CN113292616A - 一种单糖配体功能化的阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞靶向性基因载体制备领域，具体涉及一种单糖配体功能化的阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用。本发明所述阳离子脂质类化合物的化学结构通式如式Ⅰ所示，

Description

一种单糖配体功能化的阳离子脂质类化合物及其制备方法与 应用

技术领域

本发明涉及基因载体制备与应用领域，具体涉及糖配体功能化的阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种依赖RNA的基因沉默过程，具有巨大的治疗潜力。它通过小干扰RNA(siRNA)与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，从而实现目标信使RNA(mRNA)的切割。迄今为止，RNAi一直是研究人员实现特定基因沉默的首选方法。目前，已经有三种由美国FDA批准的基于siRNA的药物正在进行临床III期试验，包括Onpattro(Patisiran)、Givlaari(Givosiran)和Oxlumo(Lumasiran)，以及药物Leqvio(inclisiran)目前正在研发中。

尽管在临床水平上取得了如此巨大的进展，但是由于siRNA具有核酸酶敏感性和脱靶效应，siRNA治疗仍然面临着一些挑战。也正由于这些原因，人们在开发安全高效的siRNA递送系统上投入了大量的精力。高效的靶向性载体，不仅能够保护siRNA免受核酸酶的攻击，还能有效促进siRNA进入靶细胞内启动RNA干扰作用。病毒型核酸载体的制备过程复杂，价格昂贵，又有潜在的插入突变的危险。例如，美国蓝鸟公司推出的LentiGlobin是基于腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体的、针对镰状细胞病(Sickle celldisease，SCD)的基因治疗药物。最近，参与LentiGlobin临床实验的两名患者患上了白血病样癌症，使该公司不得不终止其3期临床试验。然而，在非病毒型载体中，脂质纳米颗粒是第一个从概念转化为临床应用的给药系统，脂质纳米颗粒给药系统现在是一个成熟的技术平台，具有相当大的临床接受度。

靶向siRNA递送是通过细胞表面的特异性受体介导的内吞作用实现的。例如，肝脏细胞高表达去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycorotein Receptor,ASGPR)，每个肝脏细胞约含有500,000个ASGPR受体蛋白，其中约5-10％定位于细胞表面。甘露糖受体(Cluster ofDifferentiation206,CD206)是一种模式识别受体，主要由巨噬细胞、脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞表达。

中风后的小胶质细胞的激活被认为是神经炎症过程的一个典型特征。被激活的小胶质细胞在体外或体内可极化成多种表型。促炎表型也被称为M1表型，可产生多种介质(如氧化合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、胰岛素样生长因子1(IGF-1))。抗炎表型，即M2表型，能够促进CD206、IL-10和TGF-β等的表达。因此，通过调控小胶质细胞的表型，抑制神经性炎症，对脑卒中后的神经恢复至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞毒性低、细胞转染效率高、制备方法简单、细胞靶向性强的基因载体。为了实现上述目的，本发明提供一种阳离子脂质类化合物，其化学结构如通式(I)所示：

式中R1为：

R2选自以下任一个基团：

X为NH或O；

m为2、4或6，n为1、2、3或4，o为1或2。

具体地，本发明提到的化合物为：

或本发明提供的化合物为：

或本发明提供的化合物为：

第二方面，本发明提供上述化合物的制备方法，包括：

S1、将饱和或不饱和烃基氨或醇、Boc-D-谷氨酸-OH或Boc-D-天冬氨酸-OH溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂反应，合成化合物I或化合物II，所述Boc是叔丁氧羰基；反应方程式为：

S2、将化合物I或化合物II与N-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸在碱性条件下有机溶剂中反应得到化合物III；反应方程式为：

步骤S1或步骤S2中，n为1、2、3或4，o为1或2，Y为NH或O，R2选自以下任一基团：

S3、化合物IV的反应方程式为：

S4、化合物V的反应方程式为：

S5、化合物VI的反应方程式：

所述化合物IV、化合物V或化合物VI的制备步骤，包括：

(1)将甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺悬浮于乙酸酐溶剂中，缓慢加入碘催化剂，反应结束，蒸馏去除溶剂，硫代硫酸钠溶液萃取获得油状的中间产物乙酰化甘露糖、乙酰化半乳糖或乙酰化N-乙酰半乳糖胺；

