药物使用，同时也已经成为世界上销量最好的中草药之一。
人参皂苷具有抗癌、抗炎、抗过敏、抗糖尿病、抗氧化等多种药理活性，是人参公认的活性成分。人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，又称三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷母核20位的碳原子为手性碳，按照C-20位构型的不同，又可以分为20(S)-和20(R)-型，天然人参皂苷构型均为20(S)-构型。
每种皂苷都有其独特的生理功能，某些人参单体皂苷药理作用甚至完全相反。人参皂苷Rg3是人参皂苷中原人参二醇组皂苷通过定向水解而成的次级稀有人参皂苷，具有抑制癌细胞生长、与顺铂药物协同抗肿瘤、抑制人骨肉瘤细胞增殖并诱导其凋亡、抑制血小板的活化和体内血栓的形成、减轻脂多糖诱导的急性肺损伤、促进炎症消退、经皮给药可镇痛等药理作用。由于人参皂苷Rg3在人参中含量极低，因此研究提高其吸收利用率具有重要意义。
有研究表明，通过红曲霉发酵人参，可以提高稀有皂苷Rg3的含量(参见《红曲霉发酵转化人参皂苷Rg3的研究》，从悦怡等，中草药，2018年3月，第49卷第6期)。但该文献中未对红曲霉发酵转化人参进行动物实验等的研究，稀有皂苷Rg3的吸收利用率仍需进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种含人参皂苷的组合物，该组合物可以有效地提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。本发明的另一目的在于提供所述组合物的制备方法，该制备方法操作简单。本发明的再一个目的在于提供上述组合物或复合菌株的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种含人参皂苷的组合物，所述组合物中包括人参提取物和复合菌株；基于200mg人参提取物，复合菌株的活菌数量为1.43×108～9×1011CFU/mL；其中，所述复合菌株由植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8组成。这样有利于有效地提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。
根据本发明的组合物，优选地，所述植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～3:1:1。这样更加有利于提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。根据本发明的组合物，优选地，所述植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～2:1:1。根据本发明的组合物，优选地，所述植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1:1:1。这样可以更有效地提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。
本发明经过大量研究和实验发现，采用特定组合的复合菌株的培养液与一定量的人参提取物混合后给大鼠服用，可以有效提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。
本发明的人参提取物可以由包括以下的步骤制备而得：将人参原料(饮片或粉末)与6～12倍重量的水混合，在加热条件下超声提取，过滤，得到人参提取液；将人参提取液浓缩，得到人参提取物。人参提取液中人参总皂苷的含量为8～15mg/mL，优选为10～15mg/mL。这样可以改善人参皂苷的提取率。人参原料可以为人参饮片或人参粉末，优选为人参粉末。人参粉末可以为40～100目，优选为40～80目。
根据本发明的组合物，优选地，所述人参提取物中水的含量为2～5wt％。人参提取物中，人参总皂苷的含量为19～21mg/100mg，优选为19.5～20.5mg/100mg。
本发明还提供上述组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将人参原料与6～12倍重量水混合，在60～85℃下超声提取30～90min，过滤，得人参提取液；将人参提取液浓缩，得到人参提取物；其中，人参原料为人参饮片或人参粉末；
(2)分别取植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8冻干粉溶解后，分别划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养24～60h；挑取平板上的菌落加入含有1～10mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养24～60h，分别获得植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的培养液，然后将各菌株的培养液混合，得到复合菌株的培养液；
(3)将人参提取物和复合菌株的培养液混合。
人参原料(人参饮片或人参粉末)与水的重量比可以为1:6～12，优选为1:6～10。超声提取的温度可以为60～85℃，优选为60～80℃。超声提取的时间为30～90min，优选为40～70min，更优选为40～60min。这样可以改善人参饮片或人参粉末中的人参皂苷的提取率，并提高人参提取物中人参总皂苷的含量。
根据本发明的制备方法，优选地，在步骤(1)中，人参提取液中人参皂苷的含量为8～15mg/mL。更优选地，人参提取液中人参皂苷的含量为10～15mg/mL。人参提取物中水的含量可以为2～5wt％，优选为3～4wt％。
