CN113322172A - 一种用于核酸检测的微流控芯片及核酸检测设备 - Google Patents
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Abstract
一种用于核酸检测的微流控芯片及核酸检测设备，该微流控芯片包括样本提纯腔、扩增液准备腔、扩增液停留腔、混合流道、反应液收集腔、分液结构、扩增反应腔和废液腔，在第一离心运动下，扩增液准备腔内的扩增液可流入扩增液停留腔，而在样本提纯腔内的样本液由于毛细力的作用留在样本提纯腔；在第二离心运动下，扩增液和样本液可突破毛细力的约束进入混合流道，充分混合后汇聚于反应液收集腔；在第三离心运动下，反应液收集腔内的反应液经过分液结构均匀分配到多个扩增反应腔，以便在扩增反应腔室内进行恒温扩增反应和实时荧光检测。该微流控芯片可实现快速、简单、稳定的离心分液操作，便捷、高效、可靠地完成恒温扩增反应及荧光检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是一种用于核酸检测的微流控芯片及核酸检测设备。
背景技术
传统的核酸检测手段包括样本采集、核酸提取和核酸扩增和检测，依托于荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术，要求具备生物安全二级及以上的实验室条件和生物安全三级实验室级别的个人防护，很大程度上将检测限定在高等级疾控中心和三甲医院等机构。相对有限的医疗资源面对庞大的待检测群体，传统核酸检测手段逐渐暴露出众多缺陷：核酸提取过程繁冗且，试剂成本高，检测耗时长，大量样品处理能力弱，自动化水平低，集成度差，需要专业检测人员及昂贵设备，已经无法满足新形势下的高标准、高质量、高效率的核酸检测新需求。与此同时，病毒传染性强，在核酸提取和扩增过程中极易形成气溶胶污染，对医务人员防护工作提出了新的要求，对检测人员的身体健康也带来潜在的威胁。综上所述，适用于医疗条件欠缺的多场景的经济、快捷、高效、安全、稳定、准确的核酸检测方法和设备的研发至关重要且迫在眉睫。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述背景技术存在的缺陷，提供一种用于核酸检测的微流控芯片及核酸检测设备，以实现简便、快速、高效、可靠的核酸检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于核酸检测的微流控芯片，包括层叠设置在一起的基底层和盖板层，所述基底层上设置有样本提纯腔、扩增液准备腔、扩增液停留腔、混合流道、反应液收集腔、分液结构、扩增反应腔和废液腔，其中，所述扩增液准备腔连接所述扩增液停留腔，所述扩增液停留腔和所述样本提纯腔经过毛细阀连接所述混合流道的入口，所述混合流道的出口连接所述反应液收集腔，所述反应液收集腔经过毛细阀连接所述分液结构，再经过所述分液结构连接所述扩增反应腔和所述废液腔，其中，芯片在第一离心运动下时，注入所述扩增液准备腔内的扩增液可流入所述扩增液停留腔，而在所述样本提纯腔内纯化的样本液由于毛细力的作用留在所述样本提纯腔；芯片在第二离心运动下时，所述扩增液停留腔内的扩增液和所述样本提纯腔内的样本液可突破毛细力的约束进入所述混合流道，充分混合后汇聚于所述反应液收集腔；芯片在第三离心运动下时，所述反应液收集腔内的反应液经过所述分液结构均匀分配到多个所述扩增反应腔，以便在所述扩增反应腔室内进行恒温扩增反应和实时荧光检测，而多余的液体进入所述废液腔；其中，所述第一至第三离心运动转速递增。
进一步地：
所述微流控芯片包括多组所述样本提纯腔、所述扩增液准备腔、所述扩增液停留腔、所述混合流道、所述反应液收集腔、所述分液结构、所述扩增反应腔和所述废液腔，各组沿周圆方向均匀分布。
多个所述扩增液准备腔呈花瓣状均匀分布在所述微流控芯片的中央。
所述基底层和/或所述盖板层的材料选自聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS中的一种或多种。
所述基底层和/或所述盖板层模压热塑成型或注塑成型。
所述基底层和所述盖板层采用压合工艺封装。
所述基底层和所述盖板层上设置有用于与离心设备的转轴配合的中心圆孔。
所述第一至第三离心运动的转速和持续时间依次为：700～1000rpm优选800rpm，10～20s优选15s；1100～2000rpm优选1500rpm，10～20s优选15s；2500～4000rpm优选3000rpm，40～50s优选45s。
