CN113304136A - 泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用和含泰妙菌素流产衣原体抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用和含泰妙菌素流产衣原体抑制剂，属于抗衣原体药物技术领域。具有式I所示结构的泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用。在动物细胞和鸡胚水平上，泰妙菌素有效抑制流产衣原体的增殖。泰妙菌素对流产衣原体的抑制作用，为治疗动物流产衣原体病提供了新的思路。鉴于泰妙菌素和四环素均具有较强的抑制流产衣原体的生物功能，本发明还提供了一种包括泰妙菌素和四环素的药物组合物，用于抑制流产衣原体生长。所述药物组合物在制备预防人、禽、畜流产的药物中的应用，扩宽了市场上抑制流产衣原体的产品种类，能大大提高市场同类产品的竞争力。

Description

泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用和含泰妙菌素流 产衣原体抑制剂

技术领域

本发明属于抗衣原体药物技术领域，具体涉及泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用和含泰妙菌素流产衣原体抑制剂。

背景技术

泰妙菌素属于截断侧耳类抗生素，是一种畜禽专用抗生素，能够与细菌核糖体50S亚基的肽基转移酶活性中心(PTC)形成诱导契合效应，导致其亚基发生重排，同时三环残基延伸部位能够与P-tRNA 结合位点部分重合(Schnitzel.,et al,2004)，从而直接抑制肽键形成，以此达到抑菌目的。泰妙菌素在体内吸收速度快、分布广泛，作为饲料添加剂对猪有促生长的作用(Cromwell.,et al,1985)。近年来中国未发生规模化猪场的衣原体病流行情况，可能是与部分养殖场将泰妙菌素作为饲料添加剂以用于预防肠道性疾病和增加动物体重有关。但临床治疗过程中细菌很少获得对截短侧耳素类药物的耐药，其可能机制是由于截短侧耳素类药物的耐药通常由rrl和rplC基因的共同突变引起的。rplC基因的一步或两步突变仅能导致截短侧耳类药物敏感性的轻微下降，只有完成三步突变才能使其MIC值显著上升，而rplC 基因三步突变的频率小于10^-9。

泰妙菌素对猪、鸡的支原体，猪地方性痢疾以及短螺旋体相关疾病治疗均有报道。马生龙等通过实验证明延胡索酸泰妙菌素对猪支原体肺炎有显著的疗效，且猪的平均增重能明显高于阳性对照组，肺损伤率也能明显降低。Cromwell等实验也发现猪(13kg～57kg)饲喂泰妙菌素组比对照组增重速度快5.7％，有明显促生长的效果。Garmyn 等发现使用25mg/kg的泰妙菌素能有效治疗鸡支原体，减轻临床症状并且减少呼吸器官中鸡支原体的数量，且泰妙菌素能在停药后72h 从禽体内排出。延胡索酸泰妙菌素能降低CD73(又称ecto-5'-核苷酸酶)的活性，从而有可能抑制乳腺癌。泰妙菌素与四环素类药物联用能有协同作用。

衣原体是一种严格寄生在细胞内的革兰氏阴性病原体，衣原体病是由不同种的衣原体感染宿主所引起的一类疫病，目前衣原体有11 个种，主要包括流产衣原体、鹦鹉热衣原体、家畜衣原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体等。衣原体寄生在多种动物体内，导致动物生殖道粘膜受损，引起母畜流产或产死胎、弱胎等，以及公畜睾丸炎、尿道炎等。部分衣原体甚至会导致动物出现脑炎、结膜炎、肺炎、肠炎和多发性关节炎等多种临床症状。衣原体在全球范围内广泛分布，在我国多个地区均有动物衣原体的报道，研究员使用间接血凝试验(IHA) 调查检测发现国内近三十年至少11个省的绵羊和山羊，13个省的牛， 5个省的牦牛，15个省的猪和12个省的禽类均存在或多或少的衣原体感染，其中羊的阳性血清率为2％～40％，牛的阳性血清率为3-35％，牦牛的阳性血清率为2％～30％，猪的阳性血清率为5％～53％，禽类的阳性血清率为3.9％～59.9％。

