CN113292474A - 一种通过流式细胞仪同时检测线粒体膜电位和质量的荧光探针及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过流式细胞仪同时检测线粒体膜电位和质量的荧光探针及其合成方法。针对现有荧光探针检测细胞内线粒体膜电位时需占用两个荧光通道、易与线粒体隔离等情况，本发明的探针在流式细胞仪上使用检测线粒体膜电位时，仅表现同一区段的激发波长范围，在同一荧光通道中检测，而且该探针在检测线粒体膜电位的同时可以检测线粒体的质量，达到联合评估线粒体的效果。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针检测领域，具体涉及一种通过流式细胞仪同时检测线粒体膜电位和质量的荧光探针及其合成方法。
背景技术
线粒体是在真核细胞中由双层高度特化的单位膜围成的半自主性细胞器，能产生能量以维持细胞正常的生理活动，有大量研究显示，线粒体参与生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面的活动。线粒体在不同的致病刺激因素下，非常容易发生结构和功能的损伤，从而直接影响机体其他细胞组织的正常功能，当线粒体受损时，线粒体的膜电位下降，形态功能发生变化。为应对这种损伤，细胞通过线粒体质量调控进行选择性的清除受损线粒体。
目前市场上针对线粒体检测大多依赖于线粒体膜电位来进行检测，典型的探针如JC-1，通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。但该探针在流式细胞仪上使用时需要占用两个荧光通道，不利于多种指标同时测量，同时该荧光探针很容易与线粒体隔离，当细胞的线粒体的膜电位消失，它们就极易被洗掉。这种特性限制了它们应用在一些实验中，例如一些细胞需要被醛类物质固定或者其他试剂会影响线粒体的能量状态，传统的线粒体染料就无法使用。市场上也存在非线粒体膜电位依赖的探针，能够染色活细胞中的线粒体，同时也能被保留在细胞经历过固定的过程，典型的探针如Mito Tracker Green，它可用于检测线粒体质量，该指标能体现线粒体形态完整性，但该探针无法体现线粒体膜电位去极化的变化，同时在流式细胞仪上进行检测时，该探针检测的荧光值与线粒体质量关系不明确，例如不同的探针浓度，不同的仪器状态等都会影响探针在仪器上的荧光值。因此，开发一种能同时检测线粒体膜电位和质量的探针，联合评估线粒体的功能，更能体现细胞真实的状态，对于线粒体的检测具有重要的意义。
发明内容
因此，本发明提供一种同时检测细胞内线粒体膜电位和质量的探针，其结构式为：
本发明提供一种同时检测细胞内线粒体膜电位和质量的探针的合成方法，具体包括以下步骤：
S10：将化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氢氧化钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，反应得到A1；
S20：将化合物M1溶于氯甲烷中，闷罐反应，得到M2；
S30：将3-二甲氨基丙烯醛溶于乙腈中，冰浴下，滴加三氯氧磷，搅拌，混合液冰浴下滴加至M2的乙腈溶液中，反应得到M3；
S40：将M3、A1溶于甲苯、 N-甲基吡咯烷酮溶液中，反应得到M4；
S50：将M4溶于甲醇中，分批加入NaBH4，淬灭，过滤，析出固体，过滤，烘干滤饼，得到M5；
S60：将M5、三苯基膦、四氯化碳溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌，粗品经C18液相纯化得到目标产品TM；
其中A、A1、M1、M2、M3、M4、M5、TM的结构式分别为：
进一步地，步骤S10的反应条件为在80°C下反应6小时，过滤，萃取，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩，粗品经过柱层析得到A1。
进一步地，步骤S30的反应条件为升至室温反应4小时，加水淬灭反应，加入氢氧化钠水溶液，析出固体，过滤。
进一步地，步骤S10中化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氢氧化钠的质量比为1：（1~2）：（0.5~1）。
进一步地，步骤S30中3-二甲氨基丙烯醛和三氯氧磷的质量比为1：（1~2）。
进一步地，步骤S40中M3和A1的质量比为1：（0.5~1.5），甲苯溶液和N-甲基吡咯烷酮溶液的体积比为2:1。
进一步地，步骤S50中M4和NaBH4的质量比为（2~3）：1。
进一步地，步骤S60中M5、三苯基膦和四氯化碳的质量比为3：（1~2）：（1~2）。
综上所述，本申请上述各个实施例可以具有如下一个或多个优点或有益效果：
1.本发明的荧光探针是一种有机小分子荧光探针，其中荧光基团设计有共轭大π键，数量大于6个以上；具备阴离子基团，以与线粒体膜电位的结合；合成的亚甲基基团，能于蛋白结合。
2.本发明的荧光探针在流式细胞仪上检测线粒体膜电位时，仅表现同一区段的激发波长范围，可以在同一荧光通道中检测。
3.本发明的荧光探针可以同时检测线粒体的膜电位和质量情况，实现一次性检测两种指标从而联合评估线粒体的功能，更能体现细胞真实的状态，对于线粒体的检测具有重要的意义。
4.使用本发明的荧光探针检测免疫细胞时可对免疫细胞的代谢状态做到预测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明实施例1中所用抗体CD45群中淋巴细胞群检测图；
