CN113296253B - 多光片光场荧光显微成像装置 - Google Patents
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Abstract
本申请提出一种多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：包括多光片荧光激发模块及光场图像采集模块，多光片荧光激发模块包括平行光源、声光偏转器及激发物镜，光场图像采集模块包括采集物镜、微透镜阵列及采集相机，本申请的多光片光场荧光显微成像装置，利用多光片荧光激发模块在样本的深度方向上生成多个相互平行的光片，以在同一时间激发出样本不同深度层的荧光，且每层光片保持了光片荧光显微技术的高轴向分辨率，同时，配合光场图像采集模块的较大轴向景深范围，实现在同一时间内对样本不同深度层的荧光进行成像，解决了光片荧光显微系统同一时间只能对样本的单层进行成像的限制，大幅提升了体成像速度。
Description
技术领域
本申请涉及光学仪器技术领域，尤其涉及一种多光片光场荧光显微成像装置。
背景技术
光片荧光显微技术采用光片，即平面形状的薄光束，照亮样本的一层，同时通过传统显微镜对照亮的样本层进行成像。
但由于传统显微镜的轴向景深范围较小，且同一时刻只能对一个平面的图像进行采集，如果进行体成像需要多次进行的轴向扫描，体成像速度受到限制。
光场显微技术同时采集样本多个视角下的图像，一般采用微透镜阵列实现，结合光场反卷积方法，能够通过一张图像求解三维体图像，具有较大的轴向景深范围，但是轴向分辨率较低。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本申请的目的在于提出一种多光片光场荧光显微成像装置。
为达到上述目的，本申请提出的多光片光场荧光显微成像装置，包括多光片荧光激发模块及光场图像采集模块，所述多光片荧光激发模块包括平行光源、声光偏转器及激发物镜，所述声光偏转器位于所述平行光源的输出端与所述激发物镜的输入端之间，且其将平行光束离散成多条不同角度的角度光束，所述激发物镜的输出端方向与样本的深度方向垂直，且其将多条所述角度光束在所述样本的深度方向上同时生成多个相互平行的光片，所述光片使所述样本上的对应深度层发出荧光，所述光场图像采集模块包括采集物镜、微透镜阵列、采集相机及滤光片，所述采集物镜位于所述激发物镜的输出端上，且其输入端方向与所述样本的深度方向平行，其采集所述样本上发出的不同视角的荧光，所述微透镜阵列位于所述采集物镜的输出端与所述采集相机的输入端之间，且其将不同视角的荧光分别聚焦在采集相机的不同像素上，以形成光场图像,多个所述光场图像经光场反卷积后形成多层二位图像，所述多层二位图像组合后形成三维体图像，其中，所述滤光片位于所述采集物镜的输出端与所述微透镜阵列的输入端之间，所述滤光片与所述荧光的波长相适配。
本申请的多光片光场荧光显微成像装置，利用多光片荧光激发模块在样本的深度方向上生成多个相互平行的光片，以在同一时间激发出样本不同深度层的荧光，且每层光片保持了光片荧光显微技术的高轴向分辨率，同时，配合光场图像采集模块的较大轴向景深范围，实现在同一时间内对样本不同深度层的荧光进行成像，解决了光片荧光显微系统同一时间只能对样本的单层进行成像的限制，大幅提升了体成像速度。
所述平行光源的输出端方向与所述样本的深度方向平行。
所述多光片荧光激发模块还包括振镜，所述振镜位于所述声光偏转器与所述激发物镜之间，且其使所述角度光束偏转到所述激发物镜的输入端方向上。
所述多光片荧光激发模块还包括第一光学4F系统及第二光学4F系统，所述第一光学4F系统位于所述声光偏转器与所述振镜之间，且其使所述声光偏转器与所述振镜之间达成光学共轭关系，所述第二光学4F系统位于所述激发物镜与所述振镜之间，且其使所述激发物镜与所述振镜之间达成光学共轭关系。
所述第一光学4F系统包括第一透镜及第二透镜，所述第一透镜及所述第二透镜依次位于所述声光偏转器与所述振镜之间，且所述第一透镜与所述第二透镜之间同轴共焦。
所述第二光学4F系统包括第三透镜及第四透镜，所述第三透镜及所述第四透镜依次位于所述激发物镜与所述振镜之间，且所述第三透镜与所述第四透镜之间同轴共焦。
所述光场图像采集模块还包括筒透镜，所述筒透镜位于所述采集物镜的输出端与所述微透镜阵列的输入端之间，且其与所述采集物镜相适配。
所述光场图像采集模块还包括滤光片，所述滤光片位于所述采集物镜的输出端与所述筒透镜的输入端之间，所述滤光片与所述荧光的波长相适配。
所述样本位于所述激发物镜聚焦位置与所述采集物镜景深范围的重叠区域内。
所述光片之间的距离大于光场图像采集模块的轴向分辨率。
本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
本申请上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本申请一实施例提出的多光片光场荧光显微成像装置的结构示意图；