流产衣原体一种重要的人兽共患细菌性病原，主要寄生在动物生殖道黏膜表面上皮细胞内，可感染妊娠母畜的胎盘滋养层细胞，导致严重的胎盘炎症，从而引发母畜流产或产死胎、弱胎等。流产衣原体是反刍动物流产最常见的传染病原因之一，是绵羊地方性流产(OEA) 的主要病原，在多个地区引起家畜妊娠晚期流产，对养殖业造成了较大的经济损失，同时孕妇接触了感染流产衣原体的动物也容易导致流产。

四环素从20世纪50年代开始广泛用于治疗各种因细菌感染引起的疾病，也是临床上治疗衣原体病的首选药物。四环素是通过特异性与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位置的结合，从而阻止细菌蛋白质合成，还可与线粒体70S结合，抑制线粒体蛋白质合成，以此来抑制细菌生长繁殖。但使用四环素治疗容易产生耐药菌株，细菌可通过宿主外排泵或其16S rRNA序列的突变，或改变细胞的通透性等方式来获得耐四环素基因。因此，现在临床上使用四环素治疗后并不能保证流产衣原体的根除或者直到导致治疗失败，小部分羊群在治疗后仍出现流产或产死胎、弱胎等，甚至生产的小羊羔仍携带流产衣原体，致使流产衣原体在羊场内继续传播。而且四环素也是一种人用抗生素，在畜禽上过多使用后会导致人用抗菌效果下降。

最新研究进展表明，生物因子、抗菌肽等新型药物在细胞水平上有很好的抑制效果，但是成本高、制备困难，短期内都难以投入到工厂化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供泰妙菌素的新用途，即泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用，泰妙菌素有效抑制流产衣原体的增殖，从而达到抑制流产衣原体生长的目的。

本发明的目的还在于提供一种含泰妙菌素流产衣原体抑制剂，扩宽市场上抑制流产衣原体的产品种类。

本发明提供了具有式I所示结构的泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用；

优选的，在所述流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中泰妙菌素的浓度不低于100μg/mL。

优选的，所述泰妙菌素的浓度包括128～256μg/mL。

本发明提供了一种抑制流产衣原体生长的药物组合物，包括具有式I所示结构的泰妙菌素和四环素；

优选的，所述泰妙菌素和四环素的质量比为1～10:1～10。

优选的，所述泰妙菌素和四环素的质量比为(2～4)：(1～3)。

本发明提供了所述药物组合物在制备预防人、禽、畜流产的药物中的应用。

本发明提供了泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用。实验证明，在动物细胞和鸡胚水平上，泰妙菌素有效抑制流产衣原体的增殖。泰妙菌素对流产衣原体的抑制作用，为治疗动物流产衣原体病提供了新的思路。从药效方面考量，与四环素相比，低浓度(64μg/mL)的泰妙菌素抑制流产衣原体的感染率低于同等浓度的四环素，但中浓度(128μg/mL)和高浓度(256μg/mL) 的泰妙菌素抑制流产衣原体的感染率等于或高于同等浓度的四环素。因此，泰妙菌素可以联合四环素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例中泰妙菌素药敏实验结果图；

图2为本发明实施例中McCoy细胞水平泰妙菌素抑制流产衣原体的增殖的结果；其中(A)细胞药敏试验阴性对照孔(未接毒未用药)的McCoy细胞，吉姆萨染色显微镜400倍下；(B)细胞药敏试验阳性对照孔(接种流产衣原体2.6×10⁵IFU，未用药)的McCoy细胞培养48h后，吉姆萨染色显微镜400倍下。图中深紫色部位为衣原体在细胞内形成的包涵体，旁边为细胞核；(C)实验组(接种流产衣原体2.6×10⁵IFU，0.015μg/mL的泰妙菌素处理)的McCoy细胞培养48h后，吉姆萨染色400倍下，图中基本无衣原体；

图3为本发明实施例中鸡胚药敏试验结果。

具体实施方式

本发明提供了具有式I所示结构的泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用；

在本发明中，所述泰妙菌素的分子式为C₂₈H₄₇NO₄S·C₄H₄O₄，分子量为609.8。本发明对所述泰妙菌素的形态和种类不做具体限定，即含有泰妙菌素的衍生物均属于本发明保护的泰妙菌素的范畴。本发明对所述泰妙菌素的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的泰妙菌素的来源即可。