根据本发明的一个实施方式，在步骤(2)中，分别取植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8冻干粉溶解后，分别划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养48h；挑取平板上的菌落加入含有5mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养48h，分别获得植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的培养液，然后将各菌株的培养液以活菌数量比为1:1～3:1:1进行混合，得到复合菌株的培养液。
本发明的复合菌株中，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比可以为1:1～3:1:1；优选为1:1～2:1:1；更优选为1:1:1:1。这样可以有效提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。
鉴于人参提取物可以用于治疗各种疾病，因而本发明的组合物也可以治疗相关疾病。因此，本发明还提供上述组合物在制备抗癌药物、抗炎药物、抗过敏药物、抗糖尿病药物或抗氧化药物中的用途。
本发明还提供一种复合菌株在制备提高人参皂苷Rg3的吸收利用率中的药物中的用途，所述复合菌株由植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8组成。
根据本发明所述的用途，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～3:1:1。
在本发明中，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～3:1:1。优选地，所述植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～2:1:1。更优选地，所述植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1:1:1。这样可以更有效地提高人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率。
具体实施方式
以下通过实施例示例性地描述本发明的药物组合物的制备方法，但本发明的保护范围不限于此。
制备例和试验例中原料来源如下：
植物乳杆菌LP90，生产商为江苏微康生物科技有限公司。
嗜酸乳杆菌LA3，生产商为意大利SACCO。
植物乳杆菌LPG18，生产商为润盈生物(上海)有限公司。
植物乳杆菌P8，生产商为北京科拓恒通生物技术股份有限公司。
红曲霉菌，购于中国微生物菌种保藏中心，编号为CICC40712。
制备例1-人参提取物
取50g人参饮片，加入10倍量水，80℃下超声60min，过滤，得人参提取液；将所得的人参提取液浓缩，得到人参提取物。其中，人参提取物中水的含量为4wt％，人参总皂苷的浓度为20mg/100mg。
制备例2-植物乳杆菌LP90的培养液
取植物乳杆菌LP90冻干粉溶解后，划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养48h；挑取平板上的菌落加入含有5mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养48h，获得植物乳杆菌LP90的培养液。
制备例3-嗜酸乳杆菌LA3的培养液
取嗜酸乳杆菌LA3冻干粉溶解后，划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养48h；挑取平板上的菌落加入含有5mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养48h，获得嗜酸乳杆菌LA3的培养液。
制备例4-植物乳杆菌LPG18的培养液
取植物乳杆菌LPG18冻干粉溶解后，划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养48h；挑取平板上的菌落加入含有5mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养48h，获得植物乳杆菌LPG18的培养液。
制备例5-植物乳杆菌P8的培养液
取植物乳杆菌P8冻干粉溶解后，划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养48h；挑取平板上的菌落加入含有5mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养48h，获得植物乳杆菌P8的培养液。
制备例6-复合菌株的培养液
分别取植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的培养液混合，获得复合菌株的培养液。复合菌株的培养液中，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量之比为1:1:1:1。
实施例1
取制备例1所得的人参提取物200mg，以及取制备例6所得的复合菌株的培养液混合，得到组合物。复合菌株的活菌数量为1010CFU/mL，且植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1:1:1。
对比例1
取制备例1所得的人参提取物200mg，以及红曲霉菌株培养混合，得到混合物。红曲霉菌株培养液参照(《红曲霉发酵转化人参皂苷Rg3的研究》，从悦怡等，中草药，2018年3月，第49卷第6期)进行培养得到。
试验例
以下通过实验对本发明的特定的组合物在提高人参皂苷Rg3吸收利用率方面进行研究并验证。
1.动物实验设计
SPF级SD雄性大鼠80只，体重200±20g，适应性喂养一周后，将大鼠随机分为8组(10只/组)；以下实验中，人参提取物均由制备例1的方法所得。
