CN113295869A - 一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于超灵敏磁弛豫时间免疫传感器的免疫分析方法，该方法以氨基化纳米磁颗粒作为磁信号探针，以聚多巴胺作为信号放大系统，与特异性免疫反应相结合，并基于辣根过氧化物酶催化盐酸多巴胺聚合形成聚多巴胺，成功实现了对检测对象的超灵敏检测，解决了传统磁弛豫时间传感器检测痕量小分子物质灵敏度低的难题，可用于食品中痕量危害因子(真菌毒素、抗生素等)、生物标志物等的快速、超灵敏检测。

Description

一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法
技术领域
本发明属于检测分析领域，涉及一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法。
背景技术
现有的定量检测方法主要包括理化分析法和生物化学法。理化分析法样品前处理比较复杂，检测成本高，且需要专业技术人员操作仪器，不适合现场快速检测。生物化学法可分为微生物分析法和免疫分析法，其中微生物分析法在抗生素残留检测中经常使用，但是易受较多因素影响，不能准确定量。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光免疫分析法和胶体金免疫层析法等。ELISA操作相对简单、特异性好、检测成本低，但其灵敏度较低，不适用于痕量危害物质的检测。化学发光免疫分析法灵敏度高、检测时间短、安全性高，但是发光标记物发光时间短、稳定性较差、检测精度不高。胶体金免疫层析试纸条具有简单、快速、成本低、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比ELISA低且易受操作者影响，无法满足痕量危害物质检测的需要。因此，急需研发一种可检测痕量危害物质的检测方法。
磁弛豫时间传感器是一种典型的生物传感器，该传感器的基本原理是：以偶联有抗原或抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针，通过抗原-抗体的特异性亲和反应，使体系中的磁颗粒状态或数量发生改变，进而引起周围水分子质子的横向弛豫时间(T2)发生显著改变，由于T2信号改变的程度与目标分子含量相关，通过T2的改变量可间接得到目标分子的含量。目前，磁弛豫时间传感器由于具有前处理简单、快速、灵敏、无损、适于现场检测等优点，在食品安全和体外诊断领域得到了应用，但磁弛豫时间传感器最大的缺点是缺乏有效的信号放大系统，灵敏度偏低，难以检测复杂样品中痕量危害物质。
有效的信号放大系统是提高传统磁弛豫时间传感器的关键。聚多巴胺是一种类似贻贝黏附蛋白结构的黑色素，其由盐酸多巴胺单体聚合而成，具有良好的稳定性和生物相容性，其丰富的活性基团(邻苯二酚，胺和亚胺)可以与多种生物大分子结合。因此，本发明拟构建一种基于聚多巴胺信号放大的超灵敏磁弛豫时间免疫传感器，将其与免疫分析方法结合后应用于痕量物质的检测。
辣根过氧化物酶(HRP)是免疫分析中常用的标记酶之一，具有很高的催化活性。我们使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体进行免疫反应，以催化形成聚多巴胺。在碱性条件下，聚多巴胺独特的结构和活性基团可以通过迈克尔加成反应或席夫碱反应，与含有氨基的物质结合。我们使用氨基化纳米磁颗粒(NH2-MNP30)与聚多巴胺反应，聚多巴胺会使氨基化纳米磁颗粒由分散状态变为聚集状态或通过吸附作用，引起上清液中氨基化纳米磁颗粒的数量发生改变，导致其周围水分子中氢质子的运动状态亦随之改变，产生不同的横向弛豫时间。因此，通过免疫标记酶-辣根过氧化物酶可以将聚多巴胺和磁弛豫时间传感器有机结合起来，对传统磁弛豫时间传感器的读出信号进行放大，从而提高其检测灵敏度。相比于传统的磁弛豫时间传感器，基于聚多巴胺的磁弛豫时间免疫传感器灵敏度的提高主要得益于两个方面：(1)辣根过氧化物酶的高效催化作用：辣根过氧化物酶可以加速多巴胺的聚合，将其聚合速率提高约100倍，有利于提高方法的灵敏度；(2)聚多巴胺与纳米磁颗粒的结合能力更强，因此导致磁颗粒状态改变或者数量改变的效果更好，有利于提高方法的灵敏性：传统的磁弛豫免疫传感器是基于抗原-抗体作用导致的磁颗粒聚集引起的磁信号的改变，磁信号改变有限，而聚多巴胺可通过席夫碱反应或迈克尔加成反应与氨基化纳米磁颗粒结合，两者的结合是由共价键维持的，结合效率高，不易重新断开。
发明内容