本发明对流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物的剂型及制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑制剂或药物的制备方案即可。由于在一定浓度范围内，泰妙菌素对流产衣原体的抑制能力随浓度呈正相关，在所述流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中泰妙菌素的浓度优选不低于100μg/mL，更优选为128～256μg/mL，进一步优选为140～200μg/mL，最优选为180μg/mL。

鉴于泰妙菌素和四环素均具有较强的抑制流产衣原体的生物功能，本发明提供了一种抑制流产衣原体生长的药物组合物，包括具有式I所示结构的泰妙菌素和四环素；

在本发明中，所述泰妙菌素和四环素的质量比优选为1～10:1～10，更优选为(2～4)：(1～3)，最优选为2:1。

鉴于流产衣原体是人禽畜共患能够导致流产的细菌性病原，并且本申请证实泰妙菌素和四环素在细胞和鸡胚水平上均能有效抑制流产衣原体的增殖，本发明提供了所述药物组合物在制备预防人、禽、畜流产的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型以及制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。

下面结合实施例对本发明提供的泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂中的应用和含泰妙菌素流产衣原体抑制剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

泰妙菌素的细胞水平药敏试验

1.材料

(1)主要试剂

流产衣原体GN-6菌株由本实验室分离、鉴定并保存(参见现有技术【赵荣,阚威,李兆才,晁宜林,娄忠子,蔡金山,周继章.牦牛流产衣原体灭活苗的研究及本动物免疫试验[A].中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会.中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第六次学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会:中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会,2018:1.】)，McCoy细胞株从ATCC处购买；泰妙菌素、四环素、卡那霉素、链霉素、放线菌酮、DEAE-dextran 和吉姆萨染液均购自北京索莱宝生物有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；无水乙醇为国产分析纯。

(2)主要仪器

移液器购自Eppendorf公司；离心机和37℃、5％CO₂培养箱购自 Thermo公司；倒置显微镜购自Optec公司；荧光显微镜购自Leica公司；细胞冻存盒购自Nalgene公司；电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司。

2.细胞培养条件

细胞生长培养基：含10％FBS、卡那霉素(50μg/mL)和链霉素 (100μg/mL)的DMEM培养基；

衣原体生长培养基：含5％FBS、卡那霉素(50μg/mL)和链霉素 (100μg/mL)的DMEM培养基；

PBS缓冲液：将NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g， KH₂PO₄0.20g，去离子水定容至1L，高压灭菌后保存备用。

放线菌酮溶液(1000×)：用PBS溶液配制成浓度为1mg/mL的储存液，0.22μm的细菌滤器过滤，分装，-20℃保存备用。

DEAE-dextran溶液(1000×)：用PBS溶液配制成浓度为30mg/mL 的储存液，0.22μm的细菌滤器过滤，分装，-20℃保存备用。

盐酸卡那霉素溶液(1000×)：0.5g盐酸卡那霉素用电子天平秤取，置于15mL离心管中，量筒量取10mL去离子水进行充分溶解，配制终浓度为50mg/mL的溶液，0.22μm细菌滤器过滤除菌，按照1mL/ 管进行分装，-20℃保存备用。

盐酸链霉素溶液(1000×)：1g盐酸链霉素用电子天平秤取，置于15mL离心管中，量筒量取10mL去离子水进行充分溶解，配制终浓度为100mg/mL的溶液，0.22μm细菌滤器过滤除菌，按照1mL/管进行分装，-20℃保存备用。

细胞冻存液：含90％FBS、10％DMSO的水溶液。

SPG缓冲液：将蔗糖75g、KH₂PO₄0.52g、Na₂HPO₄1.22g、谷氨酸0.72g混合，去离子水定容至1L，用氢氧化钠调节pH值至7.4～7.6，用0.22μm的细菌滤器过滤，分装，4℃保存备用。