一种核酸检测设备，包括所述微流控芯片、离心设备以及电机，所述微流控芯片设置在所述离心设备上，所述电机用于驱动所述离心设备旋转，以通过至少三级转速实现第一离心运动至第三离心运动。
进一步地：
还包括用于将扩增反应腔加热至扩增反应所需温度的温度控制装置。
所述温度控制装置包括可快速变温加热板。
还包括荧光信号检测装置，所述荧光信号检测装置用于实时采集芯片扩增反应腔内的荧光信号，监测核酸恒温扩增反应的荧光值，以便反应结束后根据所采集的荧光信号绘制扩增曲线供后续研究与分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种可用于核酸纯化、等温扩增和实时荧光检测的微流控芯片，可以实现集成式自动化的微流控核酸检测，操作简单，成本低廉，适用于资源有限条件下的高通量、大规模的初筛检测。使用时，在芯片上手动完成加液后自动进行核酸提纯，再通过离心设备使芯片逐级进行第一离心运动至第三离心运动，控制芯片上的扩增液、样本液以及混合液按照三个阶段进行流动与分配，可实现快速、简单、稳定的离心分液操作，便捷、高效、可靠地完成恒温扩增反应及荧光检测。其结构简单，控制方便，无需使用有毒有害试剂，保证检测结果的可靠、稳定及快速获得。
本发明芯片结构简单，控制方便，极大程度上简化人为操作进而提高检测效率，保证检测结果的可靠、稳定以及可快速获得，能很好地满足临床、疫病检测等快速检测的需求。本发明在即时核酸检测中具有广阔的应用前景，尤其适合应用于医疗资源相对匮乏，专业医务人员数量有限的偏远地区或应对疫情爆发等突发环境。
附图说明
图1为本发明一种实施例的用于核酸检测的微流控芯片整体结构示意图。
图2为本发明一种实施例的微流控芯片的盖板层和基底层的结构示意图。
图3为本发明一种实施例的微流控芯片操作流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。另外，连接既可以是用于固定作用也可以是用于耦合或连通作用。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多该特征。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
参阅图1和图2，在一种实施例中，一种用于核酸检测的微流控芯片，包括层叠设置在一起的基底层10和盖板层9，所述基底层10上设置有样本提纯腔8、扩增液准备腔1、扩增液停留腔2、混合流道3、反应液收集腔7、分液结构5、扩增反应腔6和废液腔4，其中，所述扩增液准备腔1连接所述扩增液停留腔2，所述扩增液停留腔2和所述样本提纯腔8经过毛细阀连接所述混合流道3的入口，所述混合流道3的出口连接所述反应液收集腔7，所述反应液收集腔7经过毛细阀连接所述分液结构5，再经过所述分液结构5连接所述扩增反应腔6和所述废液腔4，其中，芯片在第一离心运动下时，注入所述扩增液准备腔1内的扩增液可流入所述扩增液停留腔2，而在所述样本提纯腔8内纯化的样本液由于毛细力的作用留在所述样本提纯腔8；芯片在转速大于第一离心运动的第二离心运动下时，所述扩增液停留腔2内的扩增液和所述样本提纯腔8内的样本液可突破毛细力的约束进入所述混合流道3，充分混合后汇聚于所述反应液收集腔7；芯片在转速大于第二离心运动的第三离心运动下时，所述反应液收集腔7内的反应液经过所述分液结构5均匀分配到多个所述扩增反应腔6，以便在所述扩增反应腔6室内进行恒温扩增反应和实时荧光检测，而多余的液体进入所述废液腔4。
在优选的实施例中，所述第一至第三离心运动的转速和持续时间依次为：700～1000rpm优选800rpm，10～20s优选15s；1100～2000rpm优选1500rpm，10～20s优选15s；2500～4000rpm优选3000rpm，40～50s优选45s。以上转速和持续时间的分级可以很好地按阶段控制液体的流动和分配。在一个特别优选的实施例中，所述第一至第三离心运动的转速和持续时间依次为：800rpm，15s；1500rpm，15s；3000rpm，45s。
在优选的实施例中，所述基底层10和所述盖板层9上设置有用于与离心设备(未图示)的转轴配合的中心圆孔。
在优选的实施例中，所述微流控芯片包括多组的所述样本提纯腔8、所述扩增液准备腔1、所述扩增液停留腔2、所述混合流道3、所述反应液收集腔7、所述分液结构5、所述扩增反应腔6和所述废液腔4，各组沿周圆方向均匀分布。
在一些实施例中，微流控芯片用于核酸纯化、等温扩增和实时荧光检测，以离心力作为驱动力，实现扩增液自扩增液准备腔1均分至扩增液停留腔2；样本液经样本提纯腔8纯化；扩增液与样本液通过混合流道3充分混合至反应液收集腔7；利用分液结构5将反应液精确分配到扩增反应腔6室；多余液体则储存在废液腔4。离心分液结束后，扩增反应腔6室内液体被温度控制装置加热至反应温度，恒温扩增反应和实时荧光检测同时开始进行，反应结束后自动生成扩增曲线供后续分析。
在一些实施例中，基底层10和盖板层9的材料可采用(但不限于)聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS等常见的医用塑料。基底层10和盖板层9可采用模压热塑成型、注塑成型等多种塑料成型方式。基底层10和盖板层9可采用压合工艺封装。
盖板层9上可设置连接到所述样本提纯腔8以及所述扩增液准备腔1等处的进液小孔以便进液(未图示)。
在一些实施例中，所述样本提纯腔8通过注射的方式预先储存有核酸提纯试剂；所述核酸提取试剂包括但不限于阳离子螯合树脂Chelex-100，能够在95℃高温细胞裂解时防止DNA的降解同时特异性吸附非核酸杂质，包括细胞碎片、脂质、蛋白质等，从而实现对核酸的提取；所述的扩增液准备腔1，所述扩增液准备腔1呈花瓣状均分在微流控芯片中央，扩增液通过注射的方式预先加入并能自动均匀分散；所述混合流道3呈S型；所述混合流道3与样本提纯腔8和扩增液停留腔2连接处设置有毛细阀；所述扩增反应腔6内预先包埋有与检测项目相匹配的冷冻干燥引物；所述引物能够与反应液接触后快速溶解形成均一的扩增反应液体系。
在一些实施例中，一种使用所述微流控芯片的核酸检测方法包括如下步骤：
1)将样本液注射入样本提纯腔8，样本提纯腔8加热到95℃并静置五到十分钟以实现样本裂解和核酸纯化；
2)将扩增液注入扩增液准备腔1，对芯片进行第一次离心，扩增液自扩增液准备腔1流入扩增液停留腔2，而样本由于毛细力的作用留在原位；
3)对芯片再次离心并提高转速，突破毛细力的约束，释放扩增液和提纯后的核酸样本液，二者通过混合流道3充分混合并汇聚于反应液收集腔7；
4)随后再次进行高速离心，将反应液精确分配到扩增反应腔6，其中分液结构5保证了反应液的均分，而多余的液体进入废液腔4；
5)随后将反应室加热至扩增反应所需温度，起始反应并记录实时荧光信号；当反应完成时，扩增曲线将自动生成以供进一步研究分析。
在一些实施例中，一种核酸检测设备，包括所述微流控芯片、离心设备、电机以及温度控制装置，可实现离心、温度控制、进行核酸纯化、等温扩增及实时荧光检测。所述电机可为伺服电机。所述离心设备的转速可通过伺服电机控制，能够实现至少三级加减速，从而驱动芯片内液体进行可控的三阶段流动。所述温度控制装置包括可快速变温加热板，维持所述样本纯化腔中样本裂解和核酸纯化所需温度，随后变温，维持扩增反应腔6中恒温扩增所需温度。所述的荧光信号检测装置实时采集芯片扩增反应腔6内的荧光信号，监测核酸恒温扩增反应的荧光值，反应结束后根据所收集的荧光信号绘制扩增曲线供后续研究与分析。
以下进一步结合附图描述本发明具体实施例。
参阅图1和图2，一种实施例提供一种用于核酸纯化、等温扩增和实时荧光检测的微流控芯片，包括层叠设置在一起的基底层10和盖板层9，所述基底层10上设置有扩增液准备腔1、扩增液停留腔2、混合流道3、废液腔4、分液结构5、八个扩增反应腔6、反应液收集腔7和样本提纯腔8。样本提纯腔8内通过注射的方式预先储存有核酸提纯试剂，扩增液准备腔1呈花瓣状均分在微流控芯片中央用于均匀分配扩增液，S型混合流道3与样本提纯腔8和扩增液停留腔2连接处设置有毛细阀以限制样本流出，分液结构5保证均匀分配反应液，扩增反应腔6内预先包埋有与检测项目相匹配的冷冻干燥引物，能够与反应液接触后快速溶解形成均一的扩增反应液体系。
参阅，在一种实施例中，使用前述的微流控芯片进行核酸纯化、扩增和检测的步骤具体包括：
1)取出预先添加有核酸纯化剂和包埋了冷冻干燥引物的芯片(图3中
)；
2)使用注射枪向样本提纯腔8注射待测样品50μL，温度控制12设备将样本提纯腔8加热到95℃并静置五到十分钟以实现样本裂解和核酸纯化(图3中
)；
3)使用注射枪向扩增液准备腔1注射扩增液75μL的芯片(图3中
)；
4)将微流控芯片固定在配套的离心设备上，打开开关开始预设的离心模式；
5)芯片经过第一次离心，扩增液自扩增液准备腔1流入扩增液停留腔2，而提纯后的样本由于毛细力的作用留在样本提纯腔8(图3中
)；
6)芯片经过第二次离心，提纯后的样本和扩增液突破毛细力的约束后释放至混合流道3并进行充分混合汇聚于反应液收集腔7(图3中
)；
7)芯片再次进行高速离心，将反应液收集腔7中的反应液精确分配到扩增反应腔6，其中分液结构5保证了反应液的均分，而多余的液体进入废液腔4(图3中
)；
8)温度控制装置将扩增反应腔6加热至等温扩增所需的65℃，荧光信号检测装置在扩增反应开始的同时采集扩增反应腔6内的荧光信号，监测核酸恒温扩增反应的荧光值，反应结束后根据所收集的荧光信号绘制扩增曲线供后续研究与分析。
本发明提供的核酸检测芯片，将核酸的纯化浓缩与实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合到同一个微流控芯片中，并采用离心力作为驱动利用多级转速实现液体的流动、混合与分配，极大减少人为操作，缩短检测时间，同时也发挥出微流控芯片技术本身的优势(低成本、自动化等)，满足临床中快速诊断的需要。本发明可以实现集成式自动化的微流控核酸检测，操作简单，成本低廉，特别适用于资源有限条件下的高通量、大规模的初筛检测。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
Claims (10)
1.一种用于核酸检测的微流控芯片，其特征在于，包括层叠设置在一起的基底层和盖板层，所述基底层上设置有样本提纯腔、扩增液准备腔、扩增液停留腔、混合流道、反应液收集腔、分液结构、扩增反应腔和废液腔，其中，所述扩增液准备腔连接所述扩增液停留腔，所述扩增液停留腔和所述样本提纯腔经过毛细阀连接所述混合流道的入口，所述混合流道的出口连接所述反应液收集腔，所述反应液收集腔经过毛细阀连接所述分液结构，并经过所述分液结构连接所述扩增反应腔和所述废液腔，其中，芯片在第一离心运动下时，注入所述扩增液准备腔内的扩增液可流入所述扩增液停留腔，而在所述样本提纯腔内纯化的样本液由于毛细力的作用留在所述样本提纯腔；芯片在第二离心运动下时，所述扩增液停留腔内的扩增液和所述样本提纯腔内的样本液可突破毛细力的约束进入所述混合流道，充分混合后汇聚于所述反应液收集腔；芯片在第三离心运动下时，所述反应液收集腔内的反应液经过所述分液结构均匀分配到多个所述扩增反应腔，以便在所述扩增反应腔室内进行恒温扩增反应和实时荧光检测，而多余的液体进入所述废液腔；其中，所述第一至第三离心运动转速递增。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，包括多组所述样本提纯腔、所述扩增液准备腔、所述扩增液停留腔、所述混合流道、所述反应液收集腔、所述分液结构、所述扩增反应腔和所述废液腔，各组沿周圆方向均匀分布。
3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，多个所述扩增液准备腔呈花瓣状均匀分布在所述微流控芯片的中央。
4.如权利要求1至3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层和/或所述盖板层的材料选自聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS中的一种或多种；所述基底层和/或所述盖板层模压热塑成型或注塑成型；所述基底层和所述盖板层采用压合工艺封装。
5.如权利要求1至4任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层和所述盖板层上设置有用于与离心设备的转轴配合的中心圆孔。
6.如权利要求1至5任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一至第三离心运动的转速和持续时间依次为：700～1000rpm优选800rpm，10～20s优选15s；1100～2000rpm优选1500rpm，10～20s优选15s；2500～4000rpm优选3000rpm，40～50s优选45s。
7.一种核酸检测设备，其特征在于，包括如权利要求1至6任一项所述的微流控芯片、离心设备以及电机，所述微流控芯片设置在所述离心设备上，所述电机用于驱动所述离心设备旋转，以通过至少三级转速实现第一离心运动至第三离心运动。
8.如权利要求7所述的核酸检测设备，其特征在于，还包括用于将扩增反应腔加热至扩增反应所需温度的温度控制装置。
9.如权利要求8所述的核酸检测设备，其特征在于，所述温度控制装置包括可快速变温加热板。
10.如权利要求7至9任一项所述的核酸检测设备，其特征在于，还包括荧光信号检测装置，所述荧光信号检测装置用于实时采集芯片扩增反应腔内的荧光信号，监测核酸恒温扩增反应的荧光值，以便反应结束后根据所采集的荧光信号绘制扩增曲线供后续研究与分析。
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