空白组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃生理盐水。
对照组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg。
红曲霉菌株组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg及红曲霉菌株培养液的混合物(对比例1所得的混合物)，按人的使用剂量200亿CFU活菌/70kg/d进行换算，红曲霉菌株培养液活菌数量为1010CFU/ml。
植物乳杆菌LP90实验组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg及植物乳杆菌LP90的培养液(制备例2所得)，按人的使用剂量200亿CFU活菌/70kg/d进行换算，植物乳杆菌LP90的培养液活菌数量为1010CFU/ml。
嗜酸乳杆菌LA3实验组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg及嗜酸乳杆菌LA3的培养液(制备例3所得)，按人的使用剂量200亿CFU活菌/70kg/d进行换算，嗜酸乳杆菌LA3的培养液活菌数量为1010CFU/ml。
植物乳杆菌LPG18实验组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg及植物乳杆菌LPG18的培养液(制备例4所得)，按人的使用剂量200亿CFU活菌/70kg/d进行换算，植物乳杆菌LPG18的培养液的活菌数量为1010CFU/ml。
植物乳杆菌P8实验组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃人参提取物200mg/kg及植物乳杆菌P8的培养液(制备例5所得)，按人的使用剂量200亿CFU活菌/70kg/d进行换算，植物乳杆菌P8的培养液的活菌数量为1010CFU/ml。
复合菌株组：普通鼠粮，自由饮水，每天灌胃实施例1所得的组合物，且灌胃的组合物中人参提取物为200mg/kg、活菌数量为1010CFU/ml。
2.灌胃取血
灌胃各药物后于第0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h眼静脉丛取血，置于预先涂有肝素钠的离心管中，每次采血量约250μl。在10000r/min转速下离心后，取上清液得血浆，将血浆置于-80℃冰箱保藏。
3.采用UPLC-MS/MS测试人参皂苷
3.1上机溶液的制备
对照品溶液的制备：分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、20R-Rg2、Rb1、20R-Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、PPT、20R-PPT、Rg3、20R-Rg3、化合物K、Rh2、20R-Rh2、PPD、20R-PPD对照品，分别加甲醇配制成1mg/ml的对照品溶液；分别精密吸取各对照品溶液100μl至10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为10μg/ml的混合对照品溶液。同时精密称取Digoxin对照品适量，加甲醇配制成浓度为10μg/ml的溶液，作为内标。
供试品溶液的制备：精密吸取100μl大鼠血浆(由2.灌胃取血步骤所得的血浆)，加入10μl浓度为10μg/ml的Digoxin对照品溶液，然后加入0.5ml的甲醇-乙腈(4:1)，涡旋2min，以10000r/min的转速离心10min；上清液转到另一管中45℃氮气吹干，然后加入100μl甲醇，涡旋1min，4℃离心10min，取上清液即得。
3.2UPLC-MS/MS测试方法
采用UPLC-MS/MS测试方法测试人参皂苷的含量，包括人参皂苷Rg3的含量。
3.2.1液相条件(UPLC色谱仪：A30 AltusTMUPLC system(PerkinElmer，Waltham，MA，USA))
以含0.1vol％甲酸的水为流动相A，以含0.1vol％甲酸的乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)；流速为0.4mL/min；柱温为30℃；进样量为3μL；自动进样器温度为4℃。
表1液相梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～4 | 80→70 | 20→30 |
| 5～12 | 70→67 | 30→33 |
| 12～13 | 67→60 | 33→40 |
| 13～23 | 60→53 | 40→47 |
| 23～24 | 53→40 | 47→60 |
| 24～26 | 40→35 | 60→65 |
| 26～33 | 35→22 | 65→78 |
| 33～35 | 22→20 | 78→80 |
| 35～36 | 20→80 | 80→20 |
| 36～41 | 80 | 20 |
3.2.2质谱条件(QsightTM220triple quadrupole mass spectrometer(PerkinElmer，Waltham，MA，USA))
采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测。离子源参数如下：反吹干燥气流速为100μl/min，喷雾电压为5500V，雾化气流速为200μl/min，辅助加热器温度为400℃，热表面诱导去溶剂质谱接口温度为320℃。22种人参皂苷的质谱方法参数如表2。
表2 22种人参皂苷UPLC-MS/MS质谱参数
4.样品测试