泰妙菌素溶液(10×)：天平秤取0.2048g泰妙菌素，用量筒量取 10ml去离子水充分溶解，配制成20.48mg/mL，按1mL/管分装，-20℃保存备用。

四环素溶液(10×)：天平秤取0.2048g四环素，用量筒量取10ml 去离子水充分溶解，配制成20.48mg/mL，按1mL/管分装，-20℃保存备用。

3.衣原体传代

(1)细胞准备：将细胞瓶中McCoy细胞转移至6孔板中(取100μL 悬浮的细胞液进行细胞计数)，待细胞铺满细胞板的80％即可接毒；

(2)换液：弃掉细胞板中原培养液，PBS润洗2次，每孔加入1mL 的30μg/mL的DEAE-D溶液，37℃、5％CO₂孵箱孵育15min；

(3)接种：吸弃各孔中的DEAE-D液，每孔加入5mL DMEM溶液，再每孔加入50μL衣原体感染液(IFU＝2.6×10⁵)；

(4)离心：将培养板用天平配平后，32℃、3000rpm，离心1h；

(5)静置：将培养板从离心机中取出，置于37℃、5％CO₂孵箱孵育2h，以便于衣原体更好地吸附细胞；

(6)换液孵育：弃去培养板中原液体，加入含10％FBS和1μg/mL 放线菌酮的细胞培养液1mL，置于37℃、5％CO₂孵箱中继续孵育；

(7)收集：将衣原体感染液弃掉，每孔加1mL SPG缓冲液，用细胞刮充分刮落细胞，超声破碎细胞20次，让衣原体彻底释放，在 4℃、1000rmp离心10min，弃沉淀，保留上清，按1mL/管在-80℃保存。

5.药敏试验

(1)与上述衣原体接种步骤一致，将细胞瓶中细胞转移至24孔板(取100μL悬浮的细胞液进行细胞计数)，在培养箱中生长到80％左右，即可用DMEM溶液(含30μg/mL的DEAE-dextran)处理McCoy 细胞，弃掉液体后，每孔加入1mL DMEM溶液(第一孔加入2mL)。

(2)接毒：预先解冻收集并测定了衣原体滴度的衣原体细胞毒，每孔接种30μL流产衣原体(2.6×10⁵IFU/mL)，32℃、3000rpm离心60min，再在37℃、5％CO₂培养箱放置2h，更换为衣原体生长液(第一孔为1mL，其余孔为500μL)。

(3)药敏：在第1孔中加入100μL抗生素(浓度为20.48mg/mL)，再依次2倍倍比稀释至第18孔，最终浓度范围为2048μg/mL～0.0075 μg/mL，第19、20孔作为阴性对照孔(不接种衣原体和不加抗生素)，第21、22孔作为阳性对照孔(接种衣原体和不加抗生素)，第23、24孔作为毒性对照孔(接种流产衣原体和加入100μL 20.48mg/mL的抗生素)，其中抗生物包括泰妙菌素和四环素，泰妙菌素和四环素分别添加到不同的毒性对照孔中。

(4)观察：在培养箱内孵育48h，甲醇固定，Giemsa染色，在 400×显微镜下每孔随机拍摄30张图片，记录每张图的包涵体数以及细胞数，计算出30张图的平均数，乘以每孔细胞总数，得出衣原体包涵体总数。每个实验做三个重复。

两种抗生素药敏结果见表1。由表1可知，泰妙菌素和四环素的 MIC₅₀MIC₉₅以及MBC的浓度均小于0.015μg/mL。

表1抗生素药物敏感性实验结果

注：MIC₅₀是指能抑制50％以上的细菌生长，MIC₉₅是指能抑制95％以上的细菌生长，MBC是指能在去掉含抗生素的培养液更换为无抗生素的培养液再继续孵育48h仍能减少90％以上的细菌生长。

0.015μg/mL和0.0075μg/mL的泰妙菌素对细胞中流产衣原体的感染率见图1。由上述结果可知，与阳性对照相比，0.015μg/mL和 0.0075μg/mL泰妙菌素能够有效抑制流产衣原体的增殖，并且抑制程度与浓度呈正相关。

McCoy细胞的感染情况见图2。与阳性对照孔结果相比，接种流产衣原体2.6×10⁵IFU，0.015μg/mL的泰妙菌素处理的McCoy细胞培养48h后基本无衣原体，与阴性对照孔结果较为一致。这表明泰妙菌素在动物细胞水平上能够有效抑制流产衣原体的增殖。

实施例2

鸡胚试验

1.流产衣原体的培养

在孵化箱内温度37.5℃、湿度60％，并确保有充足的新鲜空气流通的条件下孵育鸡胚。鸡胚接种的前一天，暗室照蛋观察弃无精蛋和死胚，并划出活鸡胚的正常气室区。然后在生物安全柜将流产衣原体 GN-6标准菌株，使用组织研磨器，添加适量石英砂将鸡胚卵黄囊膜彻底研磨破碎，加入50mL含卡那霉素(50μg/mL)和链霉素(100 μg/mL)的灭菌生理盐水稀释，将稀释液4℃放置4h，再以2000rpm 离心30min，无菌取上清。7日龄SPF鸡胚的接毒。用酒精、碘伏对鸡胚的气室区消毒并打孔，用5mL无菌注射器吸取组织悬液，从打通的小孔垂直进针2cm，每个鸡胚注射0.4mL悬液，然后用石蜡封孔，放置于孵化机内继续孵育，接种时间越短越好。将接种3天后观察。

2.抗生素倍比稀释

(1)感染液准备

将2枚流产衣原体GN-6种毒(ELD₅₀＝6.812×10⁷/mL)鸡胚卵黄囊膜用研钵研磨，用生理盐水稀释至100mL，添加100μL的卡那霉素 (50mg/mL)和100μL的链霉素(100mg/mL)，2000rpm离心20min，弃掉沉淀，混匀上清，4℃放置备用。将衣原体悬液分为19管，每管5 mL(其中第1管为10mL)。

(2)抗生素倍比稀释

在第1管衣原体悬液中加入10μL的泰妙菌素或四环素(2048 mg/mL)，混匀，配制为浓度2048μg/mL的泰妙菌素溶液或四环素溶液，取5mL第1管液体与第2管中5mL悬液混匀，取5mL第2管液体与第3管中5mL悬液混匀，依次稀释至18管(即浓度为0.03μg/mL)。

(3)鸡胚药敏试验

阳性对照(只含衣原体，ELD₅₀＝2.72×10⁵)，阴性对照(生理盐水)，实验组为泰妙菌素溶液和四环素溶液各梯度稀释后的混悬液，每个浓度分别接种10枚鸡蛋，每个鸡胚接种0.4mL溶液，弃掉3天内死亡的鸡胚，记录第3天到第10天死亡数目。

结果见表2。在鸡胚水平上，泰妙菌素和四环素的MIC₁₀₀的浓度均为256μg/mL。泰妙菌素的MIC₅₀的浓度为128μg/mL，泰妙菌素的 MIC₅₀的浓度为16μg/mL。

表2鸡胚药敏试验结果

注：MIC₅₀是指能抑制鸡胚中50％以上的衣原体生长，MIC₁₀₀是指能抑制鸡胚中100％的衣原体生长。

结果见表3和图3。

表3泰妙菌素在鸡胚上的药物敏感试验

表3为鸡胚第3～9天死亡数结果。鸡胚的药物抑菌试验结果显示，泰妙菌素浓度为64μg/mL时，鸡胚在第3～9天的死亡率为50％(3/8)，泰妙菌素浓度为128μg/mL时，鸡胚在第3～9天的死亡率为11.1％ (1/9)，泰妙菌素浓度为256μg/mL时，鸡胚在第3～9天的死亡率为 0％(0/7)。这表明泰妙菌素浓度为100μg/mL以上时可大大降低鸡胚的死亡率，即减少流产的数量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.具有式I所示结构的泰妙菌素在制备流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中的应用；

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，在所述流产衣原体抑制剂或抑制流产衣原体的药物中泰妙菌素的浓度不低于100μg/mL。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述泰妙菌素的浓度包括128～256μg/mL。

4.一种抑制流产衣原体生长的药物组合物，其特征在于，包括具有式I所示结构的泰妙菌素和四环素；

5.根据权利要求4所述药物组合物，其特征在于，所述泰妙菌素和四环素的质量比为1～10:1～10。

6.根据权利要求4或5所述药物组合物，其特征在于，所述泰妙菌素和四环素的质量比为(2～4)：(1～3)。

7.权利要求4～6任意一项所述药物组合物在制备预防人、禽、畜流产的药物中的应用。

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