图2为本发明实施例1中TM荧光探针检测淋巴细胞群的结果；
图3为本发明实施例1中JC-1探针检测淋巴细胞群的结果；
图4为本发明实施例1中未使用CCCP处理时淋巴细胞的含量：
图5为本发明实施例1中未使用CCCP处理时TM荧光探针的检测结果；
图6为本发明实施例1中未使用CCCP处理时JC-1探针的检测结果；
图7为本发明实施例1中未使用CCCP处理时Mito Tracker Green探针的检测结果；
图8为本发明实施例1中使用CCCP处理时淋巴细胞的含量；
图9为本发明实施例1中使用CCCP处理时TM荧光探针的检测结果；
图10为本发明实施例1中使用CCCP处理时JC-1探针的检测结果；
图11为本发明实施例1中使用CCCP处理时Mito Tracker Green探针的检测结果；
图12为本发明实施例1中通过肘方法降维至3个特征参数图；
图13是本发明实施例1中聚类分析显示图；
图14为本发明实施例2检测得到的结果图；
图15为本发明实施例3检测得到的结果图；
图16为本发明实施例4检测得到的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【实施例1】
1.TM荧光探针的制作：
实验具体流程如下所示
S10：将1gA，1.39g 4-氯甲基苯甲酸甲酯，0.753g氢氧化钠溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，80°C反应6小时，过滤，反应液置于60mL水和40mL乙酸乙酯中，萃取，无水硫酸钠干燥有机相，浓缩，粗品经柱层析得到无色油状物A1。
S20：将1gM1溶于10mL氯甲烷中，50°C闷罐反应4天，过滤，40mL乙酸乙酯洗涤滤饼，烘干得到白色固体M2。
S30：将0.625g 3-二甲氨基丙烯醛，溶于5mL乙腈中，冰浴下，滴加0.93g三氯氧磷，搅拌10分钟，完毕，混合液冰浴下滴加至1g M2的5mL乙腈中；滴毕，升至室温反应4小时，滴加4mL水淬灭反应，加入5M氢氧化钠水溶液，析出固体，过滤，得到白色固体M3。
S40：将1g M3，0.87g A1溶于10mL甲苯，5mL N-甲基吡咯烷酮，120°C搅拌4小时，反应完毕，过滤，滤饼20mL二氯甲烷洗涤，得浅绿色固体M4。
S50：将1gM4溶于10mL甲醇中，分批加入0.35g NaBH4，反应完毕，加入饱和氯化铵淬灭，过滤，加入20mL乙酸乙酯析出固体，过滤，滤饼烘干，得黄色固体M5。
S60：将1gM5，0.52g三苯基膦，0.65g四氯化碳溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌12小时，反应完毕，粗品经C18液相纯化得目标产品TM。
2.样本染色标记操作
S10：抗体试剂与血液样本（50~100μL）染色标记，室温下孵育15分钟；
S20：使用1×不含固定剂的裂解液（500μL~1mL）对样本进行裂解，室温下孵育15分钟；
S30：室温下离心，300g离心5分钟，其余上清；
S40：室温PBS（25μL~50μL）重悬样本，并加入至探针中（浓度在0.001μg~0.01μg），37℃下孵育30分钟；
3.TM荧光探针的准确性
S10：在同一发射波长区段与JC-1（流式细胞仪上应用广泛）探针进行比较，得到图1、图2和图3。所用的是图1显示的抗体CD45群中的淋巴细胞。图2 为TM荧光探针检测淋巴细胞群的结果，M11-1代表低膜电位线粒体细胞，M11-2代表高膜电位线粒体细胞，所得不同线粒体膜电位细胞群占比M11-2/M11-1 = 56.76%/43.24% = 1.31。图3为JC-1探针检测淋巴细胞群的结果，Q10-4代表低膜电位线粒体细胞，Q10-2代表高膜电位线粒体细胞，所得不同线粒体膜电位细胞群占比Q10-2/Q10-4 = 58.49%/41.37% = 1.41。以JC-1为对照，TM荧光探针与JC-1的相对偏差为7.1%。
S20：使用TM荧光探针同时检测线粒体膜电位和线粒体质量，与JC-1和Mitotracker Green探针的检测结果进行比较。图4、图5、图6、图7是未使用CCCP（羰基氰氯苯腙，一种去膜极化物质）处理的情况，图8、图9、图10、图11是使用CCCP处理的情况。由图可知，在使用CCCP后，依赖于膜电位的JC-1探针从聚集状态下降为单体状态，TM荧光探针低膜电位位置有降低，但整体呈现“高膜电位”状态，与非膜电位依赖的Mito Tracker Green对比，荧光强度值位置基本不变。
4.TM荧光探针的应用
将TM荧光探针应用在流式细胞仪中，检测免疫细胞的线粒体膜电位去极化变化和线粒体质量，预测免疫细胞的代谢状态。
S10：采集不同临床表现阶段的样本，有正常体检样本，肿瘤初诊、肿瘤治疗及预后观察等样本，感染初诊及感染治疗过程中样本，共2608例不同代谢表现线粒体样本。
S20：使用无监督学习的K-means聚类算法和PCA主成分分析算法，对免疫细胞群百分比，绝对计数及线粒体膜电位及质量参数结构进行分析。以下是PCA及Kmeans算法分析的部分算法代码（基于Python）：
import numpy as np
import pandas as pd
import matplotlib.pyplot as plt
data1 = pd.read_csv('……') #导入原始数据