本发明的目的是针对传统的磁弛豫时间传感器缺乏高效的信号放大系统，无法满足对痕量物质检测的需要，提供一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，该方法通过聚多巴胺实现传感器的磁弛豫时间信号放大，实现了在pg水平的痕量分析检测。
为达到此目的，本发明使用了以下技术手段：
一种基于超灵敏磁弛豫时间免疫传感器的免疫分析方法，包括以下步骤：
1)在酶标板上包被待测目标物的完全抗原或捕获抗体；
2)洗涤酶标板后使用封闭液对酶标板进行封闭；
3)洗涤酶标板后加入待测物溶液及待测目标物的单克隆抗体溶液，进行竞争免疫反应，或加入待测物溶液及待测目标物的检测抗体溶液，进行夹心免疫反应；
4)洗涤酶标板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温避光反应；
5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺溶液，盐酸多巴胺在辣根过氧化物酶催化下生成聚多巴胺；
6)将反应后的聚多巴胺溶液与氨基化纳米磁颗粒溶液混合，聚多巴胺与氨基化纳米磁颗粒结合，引起纳米磁颗粒的状态改变或数量改变，从而引起其磁弛豫时间改变，采用低场核磁共振仪测定横向弛豫时间的改变量从而计算待测物溶液中的目标物含量。
本发明的检测原理如下：以竞争免疫反应为例，酶标板上包被的完全抗原和待测物溶液中的目标物竞争性地与单克隆抗体反应，待测物溶液中的目标物含量越高，结合到酶标板上的单克隆抗体越少，反之，待测物溶液中的目标物含量越少，结合到酶标板上的单克隆抗体越多，加入酶标二抗后，羊抗鼠IgG与酶标板上的单克隆抗体特异性结合，标记物辣根过氧化物酶的含量与酶标板上的单克隆抗体含量呈正相关，与待测物溶液中的目标物含量呈负相关。辣根过氧化物酶催化盐酸多巴胺生成聚多巴胺，聚多巴胺使氨基化纳米磁颗粒由分散状态变为聚集状态，从而使横向弛豫时间(T2)发生改变，T2值与辣根过氧化物酶的含量呈负相关，与待测物溶液中的目标物含量呈正相关。由于该反应为竞争免疫反应，当溶液中不含目标物时，其结合的酶标二抗最多，纳米磁颗粒聚集程度亦越大，此时对应的T2值最小；当待测物溶液中的目标物含量逐渐增多，其结合的酶标二抗逐渐减少，纳米磁颗粒聚集程度减弱，其对应的T2值逐渐增大，故T2值的改变量(ΔT2＝T2样品-T2空白样品)与待测物溶液中的目标物含量呈正相关。因此，可通过检测ΔT2值得出待测物溶液中的目标物含量。
夹心免疫反应的检测原理与上述相同，酶标板上包被的捕获抗体和待测物溶液中的目标物与检测抗体反应生成夹心复合物，待测物溶液中的目标物含量越高，结合到酶标板上的检测抗体越多，反之，待测物溶液中的目标物含量越少，结合到酶标板上的检测抗体越少，加入酶标二抗后，羊抗鼠IgG与酶标板上的检测抗体特异性结合，标记物辣根过氧化物酶的含量与酶标板上的检测抗体含量呈正相关，与待测物溶液中的目标物含量呈正相关。辣根过氧化物酶催化盐酸多巴胺生成聚多巴胺，聚多巴胺使氨基化纳米磁颗粒由分散状态变为聚集状态，从而使横向弛豫时间(T2)发生改变，T2值与辣根过氧化物酶的含量呈负相关，与待测物溶液中的目标物含量呈负相关。由于该反应为夹心免疫反应，当溶液中不含目标物时，其结合的酶标二抗几乎没有，纳米磁颗粒聚集程度最小，此时对应的T2值最大；当待测物溶液中的目标物含量逐渐增多，其结合的酶标二抗逐渐增多，纳米磁颗粒聚集程度逐渐增大，其对应的T2值逐渐减小，故T2值的改变量(ΔT2＝T2空白样品-T2样品)与待测物溶液中的目标物含量呈正相关。因此，可通过检测ΔT2值得出待测物溶液中的目标物含量。
优选地，所述单克隆抗体溶液或检测抗体溶液的浓度为0.1-10μg/mL，最佳为1μg/mL。
优选地，所述盐酸多巴胺溶液的浓度为10-50mM，最佳为25mM。
优选地，所述氨基化纳米磁颗粒溶液的浓度为1-5μg/mL，最佳为2.5μg/mL。
优选地，步骤5)中的催化反应时间是5-30min，温度是35-40℃，最佳的反应时间是15min。
优选地，所述二抗是羊抗鼠IgG，其稀释倍数为1:1000。
优选地，所述聚多巴胺溶液与氨基化纳米磁颗粒溶液的体积比为1：1。
优选地，所述待测目标物为小分子物质和大分子物质，当为大分子物质时，所述待测目标物包括炎症标志物降钙素原，当为小分子物质时，所述待测目标物包括黄曲霉毒素B1、氯霉素。
本发明的有益效果是：
(1)本发明以氨基化纳米磁颗粒作为磁信号探针，以聚多巴胺作为信号放大系统，与特异性免疫反应相结合，成功实现了对检测对象的超灵敏检测。与传统的磁弛豫时间免疫传感器相比，本发明的检测灵敏度提高了一个数量级，达到了pg/mL水平；与传统的ELISA方法相比，本发明也具有更高的灵敏度和更宽的线性范围。
(2)本发明不仅能针对大分子物质如降钙素原进行检测，还能对小分子物质如黄曲霉毒素、氯霉素等进行检测，具有应用范围广的特点。