(2)将乙酰化甘露糖、乙酰化半乳糖或乙酰化N-乙酰半乳糖胺，溶解于1,2-二氯乙烷，缓慢滴加33％溴化氢醋酸溶液，反应结束后减压旋蒸法除去溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取三次，得到中间产物溴化乙酰甘露糖、溴化乙酰半乳糖或溴化乙酰N-乙酰半乳糖胺；

(3)将Ag₂CO₃、CaSO₄和1,4-丁二醇在碘催化下室温反应后加入溴化乙酰甘露糖、溴化乙酰半乳糖或溴化乙酰N-乙酰半乳糖胺，持续反应24小时，反应结束后用硅藻土过滤，蒸馏水和盐水萃取并用硅胶柱层析法分离纯化得到中间产物，乙酰甘露糖醇、乙酰半乳糖醇或乙酰N-乙酰半乳糖胺醇；

(4)将乙酰甘露糖醇、乙酰半乳糖醇或乙酰N-乙酰半乳糖胺醇，和4-硝基苯基氯甲酸溶解于乙腈溶液中加入碱性催化剂，室温反应24小时，反应结束后蒸馏除去溶剂，用蒸馏水、盐酸和饱和盐水萃取，再用硅胶柱层析法纯化得到化合物IV、化合物V或化合物VI；

S6、化合物的合成

将化合物IV、化合物V或化合物VI和化合物III，溶解于干燥的有机溶剂中，加入碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应；反应结束后用蒸馏水和饱和盐水萃取多次，再用硅胶柱层析法分离纯化目的产物，将收集物溶解于强碱溶液剧烈搅拌，得到化合物。

在本发明提供的制备方法中，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、1，2-二氯乙烷、石油醚、乙酸酐、33％溴化氢醋酸溶液、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环、甲醇、乙醇、乙醚和/或丙酮；

所述碱性催化剂包括三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶；

所述柱层析使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷和/或甲醇按照不同配比混合所得的溶剂体系。

在本发明提供的制备方法中，所述的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、羰基二咪唑或1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐。

第三方面，本发明要求保护含有上述的化合物的基因载体。所述基因载体的制备方法为，使用本发明所提供的化合物与辅助脂质分子按(5～15)：85的质量比例混合，溶解在氯仿中。

根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述化合物或上述制备方法，在制备基因载体或在制备基因治疗药物中的应用，可治疗具有神经退行性疾病(靶向CD206受体)、有关肝脏疾病(靶向ASGPR受体)等相关疾病。

本发明的有益效果至少为：

(1)本发明所述阳离子脂质类化合物的制备工艺简单、产率高；

(2)本发明提供的化合物中脂质类分子水溶性高、与质粒DNA、小干扰RNA结合力强、易形成脂质体；

(3)本发明提供的化合物中，含有单糖配体使化合物具有极高的细胞特异性，与市面上现有的转染试剂(如，lipofectamine2000、lipofectamine3000、PEI等)相比较，所述化合物能够特异性转染高表达甘露糖受体和去唾液酸糖蛋白受体的细胞，如小胶质细胞、巨噬细胞、肝脏细胞等；

(4)本发明制备得到的基因载体粒径在200nm左右，大小均一，分散性良好；所述基因载体对基因(质粒DNA)和siRNA转染效率高，由于毒性低，在转染过程中不需要更换培养基，有效降低细胞培养及基因转染的成本；通过荧光猝灭实验和凝胶电泳阻滞实验检测证实此脂质基因载体能够很好的与siRNA的结合，包裹能力强，具有很好的酶和血清稳定性；细胞毒性很低，当基因载体达到500μg/mL时细胞存活率能达到65％以上；转染能力强，能达到95％左右的转染效率；具有细胞靶向性，能够通过识别细胞表面受体，靶向递送siRNA；通过转染siTLR4实验证明，此载体具有调控小胶质细胞表型而抑制神经炎症；具有神经保护作用。

附图说明

图1是本发明实施例3制备的化合物的质谱图。

图2是本发明实施例6中检测靶向载体的粒度分布图。

图3是本发明实施例6中对靶向载体的荧光淬灭实验结果图。

图4是本发明实施例6中对靶向载体或靶向载体/siRNA复合物的溶血实验结果图；其中，A为溶血实验定量分析结果图，B为溶血实验结果图。

图5是本发明实施例6中测定M3(实施例3所得脂质类化合物制备得到靶向载体)对细胞存活率的结果图。

图6是本发明实施例6中测定M3(实施例3所得脂质类化合物制备得到靶向载体)对siRNA转染效率的结果图，其中A为载体/siRNA复合物表面电荷为正时，在BV2细胞中的转染率；B为载体/siRNA复合物表面电荷为正时，在C8-D1A细胞中的转染率；C为载体/siRNA复合物表面电荷为中性时，在BV2细胞中的转染率；D为载体/siRNA复合物表面电荷为中性时，在C8-D1A细胞中的转染率。

图7是本发明实施例6中，测定M3(实施例3所得脂质类化合物制备得到的靶向载体)对温度依赖性和竞争抑制性的实验结果图；其中，A为不同温度下，BV2细胞对靶向载体的摄取率结果图；B为存在甘露聚糖、葡聚糖或酵素作为竞争抑制剂时，BV2细胞对靶向载体的摄取率结果图。

图8是本发明实施例6中，测定M3(实施例3所得脂质类化合物制备得到的靶向载体)体外表型极化的实验结果图，其中，A为靶向载体/siTLR4复合物处理OGD模型后TLR4mRNA相对水平分析图；B为靶向载体/siTLR4复合物处理OGD模型后iNOS mRNA相对水平分析图；C为靶向载体/siTLR4复合物处理OGD模型后CD206 mRNA相对水平分析图，D为免疫染色法的结果图。

图9是本发明实施例6中检测M3(实施例3所得脂质类化合物制备得到的靶向载体)神经保护作用的结果图，其中，A为siTLR4/M3处理BV2细胞的上清液处理N2a细胞后活死细胞染色结果图，B为siTLR4/M3处理BV2细胞的上清液处理N2a细胞后定量分析死细胞数量结果图。

具体实施方式

下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1化合物I和化合物II的合成

化合物I(谷氨酸的饱和/不饱和脂肪烃酰胺)的合成：将饱和/不饱和烃基氨或醇、Boc-谷氨酸-OH溶于干燥的有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂，在0～35℃下搅拌12～24h后，蒸馏除去有机溶剂，加过量酸的混合液，在室温搅拌1～2h后蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化得到中间体谷氨酸的饱和/不饱和烃基取代酯或酰胺，产率为70％。

化合物II(天冬氨酸的饱和/不饱和脂肪烃酰胺)的合成：将饱和/不饱和烃基氨或醇、Boc-天冬氨酸-OH溶于干燥的有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂，在0～35℃下搅拌12～24h后，蒸馏除去有机溶剂，加过量酸的混合液，在室温搅拌1～2h后蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化得到中间体谷氨酸的饱和/不饱和烃基取代酯或酰胺，即化合物I，产率为75％。

实施例2化合物III、化合物IV、化合物V、化合物VI的制备

化合物III(DoGo1接N-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸)的合成：

将D-DoGo1、N-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸溶解于干燥的有机溶剂中，加入缩合剂和碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应24小时。用蒸馏水、饱和盐水萃取多次后用硅胶层析法分离纯化，继续用有机溶剂和强酸混合液中剧烈搅拌30分钟，得到化合物III，其产率为89％。

化合物IV(4-硝基苯基乙酰化甘露糖)的合成方程式为：

第一步：将甘露糖(500mg,2.78mmol)悬浮于乙酸酐溶剂中，缓慢加入碘(130mg,0.52mmol)催化，0℃反应2小时、继续在室温搅拌3小时。当反应结束后，旋蒸去除多余的乙酸酐溶液，剩余的混合物溶解于二氯甲烷中，用1M硫代硫酸钠溶液、蒸馏水和饱和盐水洗涤后得到油状的目标产物乙酰化甘露糖，其产率为92％。

第二步：将33％溴化氢醋酸溶液(5mL)滴加至乙酰化甘露糖的1,2-二氯乙烷溶液中，氮气保护下搅拌过夜。减压旋蒸法除去溶剂，剩余的混合物溶解于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取三次，经无水硫酸钠干燥得到中间产物溴化乙酰甘露糖。接着将Ag₂CO₃(1260mg,4.57mmol),CaSO₄(761mg,4.94mmol)，和1,4-丁二醇(3130μL,35mmol)在碘催化下，室温下搅拌15分钟后加入溴化乙酰甘露糖，持续搅拌24小时，当反应结束后，用硅藻土过滤。继续用蒸馏水和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝2/1)纯化，得到乙酰甘露糖醇，其产率为85％。

第三步：将乙酰甘露糖醇和4-硝基苯基氯甲酸溶解于乙腈溶剂中，加入碱催化剂，室温搅拌过夜。除去溶剂，将剩余化合物溶解至乙酸乙酯中，依次用蒸馏水、1M盐酸和饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥之后用用硅胶柱层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝2/1)纯化得到化合物IV，其产率为78％。

化合物V(4-硝基苯基乙酰化半乳糖)的合成方程式为：

第一步：将半乳糖(500mg，2.78mmol)在碘(130mg，0.52mmol)催化下悬浮于乙酸酐溶剂中，0℃搅拌2小时，室温搅拌3小时。当反应结束后，旋蒸去除多余的乙酸酐溶液，剩余的混合物溶解于二氯甲烷中，用1M硫代硫酸钠溶液、蒸馏水和饱和盐水洗涤后得到油状的目标产物乙酰化半乳糖，其产率为95％。

第二步：将乙酰化半乳糖溶解于1，2-二氯乙烷溶液中再滴加33％溴化氢醋酸溶液(5mL)，氮气保护下搅拌24小时。减压旋蒸法除去溶剂，剩余的混合物溶解于二氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取三次，经无水硫酸钠干燥得到溴化乙酰化半乳糖中间产物。将Ag₂CO₃(1260mg，4.57mmol)，CaSO₄(761mg，4.94mmol)，和1，4-丁二醇(3130μL，35mmol)在碘催化下反应15分钟后加入溴化乙酰化半乳糖，持续搅拌24小时，当反应结束后，加入二氯甲烷溶剂，用硅藻土过滤。继续用蒸馏水和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后用硅胶柱层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝2/1)，纯化得中间产物乙酰半乳糖醇，其产率为82％。

第三步：将乙酰半乳糖醇溶解于乙腈溶剂中，加入4-硝基苯基氯甲酸和碱性催化剂，室温反应24小时。除去溶剂，将剩余化合物溶解至乙酸乙酯中，依次用蒸馏水、1M盐酸和饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥之后用用硅胶柱层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝2/1)，纯化得到化合物V，其产率为75％。

化合物VI(4-硝基苯基乙酰化N-乙酰半乳糖胺)的合成方程式为：

第一步：将N-乙酰半乳糖胺溶解于乙酸酐溶剂中，缓慢加入碘催化剂，冰浴下搅拌2小时，继续室温搅拌3小时，当反应结束后旋蒸除去多余的乙酸酐溶剂，再通过硫代硫酸钠溶液萃取获得油状的中间产物乙酰化N-乙酰半乳糖胺，其产率为91％。

第二步：将乙酰化N-乙酰半乳糖胺溶解于1，2-二氯乙烷为溶剂中，缓慢滴加33％溴化氢醋酸溶液，室温反应24小时。当反应结束后减压旋蒸法除去溶剂，依次用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取三次，得到中间产物溴化乙酰化N-乙酰半乳糖胺。继续将Ag₂CO₃、CaSO₄和1，4-丁二醇在碘催化下室温反应15分钟后加入溴化乙酰化N-乙酰半乳糖，持续反应24小时。当反应结束后用硅藻土过滤，蒸馏水和盐水萃取并用硅胶柱层析法分离纯化得到中间产物乙酰N-乙酰半乳糖胺醇，其产率为82％。

第三步：将乙酰N-乙酰半乳糖胺醇和4-硝基苯基氯甲酸溶解于乙腈溶液中加入碱性催化剂，室温反应24小时。反应结束后蒸馏除去溶剂，用蒸馏水、盐酸和饱和盐水萃取，再用硅胶柱层析法纯化得到化合物VI，其产率为71％。

本发明中所述的甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺功能化的化合物的合成步骤中所述的有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、1，2-二氯乙烷、石油醚、乙酸酐、33％溴化氢醋酸溶液、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环、甲醇、乙醇、乙醚和/或丙酮；所使用的碱性催化剂包括三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶；所述柱层析用的有机溶剂包括乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷和/或甲醇按照不同配比混合所得的溶剂体系。

本发明中所述的甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺功能化的化合物的合成步骤中所述的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)。

本发明中所述的甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺功能化的化合物的合成步骤中，所述的酸为三氟乙酸。

本发明中所述的甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺功能化的化合物的合成步骤中所述的反应温度优选0～35℃，特别优选25～35℃。

实施例3化合物(1)的制备

将实施例2制备得到的化合物IV和化合物III溶解于干燥的有机溶剂中，加入碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应24小时。反应结束后用蒸馏水和饱和盐水萃取多次，再用硅胶柱层析方法分离纯化目的产物，将收集物溶解于强碱溶液剧烈搅拌1小时，得到化合物(1)，其产率为58％。反应方程式如下：

产物表征参数为：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.84-0.86(6H,m,-CH₃),1.21-1.48(58H,m,-CH₂-),1.64-2.13(12H,m,H-16,H-17,H-19),2.95-3.29(6H,m,H-11,H-18),3.41-3.64(4H,m,H-7,H-10),4.03-4.37(5H,m,H-2,H-3,H-4,H-6),4.47(1H,t,H-15),4.53-5.03(4H,m,OH-2,OH-3,OH-4,OH-6),5.31-5.35(4H,m,H₂C＝CH₂-),5.72-5.76(1H,d,H-5),5.88(1H,d,H-1),7.28(1H,t,-NH-),7.73-7.87(3H,m,-NH-).¹³C NMR(DMSO-d6,ppm):14.59(-CH₃),22.54-29.62(C-8,C-9,C-12,C-13,C-17,-CH₂-),31.74(C-16),32.39(C-14),35.23(C-18),39.51-39.85(C-11),52.73(C-15),61.53(C-6),66.91(C-10),67.86(C-7),70.16(C-4),71.10(C-2),76.27(C-3),94.36(C-5),130.09-130.53(-H₂C＝CH₂-),154.83(-CO-),171.60-176.09(-CO-)。

MS(ESI)m/z 1023.7888(M)⁺.[M+H]⁺(见图1)(理论分子量为C₅₇H₁₀₇N₄O₁₁,1022.7822)。

实施例4化合物(2)的制备

将化合物V和化合物III溶解于干燥的有机溶剂中，加入碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应24小时。反应结束后用蒸馏水和饱和盐水萃取多次，再用硅胶柱层析方法分离纯化目的产物，将收集物溶解于强碱溶液剧烈搅拌1小时，得到化合物(2)，其产率为60％。反应方程式如下：

产物表征参数为：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.84-0.86(6H,t,-CH₃),1.23-1.81(56H,m,H-8,H-9,H-12,H-13,-CH₂-),1.92-2.14(26H,Overlapped,H-14,H-16,H-17,H-19,COCH₃),2.92-3.07(6H,Overlapped,H-11,H-18),3.39-3.47(2H,t,H-7),3.89-4.18(5H,Overlapped,H-5,H-6,H-10),4.49-4.50(1H,m,H-15),4.87-5.10(3H,Overlapped,H-2,H-3,H-4),5.24-5.42(4H,m,-H₂C＝CH₂-)，5.62-5.63(1H，d，H-1)，7.02-7.04(1H，t，OCONH-),7.72-7.85(3H，Overlapped，CONH(CH)，CONH(CH₂)-).¹³C NMR(DMSO-d6，ppm):14.21(-CH₃),20.33-22.86(-COCH₃)，25.92-26.96(C-13，C-16，C-17)，28.75-29.80(-CH₂-),31.81-32.56(C-14,C-19),35.26(C-18),38.97(C-11),52.51(C-15),61.35-62.20(C-6,C-7,C-10),65.81(C-4),70.18(C-2,C-3),77.50(C-5),123.93(C-1),130.08(-H₂C＝CH₂-)，171.66-172.38(-CO-)。

MS(ESI)m/z 1023.7858(M)⁺.[M+H]⁺(理论分子量为C₅₇H₁₀₇N₄O₁₁,1022.7822)。

实施例5化合物(3)的制备

将化合物VI和化合物III溶解于干燥的有机溶剂中，加入碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应24小时。反应结束后用蒸馏水和饱和盐水萃取多次，再用硅胶柱层析方法分离纯化目的产物，将收集物溶解于强碱溶液剧烈搅拌1小时，得到化合物(3)，其产率为56％。

产物表征参数为：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.84-0.86(6H，t，-CH₃)，1.23-1.81(56H,m,H-8,H-9,H-12,H-13,-CH₂-)，1.92-2.14(26H,Overlapped，H-14,H-16,H-17,H-19,COCH₃)，2.92-3.07(6H,Overlapped,H-11，H-18),3.39-3.47(2H，t，H-7),3.89-4.18(5H，Overlapped,H-5，H-6,H-10),4.49-4.50(1H,m，H-15),4.87-5.10(3H,Overlapped,H-2,H-3,H-4),5.24-5.42(4H,m，-H₂C＝CH₂-),5.62-5.63(1H,d,H-1),7.02-7.04(1H,t,OCONH-),7.72-7.85(3H，Overlapped，CONH(CH)，CONH(CH₂)-).¹³C NMR(DMSO-d6,ppm):14.21(-CH₃),20.33-22.86(-COCH₃),25.92-26.96(C-13,C-16，C-17),28.75-29.80(-CH₂-)，31.81-32.56(C-14，C-19)，35.26(C-18),38.97(C-11),52.51(C-15),61.35-62.20(C-6,C-7,C-10),65.81(C-4),70.18(C-2,C-3),77.50(C-5),123.93(C-1),130.08(-H₂C＝CH₂-),171.66-172.38(-CO-)。

MS(ESI)m/z 1064.8424(M)⁺.[M+H]⁺(理论分子量为：C₆₅H₁₁₅N₄O₁₅,1063.8124)。

实施例6含本发明化合物的靶向脂质体转基因载体的制备与生物学活性验证

分别将由质量比为15％的实施例3、实施例4、实施例5得到的化合物与50％的D-DoGo2、20％的DOPE或DOPC、10％的胆固醇和5％的DPPE-mPEG混合，溶解在氯仿中，减压蒸馏移去氯仿后真空干燥过夜；加入pH7.2的PBS混匀后，在室温放置1小时；用Avanti Mini-Extruder脂质体挤出器(含孔径100纳米的膜)反复挤出(20到50次)，实施例3所得化合物制备得到靶向载体，命名为M3，在4℃冰箱内保存。对制备得到的新型功能化脂质体转基因载体，进行下述几个方面的检测：

(1)利用激光粒度仪检测靶向载体的大小、粒径分布情况，图2显示结果，所制得的基因载体粒径约为200nm左右，大小均一，分散性良好。实施例4和5得到的化合物制得的靶向载体的效果同此。

(2)采用荧光猝灭方法检测功能化靶向载体与siRNA之间的结合能力，结果显示，当氨基：磷酸基团比例(即，N/P比例)在大于或等于6时，能够完全猝灭FITC-siRNA的荧光信号，说明实施例3制备得到的化合物制得的靶向载体结合和包裹siRNA的能力强(见图3)。

实施例4和5得到的化合物制得的靶向载体的效果同此。

将制备得到的靶向载体与siRNA结合，形成靶向载体/siRNA复合物，对靶向载体/siRNA复合物的性质进行检测，结果如下：

(3)为了评估靶向载体和siRNA复合物的溶血效应，采用红细胞裂解实验。单独载体或载体/siRNA复合物均无明显的溶血作用，说明靶向载体具有较高的生物相容性，可能适用于体内给药(见图4中的A和图4中的B)。图4中的M3和M3/siRNA分别表示单独载体和载体/siRNA复合物。

(4)细胞存活率检测：加样前一天，按每孔1.0×10⁴细胞密度接种于96孔培养板，在5％CO₂、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；将载体按100-500μg/mL的浓度梯度加至细胞上，继续培养24小时后，采用MTT方法，测定细胞存活率，其计算公式为：

[细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100]，其中，Asample是加入靶向载体的细胞孔的吸收，Acontrol是没有加入靶向载体的细胞孔的吸收，每组实验重复3次，结果如图5所示。结果显示，当达到最高浓度500μg/mL时BV2细胞存活率达到65％，对C8-D1A和N2a细胞的效果与此相同，实施例4、实施例5的化合物制得的靶向载体效果与此相同，可见本发明的基因载体具有很低的细胞毒性。

(5)细胞转染效率的测定：

BV2细胞和C8-D1A细胞的培养：在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时。

转染前一天，按每孔1×10⁶细胞密度接种于24孔培养板，在5％CO₂、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％小牛血清的新鲜培养液(0.4mL/孔)；将FITC-siRNA(50nM在100μL Opti-MEM培养液中)和5或2.5微升的靶向载体(由实施例3所得)(在100μL Opti-MEM培养液中)，按1：1体积比例混合两种溶液，在室温放置30分钟后，加入到细胞上面，继续培养6小时；

转染效率的测定：用流式细胞仪定量测定所转染的FITC-siRNA的有效数，如图6所示。结果显示，当载体/siRNA复合物表面电荷为正时其在BV2细胞的转染效率能达到96.83％、其在C8-D1A细胞的转染效率95.20％(见图6中的A和图6中的B)，然而，当载体/siRNA复合物表面电荷为中性时仅在带有甘露糖受体的BV2细胞上的转染效率能达到88.22％，而在没有甘露糖受体的C8-D1A细胞上的转染效率则降到65.54％，说明由实施例3所得的复合物通过甘露糖受体介导的内吞作用进入BV2细胞(见图6中的C和图6中的D)。实施例4、实施例5的化合物制得的靶向载体效果与此相同。

(6)转染机制研究：

首先，为了阐明靶向载体在细胞中的摄取机制，采用低温实验评估其是否依赖于能量。结果显示，与4℃相比较而言，在37℃时整个细胞摄取随着时间的增加其转染效率也增加，表明靶向载体是通过能量依赖的内吞作用被BV2细胞所吸收的(见图7中的A)。由实施例4、实施例5所得的化合物制得的载体的转染效率与此相同。

接着，为了进一步验证其转染机制是由细胞表面受体所介导的，采用了竞争性阻断实验。结果显示，当100μg/mL甘露聚糖与BV2细胞表面的CD206受体所结合之后，再使用载体进行细胞转染的话，载体转染效率能降到35.55％；而不能与CD206受体结合的葡聚糖和酵素作为竞争抑制剂时不影响载体转染效率(见图7中的B)，表明由实施例3所得的化合物制得的靶向载体是通过识别CD206受体的识别和结合而被内化。由实施例4、实施例5所得的化合物制得的载体的转染效率与此相同。

(7)RNA干扰效率的检测：

转染前一天，将BV2细胞按每孔1×10⁶细胞密度接种于24孔培养板，在5％CO₂、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％小牛血清的新鲜培养液(0.4mL/孔)；将siTLR4(100nM在100μL Opti-MEM培养液中)和2.5微升的靶向载体(由实施例3的化合物所制得)，在100μL Opti-MEM培养液中，按1：1体积比例混合两种溶液，在室温放置30分钟后，加入到细胞上面，继续培养6小时，更换无糖DMEM培养基，置于缺氧罐内(37℃、5％CO₂、95％N₂)培养2-3小时后，将培养基更换为含有10％小牛血清的新鲜培养液(0.4mL/孔)，继续培养24小时；24小时之后将细胞培养基移至预先种好的N2a细胞上继续培养24小时。

RNA干扰效率的检测：对BV2细胞，提取总RNA，采用RT-qPCR方法检测TLR4、CD206和iNOS mRNA水平的表达，结果显示，当OGD(糖氧剥夺模型)处理之后TLR4和iNOS mRNA水平显著提高，而复合物处理之后能有效降低TLR4和iNOS的表达(见图8中的A和图8中的B)；然而OGD处理之后CD206 mRNA水平显著降低，复合物处理之后能有效增加CD206的表达(见图8中的C)。图8中，OGD表示BV2细胞的糖氧剥夺模型，而OGD+siCtrl或OGD+siTLR4均为载体加siRNA复合物(siCtrl:对照组siRNA；siTLR4：Toll-like receptor 4siRNA)。

此外通过免疫染色方法更直观的验证了其RNA干扰效应，如图8中的D所示，表明由实施例3所得的化合物制得的复合物能够有效地促进BV2细胞的M2极化，相反能有效抑制BV2细胞的M1极化。实施例4和5的化合物制得的复合物效果与此相同。

神经保护作用检测：对N2a细胞，采用活死细胞染色试剂盒对其进行染色，用倒置荧光显微镜和多功能酶标仪进行检测，如图9所示，结果表明，当OGD处理之后，死细胞数明显增加，而复合物处理之后能有效减少死细胞数量，表明由实施例3所得的化合物具有神经保护机制。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种阳离子脂质类化合物，其特征在于，其化学结构如通式(Ⅰ)所示：

式中R1为：

R2选自以下任一个基团：

X为NH或O；

m为2、4或6，n为1、2、3或4，o为1或2。

2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物为：

3.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物为：

4.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物为：

5.权利要求1～4任一项所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：

S1、将饱和或不饱和烃基氨或醇、Boc-D-谷氨酸-OH或Boc-D-天冬氨酸-OH溶于有机溶剂中，在氮气保护下加入缩合剂反应，合成化合物I或化合物II，所述Boc是叔丁氧羰基；反应方程式为：

S2、将化合物I或化合物II与N-(叔丁氧羰基)-5-氨基戊酸在碱性条件下有机溶剂中反应得到化合物III；反应方程式为：

步骤S1或步骤S2中，化合物中的n为1、2、3或4，o为1或2，Y为NH或O，R2选自以下任一基团：

S3、化合物IV的反应方程式为：

S4、化合物V的反应方程式为：

S5、化合物VI的反应方程式：

所述化合物IV、化合物V或化合物VI的制备步骤，包括：

(1)将甘露糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺悬浮于乙酸酐溶剂中，缓慢加入碘催化剂，反应结束，蒸馏去除溶剂，硫代硫酸钠溶液萃取获得油状的中间产物乙酰化甘露糖、乙酰化半乳糖或乙酰化N-乙酰半乳糖胺；

(2)将乙酰化甘露糖、乙酰化半乳糖或乙酰化N-乙酰半乳糖胺，溶解于1,2-二氯乙烷，缓慢滴加33％溴化氢醋酸溶液，反应结束后减压旋蒸法除去溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取三次，得到中间产物溴化乙酰甘露糖、溴化乙酰半乳糖或溴化乙酰N-乙酰半乳糖胺；

(3)将Ag₂CO₃、CaSO₄和1,4-丁二醇在碘催化下室温反应后加入溴化乙酰甘露糖、溴化乙酰半乳糖或溴化乙酰N-乙酰半乳糖胺，持续反应24小时，反应结束后用硅藻土过滤，蒸馏水和盐水萃取并用硅胶柱层析法分离纯化得到中间产物，乙酰甘露糖醇、乙酰半乳糖醇或乙酰N-乙酰半乳糖胺醇；

(4)将乙酰甘露糖醇、乙酰半乳糖醇或乙酰N-乙酰半乳糖胺醇，和4-硝基苯基氯甲酸溶解于乙腈溶液中加入碱性催化剂，室温反应24小时，反应结束后蒸馏除去溶剂，用蒸馏水、盐酸和饱和盐水萃取，再用硅胶柱层析法纯化得到化合物IV、化合物V或化合物VI；

S6、化合物的合成

将化合物IV、化合物V或化合物VI和化合物III，溶解于干燥的有机溶剂中，加入碱性催化剂，在室温、氮气保护下反应；反应结束后用蒸馏水和饱和盐水萃取多次，再用硅胶柱层析法分离纯化目的产物，将收集物溶解于强碱溶液剧烈搅拌，得到化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、1,2-二氯乙烷、石油醚、乙酸酐、33％溴化氢醋酸溶液、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、甲醇、乙醇、乙醚和/或丙酮；

所述碱性催化剂包括三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶；所述柱层析用的有机溶剂包括乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷和/或甲醇混合所得的溶剂体系。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、羰基二咪唑或1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐。

8.含有权利要求1～4任一项所述的化合物的基因载体。

9.权利要求1～4任一项所述的化合物或权利要求5～7任一项所述的制备方法在制备基因载体中的应用。

10.权利要求1～4任一项所述的化合物或权利要求5～7任一项所述的制备方法在制备基因治疗药物中的应用。

Images