CN113292989A - 钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法 - Google Patents

钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的效果是公开了一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法。以硼粉末为前体，在钴离子存在下，采用超声辅助的液相剥离方法制备钴离子配位硼纳米片，加入谷胱甘肽GSH，对混合液进行溶剂热处理，制备新型的GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs。在乳酸氧化酶LOx存在下，乳酸LA被LOx酶催化氧化产生丙酮酸和过氧化氢H2O2，而H2O2的氧化作用使Co‑BQDs的荧光发生淬灭。通过拟合Co‑BQDs荧光发射峰强度与对应混合体系中LA浓度之间的线性关系，构建了基于Co‑BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于生物流体中乳酸的高特异性定量检测。

Description

钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物 探针的制备方法
技术领域
本发明属于金属离子配位硼量子点和乳酸荧光纳米生物探针的制备技术领域，具体涉及一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法，该制备的探针可用于生物流体中乳酸的高特异性定量检测。
背景技术
硼原子核外仅有三个电子，呈现严重的缺电子状态，硼元素sp2价电子易杂化，且配位数大，共价半径短，易与其它元素形成强而有方向的键。理论计算研究表明，二维硼烯的结构暴露于空气中是不稳定的，硼(B)易与氧气(O2)反应生成硼氧化物，硼烯的结构发生氧化和降解，进而影响其性能。密度泛函理论研究表明，B-O/B-O-B之间强共价键可引起硼烯的结构破坏和重构，而硼-金属离子之间的离子相互作用对硼烯的结构影响甚微。在硼烯的剥离过程中，过渡金属离子进入片层结构促进剥离，硼烯也可抑制过渡金属离子聚集。过渡金属离子(M)掺杂后与硼(B)形成“M-B”配位，有效避免了B-O/B-O-B键的形成，进而抑制了硼烯的结构氧化、重构、破坏和降解，确保获得硼烯的优异性能及其稳定性。
近年来有关二维硼烯或硼纳米片的实验研究陆续开展，在储能、传感、电催化、生物医学等重要领域展现出应用前景。经文献检索，有关零-维硼量子点的实验制备和应用研究报道较少，主要涉及硼量子点的光声成像介导光热治疗(T.Guo,Q.Tang,Y.Guo,H.Qiu,J.Dai,C.Xing,S.Zhuang,G.Huang,Boron quantum dots for photo acoustic imaging-guided photothermal therapy,ACS Appl.Mater.Interfaces,2021,13,306.)，边缘缺陷引发光热效应(L.Wang,S.M.Xu,S.Guan,X.Qu,G.I.N.Waterhouse,S.He,S.Zhou,Highlyefficient photothermal heating via distorted edge-defects inboron quantumdots,J.Mater.Chem.B,2020,8,9881.)，晶体半导体特征研究(J.Hao,G.Tai,J.Zhou,R.Wang,C.Hou,W.Guo,Crystalline semiconductor boron quantum dots,ACSAppl.Mater.Interfaces,2020,12,17669.)等。目前，尚未有关于过渡金属钴离子(Co2+)掺杂液相剥离制备钴配位硼量子点(Co-BQDs)及其荧光纳米生物探针检测乳酸的国内外文献和专利报道。
乳酸(Lactic acid,LA)是体内糖酵解最终产物之一，血液中乳酸浓度升高与呼吸系统疾病、糖尿病酮血症等密切相关，脑脊液中乳酸浓度升高与细菌性脑膜炎、脑外伤等相关。对于生物流体中乳酸浓度进行精准检测，在乳酸相关疾病的早期筛查、临床诊断和治疗方面都具有十分重要的意义。本发明公开了一种新颖的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法，采用超声辅助液相剥离和溶剂热反应制备新型的钴配位型荧光硼量子点Co-BQDs。在乳酸氧化酶LOx存在下，乳酸LA被LOx酶催化氧化产生了过氧化氢H2O2，而H2O2的氧化作用可引起Co-BQDs荧光淬灭。通过拟合Co-BQDs荧光强度与对应LA浓度之间的线性关系，建立了基于Co-BQDs和LOx酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针。
发明内容
本发明的目的在于发展了一种设计新颖和简单高效的钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法，该制备的探针可用于生物流体中乳酸的高特异性定量检测。
为实现上述目的，本发明涉及的一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)量取25～50毫升丙酮，加入50～100毫克硼粉末，在搅拌下向其中逐滴加入新鲜配制的浓度为0.1～1.0摩尔/升的六水合硝酸钴水溶液1～5毫升，充分搅拌后形成均质的混合液-A；
(2)将混合液-A置于超声波细胞粉碎仪中，采用超声处理1～5分钟，接着冷却10～20分钟，执行超声处理和冷却的重复操作5～10次，制备出钴离子配位硼纳米片Co@BNSs分散液；
(3)在搅拌下，向上述分散液中逐滴加入溶解了5～10毫克谷胱甘肽GSH的水溶液1～5毫升，形成均质混合液-B，将其置于聚四氟乙烯100毫升内衬微型磁力高压反应釜中，在N2保护和100～200摄氏度下连续搅拌反应6～12小时；
(4)反应结束后冷却产物至室温，然后在5000转/分钟的转速下离心5～10分钟，吸取上层液体在10000转/分钟的转速下离心5～10分钟，离心后的沉淀物经乙醇和二次蒸馏水反复洗涤2～5次，真空干燥后得到GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs样品；
(5)将Co@BQDs样品分散于乙醇中，在搅拌下向其中逐滴加入乳酸氧化酶LOx溶液，形成均质混合液-C，向其中加入乳酸LA，充分搅拌后形成反应混合液体系，其中所含Co@BQDs，LOx和LA的最终浓度调节为1～5毫克/毫升，5～10U/毫升，0.01微克/毫升至10毫克/毫升；
(6)采用荧光光谱仪测量上述反应混合液体系的荧光发射光谱，然后通过拟合Co@BQDs的荧光发射峰相对强度与对应反应混合液体系中的LA浓度之间的线性关系，构建基于Co@BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于乳酸的高特异性定量检测，其中乳酸浓度的线性检测范围为0.01微克/毫升至10毫克/毫升，检测限为0.01～0.1微克/毫升。
本发明的效果是公开了一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法。以硼粉末为前体，在钴离子存在下，采用超声辅助的液相剥离方法制备出钴离子配位硼纳米片Co-BNSs；然后加入谷胱甘肽GSH，将混合液在微型磁力高压反应釜中进行溶剂热处理，制备出GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs；在乳酸氧化酶LOx存在下，乳酸LA被LOx酶催化氧化产生了丙酮酸和过氧化氢H2O2，而H2O2的氧化作用可引起Co-BQDs的荧光淬灭。拟合Co-BQDs荧光发射峰强度与对应体系中LA浓度之间的线性关系，从而建立了基于Co-BQDs和LOx酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针。
附图说明
图1为钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法及其检测乳酸的原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例涉及的一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法及其检测原理如图1所示，具体制备步骤如下：
量取25毫升丙酮，加入50毫克硼粉末，在搅拌下向其中逐滴加入新鲜配制的浓度为0.1摩尔/升的六水合硝酸钴水溶液1毫升，充分搅拌后形成均质的混合液-A。将混合液-A置于超声波细胞粉碎仪中，采用超声处理1分钟，接着冷却10分钟，执行超声处理和冷却的重复操作5次，制备出钴离子配位硼纳米片Co@BNSs分散液。在搅拌下，向上述分散液中逐滴加入溶解了5毫克谷胱甘肽GSH的水溶液1毫升，形成均质混合液-B，将其置于聚四氟乙烯100毫升内衬微型磁力高压反应釜中，在N2保护和120摄氏度下连续搅拌反应8小时。反应结束后冷却产物至室温，然后在5000转/分钟的转速下离心5分钟，吸取上层液体在10000转/分钟的转速下离心5分钟，离心后的沉淀物经乙醇和二次蒸馏水反复洗涤3次，真空干燥后得到GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs样品。
将Co@BQDs样品分散于乙醇中，在搅拌下向其中逐滴加入乳酸氧化酶LOx溶液，形成均质混合液-C，向其中加入乳酸LA，充分搅拌后形成反应混合液体系，其中所含Co@BQDs，LOx和LA的最终浓度调节为2毫克/毫升，5U/毫升，0.01微克/毫升至1毫克/毫升。采用荧光光谱仪测量上述反应混合液体系的荧光发射光谱，然后通过拟合Co@BQDs的荧光发射峰相对强度与对应反应混合液体系中的LA浓度之间的线性关系，构建基于Co@BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于乳酸的高特异性定量检测，其中乳酸浓度的线性检测范围为0.01微克/毫升至1毫克/毫升，检测限为0.02微克/毫升。
实施例2
本实施例涉及的一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法及其检测原理如图1所示，具体制备步骤如下：
量取35毫升丙酮，加入70毫克硼粉末，在搅拌下向其中逐滴加入新鲜配制的浓度为0.4摩尔/升的六水合硝酸钴水溶液3毫升，充分搅拌后形成均质的混合液-A。将混合液-A置于超声波细胞粉碎仪中，采用超声处理3分钟，接着冷却15分钟，执行超声处理和冷却的重复操作7次，制备出钴离子配位硼纳米片Co@BNSs分散液。在搅拌下，向上述分散液中逐滴加入溶解了7毫克谷胱甘肽GSH的水溶液3毫升，形成均质混合液-B，将其置于聚四氟乙烯100毫升内衬微型磁力高压反应釜中，在N2保护和150摄氏度下连续搅拌反应10小时。反应结束后冷却产物至室温，然后在5000转/分钟的转速下离心7分钟，吸取上层液体在10000转/分钟的转速下离心7分钟，离心后的沉淀物经乙醇和二次蒸馏水反复洗涤4次，真空干燥后得到GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs样品。
将Co@BQDs样品分散于乙醇中，在搅拌下向其中逐滴加入乳酸氧化酶LOx溶液，形成均质混合液-C，向其中加入乳酸LA，充分搅拌后形成反应混合液体系，其中所含Co@BQDs，LOx和LA的最终浓度调节为3毫克/毫升，7U/毫升，0.05微克/毫升至2毫克/毫升。采用荧光光谱仪测量上述反应混合液体系的荧光发射光谱，然后通过拟合Co@BQDs的荧光发射峰相对强度与对应反应混合液体系中的LA浓度之间的线性关系，构建基于Co@BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于乳酸的高特异性定量检测，其中乳酸浓度的线性检测范围为0.05微克/毫升至2毫克/毫升，检测限为0.05微克/毫升。
实施例3
本实施例涉及的一种钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法及其检测原理如图1所示，具体制备步骤如下：
量取40毫升丙酮，加入80毫克硼粉末，在搅拌下向其中逐滴加入新鲜配制的浓度为0.8摩尔/升的六水合硝酸钴水溶液5毫升，充分搅拌后形成均质的混合液-A。将混合液-A置于超声波细胞粉碎仪中，采用超声处理5分钟，接着冷却20分钟，执行超声处理和冷却的重复操作10次，制备出钴离子配位硼纳米片Co@BNSs分散液。在搅拌下，向上述分散液中逐滴加入溶解了8毫克谷胱甘肽GSH的水溶液4毫升，形成均质混合液-B，将其置于聚四氟乙烯100毫升内衬微型磁力高压反应釜中，在N2保护和180摄氏度下连续搅拌反应12小时。反应结束后冷却产物至室温，然后在5000转/分钟的转速下离心10分钟，吸取上层液体在10000转/分钟的转速下离心10分钟，离心后的沉淀物经乙醇和二次蒸馏水反复洗涤5次，真空干燥后得到GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs样品。
将Co@BQDs样品分散于乙醇中，在搅拌下向其中逐滴加入乳酸氧化酶LOx溶液，形成均质混合液-C，向其中加入乳酸LA，充分搅拌后形成反应混合液体系，其中所含Co@BQDs，LOx和LA的最终浓度调节为5毫克/毫升，10U/毫升，0.1微克/毫升至10毫克/毫升。采用荧光光谱仪测量上述反应混合液体系的荧光发射光谱，然后通过拟合Co@BQDs的荧光发射峰相对强度与对应反应混合液体系中的LA浓度之间的线性关系，构建基于Co@BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于乳酸的高特异性定量检测，其中乳酸浓度的线性检测范围为0.1微克/毫升至10毫克/毫升，检测限为0.1微克/毫升。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.钴离子配位型硼量子点基于酶催化反应的乳酸荧光纳米生物探针的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括以下步骤：
(1)量取25～50毫升丙酮，加入50～100毫克硼粉末，在搅拌下向其中逐滴加入新鲜配制的浓度为0.1～1.0摩尔/升的六水合硝酸钴水溶液1～5毫升，充分搅拌后形成均质的混合液-A；
(2)将混合液-A置于超声波细胞粉碎仪中，采用超声处理1～5分钟，接着冷却10～20分钟，执行超声处理和冷却的重复操作5～10次，制备出钴离子配位硼纳米片Co@BNSs分散液；
(3)在搅拌下，向上述分散液中逐滴加入溶解了5～10毫克谷胱甘肽GSH的水溶液1～5毫升，形成均质混合液-B，将其置于聚四氟乙烯100毫升内衬微型磁力高压反应釜中，在N2保护和100～200摄氏度下连续搅拌反应6～12小时；
(4)反应结束后冷却产物至室温，然后在5000转/分钟的转速下离心5～10分钟，吸取上层液体在10000转/分钟的转速下离心5～10分钟，离心后的沉淀物经乙醇和二次蒸馏水反复洗涤2～5次，真空干燥后得到GSH表面修饰的钴离子配位硼量子点Co@BQDs样品；
(5)将Co@BQDs样品分散于乙醇中，在搅拌下向其中逐滴加入乳酸氧化酶LOx溶液，形成均质混合液-C，向其中加入乳酸LA，充分搅拌后形成反应混合液体系，其中所含Co@BQDs，LOx和LA的最终浓度调节为1～5毫克/毫升，5～10U/毫升，0.01微克/毫升至10毫克/毫升；
(6)采用荧光光谱仪测量上述反应混合液体系的荧光发射光谱，然后通过拟合Co@BQDs的荧光发射峰相对强度与对应反应混合液体系中的LA浓度之间的线性关系，构建基于Co@BQDs和LOx酶催化反应的荧光纳米生物探针，用于乳酸的高特异性定量检测，其中乳酸浓度的线性检测范围为0.01微克/毫升至10毫克/毫升，检测限为0.01～0.1微克/毫升。
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