对空白组、对照组、红曲霉菌株组、植物乳杆菌LP90实验组、嗜酸乳杆菌LA3实验组、植物乳杆菌LPG18实验组、植物乳杆菌P8实验组、复合菌株组中的大鼠血浆样品中的人参皂苷含量进行测试。
空白组中未检出人参皂苷。对照组中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、20R-Rg2、Rb1、20R-Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd在大鼠体内代谢，均在10h以内达到最大浓度(Cmax)，同时稀有皂苷F2、PPT、20R-PPT、Rg3、20R-Rg3、compound K、Rh2、20R-Rh2、PPD、20R-PPD也在10h以内达到最大浓度。与对照组相比，红曲霉菌株组、植物乳杆菌LP90实验组、嗜酸乳杆菌LA3实验组、植物乳杆菌LPG18实验组、植物乳杆菌P8实验组和复合菌株组中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、20R-Rg2、Rb1、20R-Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd达到最大检出浓度的时间均有不同程度的提前。
各组中的人参皂苷Rg3和20R-Rg3代谢数据结果如表3所示。
表3各组人参皂苷Rg3和20R-Rg3代谢数据
由表3可知，对照组中人参皂苷Rg3和20R-Rg3在灌胃6h后达到最大检出，浓度分别为34.21μg/ml和17.75μg/ml。
与对照组相比，红曲霉菌株组、植物乳杆菌LP90实验组、嗜酸乳杆菌LA3实验组、植物乳杆菌LPG18实验组、植物乳杆菌P8实验组和复合菌株组中人参皂苷Rg3和20R-Rg3的最大检出浓度均有提高。
与红曲霉菌株组相比，植物乳杆菌LP90实验组、嗜酸乳杆菌LA3实验组、植物乳杆菌LPG18实验组、植物乳杆菌P8实验组和复合菌株组的人参皂苷Rg3和20R-Rg3的最大检出浓度均有明显提高。
与单个菌株实验组(植物乳杆菌LP90实验组、嗜酸乳杆菌LA3实验组、植物乳杆菌LPG18实验组和植物乳杆菌P8实验组)相比，复合菌株组的人参皂苷Rg3和20R-Rg3的最大检出浓度均有提高。也就是说，本发明的特定的组合物(人参提取物与特定菌株形成的复合菌株)与单个菌株组相比，可以提高稀有人参皂苷Rg3和20R-Rg3的吸收利用率，进而可以提高人参抗肿瘤和提高免疫力的活性。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (10)
1.一种含人参皂苷的组合物，其特征在于，所述组合物中包括人参提取物和复合菌株；基于200mg人参提取物，复合菌株的活菌数量为1.43×108～9×1011CFU/mL；其中，所述复合菌株由植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～3:1:1。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～2:1:1。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1:1:1。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述人参提取物中水的含量为2～5wt％。
6.根据权利要求1～5任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于：
(1)将人参原料与6～12倍重量水混合，在60～85℃下超声提取30～90min，过滤，得人参提取液；将人参提取液浓缩，得到人参提取物；其中，人参原料为人参饮片或人参粉末；
(2)分别取植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8冻干粉溶解后，分别划线接种至MRS基础培养平板上，转移至37℃厌氧箱中培养24～60h；挑取平板上的菌落加入含有1～10mL MRS基础培养液的试管中，转移至37℃厌氧箱中培养24～60h，分别获得植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的培养液，然后将各菌株的培养液混合，得到复合菌株的培养液；
(3)将人参提取物和复合菌株的培养液混合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述人参提取液中人参总皂苷的含量为8～15mg/mL。
8.根据权利要求1～5任一项所述的组合物在制备抗癌药物、抗炎药物、抗过敏药物、抗糖尿病药物或抗氧化药物中的用途。
9.一种复合菌株在制备提高人参皂苷Rg3的吸收利用率中的药物中的用途，其特征在于，所述复合菌株由植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8组成。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，植物乳杆菌LP90、嗜酸乳杆菌LA3、植物乳杆菌LPG18和植物乳杆菌P8的活菌数量比为1:1～3:1:1。
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| CN113897304A (zh) * | 2021-09-07 | 2022-01-07 | 康美药业股份有限公司 | 一种可提高人参皂苷转化度的复合菌株组合物及其应用 |
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| 夏晚霞等: "乳酸菌发酵转化人参皂苷", 《现代食品科技》 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210903 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |