CN113321706A

CN113321706A - 一种自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶

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Publication number: CN113321706A
Application number: CN202110800384.5A
Authority: CN
Inventors: 杨志谋; 王玲; 艾思凡
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2021-07-15
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-07-15
Also published as: CN113321706B

Abstract

本发明属于生物材料的技术领域，本发明提供了一种自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶。本发明提供的自组装多肽衍生物的结构为Biotin‑^DPhe‑X，其中，Biotin为封端，^DPhe为D构型的氨基酸Phe，X为活性多肽序列，Biotin、^DPhe和X之间通过肽键连接。本发明提供的自组装多肽衍生物能够自组装形成纳米纤维，宏观上形成水凝胶，且形成的水凝胶稳定性强，具有一定的力学性能。

Description

一种自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶

技术领域

本发明涉及水凝胶的技术领域，尤其涉及一种自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶。

背景技术

自组装多肽及其衍生物制备的水凝胶生物相容性好，可以应用于组织工程、药物递送、细胞培养等多个领域中，因此受到科学界的广泛关注。一般的，可自组装的多肽水凝胶肽链的序列较长，合成复杂，且封端多为苯环等非天然端基，因此，在具体应用时水凝胶的生物相容性还是受到限制。由寡肽(2～10个氨基酸)和Biotin自组装受到的关注和研究较少，对其后续的修饰以及应用开发是必要且有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶，该多肽衍生物的成分均由生命体中所存在的物质构成，具有更高的生物相容性，能够满足具体应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种自组装多肽衍生物，所述自组装多肽衍生物的结构为Biotin-^DPhe-X，其中，Biotin为封端，^DPhe为D构型的氨基酸Phe，X为活性多肽序列，Biotin、^DPhe和X之间通过肽键连接。

优选的，所述活性多肽序列如SEQ ID NO:1～3中任一序列所示。

本发明还提供了一种由所述自组装多肽衍生物中的一种或几种制备的水凝胶。

优选的，所述水凝胶中包含一种自组装多肽衍生物时，所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于4mg/mL；所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于3mg/mL；所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于7mg/mL。

优选的，所述水凝胶中包含两种自组装多肽衍生物时，所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示时，所述两种自组装多肽衍生物的总浓度不低于4mg/mL，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为3:1～1:3，优选的，所述混合浓度比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3；

所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1所示时，所述两种自组装多肽衍生物的总浓度不低于4mg/mL，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为3:1～1:3，优选的，所述混合浓度比为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3；

所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示时，所述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为2～3:1时，优选为2:1或3:1时，总浓度不低于2mg/mL；所述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1:1时，总浓度不低于3mg/mL；所述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1:2～3时，优选为1:2或1:3时，总浓度不低于4mg/mL。

优选的，所述水凝胶中包含三种自组装多肽衍生物时，所述三种自组装多肽衍生物的总浓度不低于3mg/mL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3三种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1～2:1～2:1～3，优选的，混合浓度比为1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2、1:1:3。

本发明还提供了一种水凝胶的制备方法，将所述自组装多肽衍生物溶于PBS缓冲液中，加热至溶解，冷却后得到所述水凝胶。

优选的，所述PBS缓冲液为1×PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH为7～8。

优选的，所述加热为加热至沸腾，所述冷却后的温度为20～25℃。

本发明的有益效果：

本发明提供的自组装多肽衍生物结构明确，所有原料均来源于生命体本身，并以Biotin(生物素)作为封端，具有更好的生物相容性。制备工艺简单，可以通过固相合成法大量合成，产率高，成本低。本发明提供的多肽衍生物通过加热冷却的方法能够在PBS溶液中自组装形成纳米纤维，宏观上形成水凝胶，且形成的水凝胶稳定性强，具有一定的力学性能。

附图说明

图1为Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物的合成方法示意图；

图2为Biotin-^DF-YIGSSSR、Biotin-^DF-YIGSR、Biotin-^DF-YIGSRGD三条多肽衍生物不同浓度下的成胶情况；

图3为3mg/mL的Biotin-^LPhe-YIGSR的成胶情况；

图4为Biotin-^DF-YIGSSSR多肽衍生物的高分辨图谱；

图5为Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物的高分辨图谱；

图6为Biotin-^DF-YIGSRGD多肽衍生物的高分辨图谱；

图7为Biotin-^LF-YIGSR多肽衍生物的高分辨图谱；

图8为Biotin-^DF-YIGSSSR、Biotin-^DF-YIGSR、Biotin-^DF-YIGSRGD三条多肽衍生物水凝胶材料的流变性能对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种自组装多肽衍生物，所述自组装多肽衍生物的结构为Biotin-^DPhe-X，其中，Biotin为封端，^DPhe为D构型的氨基酸Phe，X为活性多肽序列，Biotin、^DPhe和X之间通过肽键连接。

在本发明中，当X为SEQ ID NO：1所示的多肽序列时，形成的多肽衍生物的结构如下：

在本发明中，将上述结构的多肽水凝胶表示为：Biotin-^DF-Tyr-Ile-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg，进一步表示为：Biotin-^DF-YIGSSSR。

在本发明中，当X为SEQ ID NO：2所示的多肽序列时，形成的多肽衍生物的结构如下：

在本发明中，将上述结构的多肽水凝胶表示为：Biotin-^DF-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg，进一步表示为：Biotin-^DF-YIGSR。

在本发明中，当X为SEQ ID NO：3所示的多肽序列时，形成的多肽衍生物的结构如下：

在本发明中，将上述结构的多肽水凝胶表示为：Biotin-^DF-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Asp，进一步表示为：Biotin-^DF-YIGSRGD。

在本发明中，实验药品和仪器的使用如下表1所示：

表1 实验所用药品和仪器列表

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例以Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物为例利用固相合成法制备。具体步骤如下：

(1)溶胀：称取0.5mmol的二氯树脂(取代度为1.1mmol/g)倒入固相管中，加入10mL的二氯甲烷(DCM)溶胀10min后，用洗耳球将DCM从固相管中挤出；

(2)加第一个氨基酸(Arg)：称取0.75mmol第一种氨基酸(1.5倍的二氯树脂的含量)溶解于DCM中，并加入1.5mmol的DIEA，反应2h，目的是将Fmoc保护的氨基酸的C端与二氯树脂结合；

(3)洗涤：用DCM洗涤3次，每次1min；

(4)封闭：加入封闭液(DCM:甲醇:DIEA＝17:2:1体积比)，将二氯树脂上未完全反应的活性基团封闭，以提高多肽的产率与纯度；

(5)换液：用DCM洗5次，每次1min，然后将DCM换为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，用DMF洗5次，每次1min；

(6)切保护基：用20％的哌啶溶液切掉氨基酸N端的保护基Fmoc，30min；

(7)洗涤：用DMF洗5次，每次1min，以除去哌啶；

(8)加氨基酸：加入1mmol的下一个氨基酸(Ser)的DMF溶液，加入2mmol的DIEA，1mmol的缩合剂HBTU，反应2h，通过Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽链上的N端耦联的方式连上下一个氨基酸，反应完成后用DMF洗涤5次，每次1min；

(9)重复(6)～(8)步(氨基酸连接的顺序依次为Gly、Ile、Tyr、^DPhe、)，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；

(10)加Biotin：将1mmol的Biotin溶解于DMF中，加入2mmol的DIEA和1mmol的HBTU，反应2h，通过Biotin末端的羧基与树脂上多肽链的N端偶联，反应完成后用DMF洗涤5次，每次1min；

(11)切树脂：用95％的三氟乙酸将多肽衍生物从树脂上切下，收集液体，用旋蒸仪蒸干，加入无水乙醚沉淀得到粗产品；

(12)分离纯化：使用高效液相色谱(HPLC)对多肽衍生物粗产品进行纯化分离，得到Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物。

Biotin-^DF-YIGSSSR和Biotin-^DF-YIGSRGD多肽衍生物的制备方法同Biotin-^DF-YIGSR，区别仅在于连接的氨基酸不同。制备Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物的合成方法示意图如图1所示。

实施例2

以实施例1制备的Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物为例，制备Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物的水凝胶。

称取多肽衍生物粉末5mg于小玻璃瓶中，用1M的Na₂CO₃溶液调节1×PBS缓冲液的pH＝7.4，取1mL加入小玻璃瓶中，并混合均匀。加热玻璃小瓶，使得溶液沸腾直到化合物完全溶解，后静置，冷却至室温，即可得到稳定的水凝胶。

对比例1

按照实施例1的方法分别制备得到Biotin-^DF-YIGSSSR、Biotin-^DF-YIGSR和Biotin-^DF-YIGSRGD多肽衍生物，并按照实施例2的方法，分别制备得到浓度为4mg/mL和3mg/mL的Biotin-^DF-YIGSSSR多肽衍生物水凝胶、浓度为3mg/mL和2mg/mL的Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物水凝胶、浓度为7mg/mL和6mg/mL的Biotin-^DF-YIGSRGD多肽衍生物水凝胶，其成胶情况如图2所示，从图2中可以看出：4mg/mLBiotin-^DFYIGSSSR可成稳定水凝胶，3mg/mL无法形成稳定水凝胶；3mg/mL Biotin-^DFYIGSR可成稳定水凝胶2mg/mL无法形成稳定水凝胶；7mg/mL Biotin-^DFYIGSRGD可成稳定水凝胶，6mg/mL无法形成稳定水凝胶。

由此可知，本发明提供的多肽衍生物水凝胶在一定浓度下可以形成纳米纤维，宏观上表现为稳定的水凝胶，这种稳定水凝胶具有致密的纤维结构，即使将胶体涡旋打散后，稳定后依然能够恢复胶体状态。将本发明的凝胶保存于4℃，可以维持凝胶状态至少一个月无沉淀析出。

对比例2

按照实施例1和实施例2的方法制备得到3mg/mL Biotin-^LF-YIGSR多肽衍生物水凝胶，其与Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物的区别在于，第一个氨基酸Phe为L构型，其成胶情况如图3所示，从图3中可以看出：Biotin-^LPhe-YIGSR多肽衍生物不能够形成稳定的水凝胶，反而产生了絮状沉淀物。由此可知，当第一各氨基酸Phe为L构型时无法形成水凝胶，只能得到沉淀物。

实施例3

对对比例1和对比例2中制备的Biotin-^DF-YIGSSSR、Biotin-^DF-YIGSR、Biotin-^DF-YIGSRGD和Biotin-^LF-YIGSR多肽衍生物进行光谱分析，得到的高分辨图谱如图4～7所示。

实施例4

按照实施例1和实施例2的方法，分别制备得到浓度为5mg/mL的Biotin-^DF-YIGSSSR多肽衍生物水凝胶、5mg/mL的Biotin-^DF-YIGSR多肽衍生物水凝胶和7mg/mL的Biotin-^DF-YIGSRGD多肽衍生物水凝胶，对其进行力学性能进行测试。测试方法如下：

流变学性质的考察用流变仪AR 2000ex(TAinstrument)完成。温度设置为25℃，使用25mm不锈钢平板。采用动态扫描模式，取2mL上述条件配制的水凝胶迅速上样并开始如下测试：进行频率扫描，1％的应变条件，扫描频率范围设定为0.1rad/s～100rad/s，随着力学性能扫描频率的变大，测取力学性能的变化趋势，得到G’和G”的变化曲线，如图8所示。当G’(弹性模量)比G”(粘性模量)大1～2个数量级时就说明形成了稳定的凝胶。根据图8可以看出，三种多肽均能够形成稳定的凝胶并且其弹性模量最大分别能够达到10kPa，0.8kPa，35kPa。表明，本发明制备的水凝胶具有良好的力学性能。

实施例5

本实施例制备了含有多种自组装多肽衍生物的混合水凝胶，制备的混合水凝胶的最低成胶浓度和混合浓度比如表1和表2所示。

表1 两种混合胶的最低成胶浓度(mg/mL)

表2 三种混合胶的最低成胶浓度(mg/mL)

在制备混合水凝胶的过程中发现，含有Biotin-^DF-YIGSRGD多肽的水凝胶成胶时间均较长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一种自组装多肽衍生物及其制备的水凝胶

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Ala

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Gly Ser Arg

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Ile Gly Ser Arg Gly Asp

1 5

Claims

1.一种自组装多肽衍生物，其特征在于，所述自组装多肽衍生物的结构为Biotin-^DPhe-X，其中，Biotin为封端，^DPhe为D构型的氨基酸Phe，X为活性多肽序列，Biotin、^DPhe和X之间通过肽键连接。

2.如权利要求1所述的一种自组装多肽衍生物，其特征在于，所述活性多肽序列如SEQID NO：1～3中任一序列所示。

3.一种由权利要求1或2所述的自组装多肽衍生物中的一种或几种制备的水凝胶。

4.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中包含一种自组装多肽衍生物时，所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于4mg/mL；所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于3mg/mL；所述自组装多肽衍生物中的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示时，所述自组装多肽衍生物的浓度不低于7mg/mL。

5.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中包含两种自组装多肽衍生物时：

所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示时，所述两种自组装多肽衍生物的总浓度不低于4mg/mL，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为3:1～1:3；

所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1所示时，所述两种自组装多肽衍生物的总浓度不低于4mg/mL，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为3:1～1:3；

所述两种自组装多肽衍生物的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示时，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为2～3:1时，总浓度不低于2mg/mL；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1:1时，总浓度不低于3mg/mL；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2两种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1:2～3时，总浓度不低于4mg/mL。

6.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中包含三种自组装多肽衍生物时，所述三种自组装多肽衍生物的总浓度不低于3mg/mL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3三种自组装多肽衍生物的混合浓度比为1～2:1～2:1～3。

7.一种权利要求3～6任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述自组装多肽衍生物溶于PBS缓冲液中，加热至溶解，冷却后得到所述水凝胶。

8.如权利要求7所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为1×PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH为7～8。

9.如权利要求7所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述加热为加热至沸腾，所述冷却后的温度为20～25℃。