图2是本申请一实施例提出的多光片光场荧光显微成像装置中光片处的结构示意图；
图3是本申请一实施例提出的多光片光场荧光显微成像装置的工作流程图。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。相反，本申请的实施例包括落入所附加权利要求书的精神和内涵范围内的所有变化、修改和等同物。
图1是本申请一实施例提出的多光片光场荧光显微成像装置的结构示意图。
参见图1，多光片光场荧光显微成像装置，包括多光片荧光激发模块1及光场图像采集模块2。
多光片荧光激发模块1用于激发出样本3不同深度层的荧光，其包括平行光源、声光偏转器11、第一光学4F系统12、振镜13、第二光学4F系统14及激发物镜15。
平行光源输出平行光束，以作为多个光片16的激发源，平行光源的输出端方向与样本3的深度方向平行，以便于装置内各部件的布局。
声光偏转器11简称AOD，是根据声光偏转原理制成的器件，其能够根据声光相互作用机制，改变激光的角度，声光偏转器11位于平行光源的输出端与激发物镜15的输入端之间，且其将平行光束离散成多条不同角度的角度光束，声光偏转器11使平行光源发射出的平行光束能够转换为角度光束，以在样本3的深度方向上能够生成多个相互平行的光片16，且每个角度的角度光束分别对应样本3内不同深度位置的光片16。
振镜13位于声光偏转器11与激发物镜15之间，且其使角度光束偏转到激发物镜15的输入端方向上。
可以理解的是，振镜13在与声光偏转器11相互垂直角度上快速偏转，将角度光束的能量均摊到与声光偏转器11相互垂直的方向上，使角度光束的方向与样本3的深度方向垂直，以形成能够照亮样本3相应深度层的光片16。
第一光学4F系统12位于声光偏转器11与振镜13之间，且其使声光偏转器11与振镜13之间达成光学共轭关系，其中，第一光学4F系统12包括第一透镜121及第二透镜122，第一透镜121及第二透镜122依次位于声光偏转器11与振镜13之间，且第一透镜121与第二透镜122之间同轴共焦，通过第一透镜121及第二透镜122构成的第一光学4F系统12，以对角度光束进行整形。
第二光学4F系统14位于激发物镜15与振镜13之间，且其使激发物镜15与振镜13之间达成光学共轭关系，其中，第二光学4F系统14包括第三透镜141及第四透镜142，第三透镜141及第四透镜142依次位于激发物镜15与振镜13之间，且第三透镜141与第四透镜142之间同轴共焦，通过第三透镜141及第四透镜142构成的第二光学4F系统14，以对振镜13偏转出的角度光束进行整形。
激发物镜15的输出端方向与样本3的深度方向垂直，如图2所示，激发物镜15将多条角度光束在样本3的深度方向上同时生成多个相互平行的光片16，光片16使样本3上的对应深度层发出荧光，从而实现样本3在同一时间内发出不同视角的荧光。
光场图像采集模块2采集样本3发出的不同视角的荧光并进行成像，其包括采集物镜21、滤光片22、筒透镜23、微透镜阵列24及采集相机25。
采集物镜21位于激发物镜15的输出端上，且其输入端方向与样本3的深度方向平行，样本3位于激发物镜15聚焦位置与采集物镜21景深范围的重叠区域内，其在同一时间内发出不同视角的荧光被采集物镜21所采集，其中，激发物镜15的聚焦位置是指以其焦点为中心的范围，该范围能够容纳样本3，且保证角度光束在激发物镜15的激发下能够在样本3的深度方向上生成多个相互平行的光片。
且光片16之间的距离大于光场图像采集模块2的轴向分辨率，以保证精确成像，其中，光片16之间的距离是指相邻光片15之间的距离。
滤光片22、筒透镜23、微透镜阵列24经由采集物镜21朝向采集相机25依次排列。
滤光片22位于采集物镜21的输出端与筒透镜23的输入端之间，滤光片22与荧光的波长相适配,其仅能使样本3上发出的荧光通过，以保证精确成像。
筒透镜23位于滤光片22的输出端与微透镜阵列24的输入端之间，且其与采集物镜21相适配，筒透镜23能够校正采集物镜21的像差，扩大采集物镜21的视域。
微透镜阵列24位于筒透镜23的焦面上，采集相机25位于微透镜阵列24的焦面上，微透镜阵列24将不同视角的荧光分别聚焦在采集相机25的不同像素上，以形成光场图像。
如图3所示，本申请在使用时，需准备和调整样本3，即应准备合适的荧光标记样本3，并将其放置在激发物镜15与采集物镜21之间的位置，样本3的具体放置位置应在激发物镜15聚焦位置与采集物镜21景深范围的重叠区域内。
可以理解的是，在确定多个光片16到采集物镜21之间的距离时，多个光片16距离采集物镜21的距离需在采集物镜21的景深范围内。
同时，多个光片16的位置需在激发物镜15的视野范围内，相邻光片16之间的距离需大于光场图像采集模块2的轴向分辨率。
多光片荧光激发模块1在样本3上生成多个光片16后，光场图像采集模块2即能获得光场图像，并将获得的光场图像保存，多个光片16的位置需进行多次轴向位移，以不断更换扫描位置，从而最终获得不同扫描位置的光场图像，即所有轴向位置的图像，同时，应保证样本3的所有位置都被光片16所照明激发且均具有较高的轴向分辨率。
若光片16的数量为N，则本申请与普通光片显微系统的扫描速度相比，提升了N倍。
在完成图像采集后，对不同扫描位置的光场图像进行光场反卷积，方法包括但不限于Richardson-Lucy、phasespace方法等，以获得不同扫描位置的、与多个光片16位置对应的多个轴向位置的图像，即多层二位图像。
将不同扫描位置的图像进行组合，得到具有高轴向分辨率的三维体图像。
需要说明的是，在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。此外，在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本申请的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本申请的实施例所属技术领域的技术人员所理解。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：包括多光片荧光激发模块及光场图像采集模块；
所述多光片荧光激发模块包括平行光源、声光偏转器及激发物镜，所述声光偏转器位于所述平行光源的输出端与所述激发物镜的输入端之间，且其将平行光束离散成多条不同角度的角度光束，所述激发物镜的输出端方向与样本的深度方向垂直，且其将多条所述角度光束在所述样本的深度方向上同时生成多个相互平行的光片，所述光片使所述样本上的对应深度层发出荧光；
所述光场图像采集模块包括采集物镜、微透镜阵列、采集相机及滤光片，所述采集物镜位于所述激发物镜的输出端上，且其输入端方向与所述样本的深度方向平行，其采集所述样本上发出的不同视角的荧光，所述微透镜阵列位于所述采集物镜的输出端与所述采集相机的输入端之间，且其将不同视角的荧光分别聚焦在采集相机的不同像素上，以形成光场图像，多个所述光场图像经光场反卷积后形成多层二维图像，所述多层二维图像组合后形成三维体图像，其中，所述滤光片位于所述采集物镜的输出端与所述微透镜阵列的输入端之间，所述滤光片与所述荧光的波长相适配。
2.根据权利要求1所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述平行光源的输出端方向与所述样本的深度方向平行。
3.根据权利要求2所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述多光片荧光激发模块还包括振镜，所述振镜位于所述声光偏转器与所述激发物镜之间，且其使所述角度光束偏转到所述激发物镜的输入端方向上。
4.根据权利要求3所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述多光片荧光激发模块还包括第一光学4F系统及第二光学4F系统，所述第一光学4F系统位于所述声光偏转器与所述振镜之间，且其使所述声光偏转器与所述振镜之间达成光学共轭关系，所述第二光学4F系统位于所述激发物镜与所述振镜之间，且其使所述激发物镜与所述振镜之间达成光学共轭关系。
5.根据权利要求4所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述第一光学4F系统包括第一透镜及第二透镜，所述第一透镜及所述第二透镜依次位于所述声光偏转器与所述振镜之间，且所述第一透镜与所述第二透镜之间同轴共焦。
6.根据权利要求4或5所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述第二光学4F系统包括第三透镜及第四透镜，所述第三透镜及所述第四透镜依次位于所述激发物镜与所述振镜之间，且所述第三透镜与所述第四透镜之间同轴共焦。
7.根据权利要求1或4所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述光场图像采集模块还包括筒透镜，所述筒透镜位于所述采集物镜的输出端与所述微透镜阵列的输入端之间，且其与所述采集物镜相适配。
8.根据权利要求7所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述滤光片位于所述采集物镜的输出端与所述筒透镜的输入端之间。
9.根据权利要求1所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述样本位于所述激发物镜聚焦位置与所述采集物镜景深范围的重叠区域内。
10.根据权利要求1所述的多光片光场荧光显微成像装置，其特征在于：所述光片之间的距离大于光场图像采集模块的轴向分辨率。
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