(3)本发明仅需在常规的免疫反应基础上，通过加入盐酸多巴胺和氨基化纳米磁颗粒即可实现，不仅工艺简单，反应可控，而且试剂和材料容易获取，检测中不依赖昂贵、精密的仪器设备，仅需一台低场核磁共振仪即可，方法具有稳定性好、操作简单等优点。
附图说明
图1示出了未反应的NH2-MNP30的TEM图谱；
图2示出了聚多巴胺与NH2-MNP30发生反应后的TEM图谱；
图3示出了聚多巴胺与NH2-MNP30发生反应后的粒度分布图；
图4示出了聚多巴胺与NH2-MNP30发生反应后的电位变化图；
图5示出了磁弛豫时间免疫传感器T2值的改变量与HRP浓度之间的响应关系；
图6示出了对磁弛豫时间免疫传感器的NH2-MNP30浓度优化结果；
图7示出了对磁弛豫时间免疫传感器的盐酸多巴胺浓度优化结果；
图8示出了对磁弛豫时间免疫传感器的盐酸多巴胺反应时间优化结果；
图9示出了对磁弛豫时间免疫传感器的黄曲霉毒素B1单克隆抗体浓度优化结果；
图10示出了磁弛豫时间免疫传感器检测黄曲霉毒素B1的标准曲线和线性范围；
图11示出了磁弛豫时间免疫传感器检测不同黄曲霉毒素的T2值改变量；
图12示出了传统磁弛豫时间传感器检测黄曲霉毒素B1的标准曲线和线性范围；
图13示出了ELISA方法检测黄曲霉毒素B1的标准曲线和线性范围；
图14示出了磁弛豫时间免疫传感器检测氯霉素的标准曲线和线性范围；
图15示出了传统磁弛豫时间传感器检测氯霉素的标准曲线和线性范围；
图16示出了磁弛豫时间免疫传感器检测降钙素原的标准曲线和线性范围。
图17示出了传统磁弛豫时间传感器检测降钙素原的标准曲线和线性范围。
具体实施方式
下面以黄曲霉毒素B1为例通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本实施例中使用的试剂、材料、溶液和仪器如下：
试剂和材料：辣根过氧化物酶(HRP)来自Sigma-Aldrich公司(USA)；30nm(5mg/mL)氨基化磁性纳米Fe3O4颗粒(NH2-MNP30)来自Ocean NanoTech(USA)；氯霉素单克隆抗体(6.9mg/mL)、氯霉素完全抗原(6mg/mL)、黄曲霉毒素B1单克隆抗体(2.5mg/mL)、黄曲霉毒素B1完全抗原(1.5mg/mL)购自上海羽朵生物科技有限公司；降钙素原捕获抗体、降钙素原检测抗体购自abcam公司；HRP标记的羊抗鼠IgG来自Jackson ImmunoResearch；牛血清白蛋白购自Sigma-Aldrich公司(中国，上海)。
溶液配制：
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀；
Tris-HCl缓冲液：先配置同样浓度的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液和HCl溶液，将两者混匀后加水稀释；
洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液；
黄曲霉毒素B1和氯霉素单克隆抗体溶液、检测抗体溶液、氨基化纳米磁颗粒溶液、降钙素原捕获抗体溶液、降钙素原检测抗体溶液均使用PBS缓冲液配置，然后于4℃保存。
盐酸多巴胺溶液：用10mM，pH＝8.5Tris-HCl缓冲液(浓度为1M的过氧化氢含量：2％)配置不同浓度的盐酸多巴胺溶液，使用前配置，不可久放。
仪器：场发射透射电子显微镜(JEM-2100F，日本)用于表征磁珠；激光粒度分析仪(马尔文仪器有限公司，英国)用于测量磁珠的粒度分布和电位变化；0.47T小型低场核磁共振仪购自上海纽迈电子科技有限公司，用于测量横向弛豫时间(T2)。
实施例1基于聚多巴胺的纳米磁颗粒状态变化
将辣根过氧化物酶稀释至不同浓度(300U/L、3000U/L)，在100μL不同浓度的辣根过氧化物酶溶液中分别加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液，混合溶液在37℃下反应15分钟，可观察到混合溶液明显发生颜色变化，表明有聚多巴胺的生成，且聚多巴胺随HRP酶浓度的增加而增多。
在1.5mL EP管中加入100μL 3000U/L的辣根过氧化物酶溶液和100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液，混合溶液在37℃下反应15分钟，然后向混合溶液中加入100μL 2.5μg/mL NH2-MNP30，在37℃下反应10分钟后，对反应后的混合溶液进行TEM、粒径和电位表征，实验结果如图1-4所示，表明聚多巴胺可以引起氨基化纳米磁颗粒状态发生改变，即由分散状态变为聚集状态。
将辣根过氧化物酶稀释至不同浓度(0.3，3，10，30，50，100，300，1500U/L)，在100μL不同浓度的辣根过氧化物酶溶液中分别加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液，混合溶液在37℃下反应15分钟，然后向混合溶液中加入100μL 2.5μg/mL NH2-MNP30，在37℃下反应10分钟，反应结束后取混合溶液测量T2值。实验结果如图5所示，以不含HRP酶时的T2值为参照，T2值的变化量随着辣根过氧化物酶的增加而增大，且T2值的变化量与HRP浓度之间存在良好的响应，表明催化反应和聚合反应都存在一定的量效关系。
实施例2对磁弛豫时间免疫传感器反应条件的优化
在100μL辣根过氧化物酶溶液(使用PBS缓冲液配制)中加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液(使用Tris-HCl缓冲液配制)，混合溶液在37℃下反应15分钟，然后向混合溶液中加入100μL不同浓度的NH2-MNP30(1.25μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，使用PBS缓冲液配制)在37℃下反应10分钟，反应结束后取混合溶液测量T2值以优化NH2-MNP30的浓度。结果如图6所示，NH2-MNP30浓度为2.5μg/mL时磁弛豫时间免疫传感器具有最优的响应效果。
在100μL辣根过氧化物酶溶液中分别加入100μL不同浓度(10,20,50mM)的盐酸多巴胺溶液，混合溶液在37℃下反应15分钟，反应结束后，向混合溶液中加入100μL2.5μg/mLNH2-MNP30，在37℃下反应10分钟，反应结束后取混合溶液测量T2值以优化盐酸多巴胺的浓度。结果如图7所示，盐酸多巴胺浓度为25mM时磁弛豫时间免疫传感器具有最优的响应效果。
在100μL辣根过氧化物酶溶液中分别加入100μL 25mM)的盐酸多巴胺溶液，混合溶液在37℃下反应不同时间(5min，10min，15min，20min，25min)后，向混合溶液中加入100μL2.5μg/mL NH2-MNP30，在37℃下反应10分钟，反应结束后取混合溶液测量T2值以优化盐酸多巴胺的反应时间。结果如图8所示，催化反应时间为15分钟时磁弛豫时间免疫传感器具有最优的响应效果。
在酶标板上包被黄曲霉毒素B1完全抗原并进行封闭，然后加入50μL不同浓度梯度AFB1溶液和50μL不同浓度的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体(0.1μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL)，室温下避光反应30分钟，洗涤三次后加入HRP-羊抗鼠IgG在室温下避光反应30分钟，然后加入TMB在室温下避光反应15分钟，加入硫酸终止反应后测量450nm处的光吸收值以优化黄曲霉毒素B1的单克隆抗体浓度。结果如图9所示，黄曲霉毒素B1的单克隆抗体浓度为1μg/mL时磁弛豫时间免疫传感器具有最优的响应效果。
从以上结果可以得出，黄曲霉毒素B1的单克隆抗体浓度为1μg/mL、盐酸多巴胺浓度为25mM，催化反应时间为15分钟和NH2-MNP30浓度为2.5μg/mL时磁弛豫时间免疫传感器具有最优的响应效果。
实施例3磁弛豫时间免疫传感器对黄曲霉毒素B1的检测
(1)包被：96孔酶标板中包被100μL 1μg/mL的黄曲霉毒素B1完全抗原，4℃过夜，采用PBST洗涤。
(2)封闭：用260μL 5％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩去，用吸水纸拍干后加入洗涤液250μL/孔，洗涤三次，每次3min(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。
(3)免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL不同浓度梯度的黄曲霉毒素B1溶液，然后加入50μL黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。
(4)加酶标二抗：反应之后洗涤3次，向孔板中加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min，取出重复洗板5次。
(5)催化反应：洗涤5次后，继续向孔板中加入100μL盐酸多巴胺溶液(25mM)，37℃反应15分钟。
(6)加入传感器并进行磁弛豫时间检测：在90μL NH2-MNP30(2.5μg/mL)溶液中加入90μL反应后的盐酸多巴胺溶液，37℃反应10分钟。反应结束后，取混合溶液测定T2值。
实验结果如图10所示，以不含黄曲霉毒素B1时的T2值为参照，则T2值的改变量随着黄曲霉毒素B1溶液的浓度增加而逐渐增大，并且该方法对黄曲霉毒素B1的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
实施例4磁弛豫时间免疫传感器对检测黄曲霉毒素B1的特异性
步骤(3)中，洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL黄曲霉毒素B1(30pg/mL)、50μL黄曲霉毒素B2(30pg/mL)、50μL黄曲霉毒素G1(30pg/mL)、50μL黄曲霉毒素G2(30pg/mL)，然后加入50μL黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。
其它检测步骤均与实施例3相同。
实验结果如图11所示，黄曲霉毒素B1对应的T2值的改变量差异显著，其余黄曲霉毒素对应的T2值的改变量很小，表明该方法对黄曲霉毒素B1的检测具有良好的特异性。
实施例5磁弛豫时间免疫传感器检测黄曲霉毒素B1的加标回收率
步骤(3)中，洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL加标动物饲料样品提取液，然后加入50μL黄曲霉毒素B1的单克隆抗体(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。
其它检测步骤均与实施例3相同。
实验结果如表1所示，动物饲料样品中不同黄曲霉毒素B1加标水平的加标回收率和变异系数表明该方法对黄曲霉毒素B1的检测具有良好的准确性和精密度。
表1动物饲料中不同黄曲霉毒素B1加标水平的加标回收率和变异系数
Figure BDA0003054196410000081
Figure BDA0003054196410000091
实施例6磁弛豫时间免疫传感器和ELISA方法检测黄曲霉毒素B1灵敏度的比较
(一)磁弛豫时间免疫传感器检测黄曲霉毒素B1
方法与实施例3相同。实验结果如图10所示。
(二)传统磁弛豫时间传感器检测黄曲霉毒素B1
(1)将30nm羧基磁颗粒表面分别偶联上黄曲霉毒素B1抗体和完全抗原。
(2)在离心管中分别加入50μL不同浓度梯度的(1,10,100,1000,10000ng/mL)黄曲霉毒素B1溶液、50μL MNP30-抗体溶液和50μL MNP30-完全抗原溶液，37℃反应30分钟。
(3)反应结束后测定反应液的T2值。实验结果如图12所示。
(三)ELISA方法检测黄曲霉毒素B1
步骤(1)、(2)、(3)、(4)与实施例3相同。
(5)显色：加入TMB显色液100μL/孔，置室温(25±2℃)避光环境中反应15min。
(6)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，在5min内读完数据，测定每孔OD值。实验结果如图13所示。
对比实验结果可以得出本发明的磁弛豫时间免疫传感器具有更高的灵敏度和更宽的线性范围。
实施例7磁弛豫时间免疫传感器对氯霉素的检测
(1)包被：96孔酶标板中包被100μL 1μg/mL的氯霉素完全抗原，4℃过夜，采用PBST洗涤。
(2)封闭：用260μL 5％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩去，用吸水纸拍干后加入洗涤液250μL/孔，洗涤三次，每次3min(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。
(3)免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL不同浓度梯度的氯霉素溶液，然后加入50μL氯霉素单克隆抗体溶液(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。
(4)加酶标二抗：反应之后洗涤3次，向孔板中加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min，取出重复洗板5次。
(5)催化反应：洗涤5次后，继续向孔板中加入100μL盐酸多巴胺溶液(25mM)，37℃反应15分钟。
(6)加入传感器并进行磁弛豫时间检测：在90μL NH2-MNP30(2.5μg/mL)溶液中加入90μL反应后的盐酸多巴胺溶液，37℃反应10分钟。反应结束后，取混合溶液测定T2值。
实验结果如图14所示。以不含氯霉素时的T2值为参照，T2值的改变量随着氯霉素的浓度增加而逐渐增大，并且与传统磁弛豫时间传感器(图15)相比，该方法对氯霉素类抗生素的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
实施例8磁弛豫时间免疫传感器对全血中降钙素原的检测
(1)包被：96孔酶标板中包被100μL 1μg/mL的降钙素原捕获抗体，4℃过夜，PBST洗涤。
(2)封闭：用260μL 5％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩去，用吸水纸拍干后加入洗涤液250μL/孔，洗涤三次，每次3min(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。
(3)免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL不同浓度梯度降钙素原溶液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。采用洗涤液洗涤孔板后，于对应的孔中再加入50μL降钙素原检测抗体(1μg/mL)，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min。
(4)加酶标二抗：反应之后洗涤3次，向孔板中加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应30min，取出重复洗板5次。
(5)催化反应：洗涤5次后，继续向孔板中加入100μL盐酸多巴胺溶液(25mM)，37℃反应15分钟。
(6)加入传感器并进行磁弛豫时间检测：在90μL NH2-MNP30(2.5μg/mL)溶液中加入90μL反应后的盐酸多巴胺溶液，37℃反应10分钟。反应结束后，取混合溶液测定T2值。
实验结果如图16所示。以不含降钙素原时的T2值为参照，则T2值的改变量随着降钙素原的浓度增加而逐渐增大，并且与传统磁弛豫时间传感器(图17)相比，该方法对降钙素原的检测具有很好的灵敏度和线性范围。

Claims (8)

1.一种基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被待测目标物的完全抗原或捕获抗体；
2)洗涤酶标板后使用封闭液对酶标板进行封闭；
3)洗涤酶标板后加入待测物溶液及待测目标物的单克隆抗体溶液，进行竞争免疫反应，或加入待测物溶液及待测目标物的检测抗体溶液，进行夹心免疫反应；
4)洗涤酶标板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温避光反应；
5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺溶液，盐酸多巴胺在辣根过氧化物酶催化下生成聚多巴胺；
6)将反应后的聚多巴胺溶液与氨基化纳米磁颗粒溶液混合，聚多巴胺与氨基化纳米磁颗粒结合，引起纳米磁颗粒的状态改变或数量改变，从而引起其磁弛豫时间改变，采用低场核磁共振仪测定横向弛豫时间的改变量从而计算待测物溶液中的目标物含量。
2.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述单克隆抗体溶液或检测抗体溶液的浓度为0.1-10μg/mL。
3.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述盐酸多巴胺溶液的浓度为10-50mM。
4.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述氨基化纳米磁颗粒溶液的浓度为1-5μg/mL。
5.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：步骤5)中的催化反应时间是5-30min，温度是35-40℃。
6.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述二抗是羊抗鼠IgG，其稀释倍数为1:1000。
7.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述聚多巴胺溶液与氨基化纳米磁颗粒溶液的体积比为1：1。
8.如权利要求1所述基于超灵敏磁弛豫时间传感器的免疫分析方法，其特征在于：所述待测目标物为小分子物质和大分子物质，当为大分子物质时，所述待测目标物包括炎症标志物降钙素原，当为小分子物质时，所述待测目标物包括黄曲霉毒素B1、氯霉素。
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