data_Mito = data1.dropna() # 删除空白行的数据
data_Mito_0 = data_Mito[data_Mito['CD45+Lymph Count']>=1000] # CD45+Lymph 大于等于1000的数据
data_Mito_Del = data_Mito[data_Mito['CD45+Lymph Count']<1000] # CD45+Lymph 小于1000的数据
train = data_Mito_0 # 数据结构检查
print(train.isnull().any())
print(train.isna(train).any())
data_Mito_0.describe() #数据特征值预览
data_Mito_0.iloc[:,5:].hist(figsize=(15,15)) # 直方图统计
#将多个维度的数据，利用ZIP函数和LIST函数转化为多维数组，便于后续PCA降维，聚类分析
data_MitoDyeMD01_1 = np.array(list(zip(data_MitoDyeMD01_0['CD3+ %Parent'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+Median CD3-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+Median MitoDyeMD01-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD4+ % Parent'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD4+ Median CD4-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD4+ MedianMitoDyeMD01-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD8+ Median CD8-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD8+ Median MitoDyeMD01-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD8+ % Parent'],data_MitoDyeMD01_0['CD3- Median CD3-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD4- MedianCD4-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD3+CD8- Median CD8-H'],data_MitoDyeMD01_0['StainIndex CD3-H'],data_MitoDyeMD01_0['Stain Index CD4-H'],data_MitoDyeMD01_0['Stain Index CD8-H'],data_MitoDyeMD01_0['CD4/CD8\n%'],data_MitoDyeMD01_0['CD4/CD8\nMitoDyeMD01'])))
from sklearn.cluster import KMeans
from sklearn.decomposition import PCA
from scipy.spatial.distance import cdist
# 导入 Kmeans and PCA 模块
# 肘方法看K值
data_Mito_Test = data_mito_1[:,:-1]
d= []
for i in range(1,21):
km = KMeans(n_clusters=i,n_init=10,max_iter=300,random_state=0)
km.fit(data_Mito_Test)
d.append(km.inertia_)
plt.plot(range(1,21),d,marker='o')
plt.xlabel('number of clusters')
plt.ylabel('distortions')
plt.show()
S30：分析结果如图12、图13所示。其中图12是通过肘方法降维至3个特征参数所得。图13是聚类分析显示，样本群呈现四种分群，其中正常及恢复期样本落在紫色和黄色群，肿瘤初诊及复发样本落在绿色群，感染初诊样本落在黄色和蓝色区域。通过这个指标并结合免疫细胞百分比和绝对计数值可以对免疫细胞的代谢状态做出预测。
【实施例2】
1.TM荧光探针的制作：
S10：将1gA，1g 4-氯甲基苯甲酸甲酯，0.5g氢氧化钠溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，80°C反应6小时，过滤，反应液置于60mL水和40mL乙酸乙酯中，萃取，无水硫酸钠干燥有机相，浓缩，粗品经柱层析得到无色油状物A1。
S20：将1gM1溶于10mL氯甲烷中，50°C闷罐反应4天，过滤，40mL乙酸乙酯洗涤滤饼，烘干得到白色固体M2。
S30：将0.5g 3-二甲氨基丙烯醛，溶于5mL乙腈中，冰浴下，滴加0.5g三氯氧磷，搅拌10分钟，完毕，混合液冰浴下滴加至1g M2的5mL乙腈中；滴毕，升至室温反应4小时，滴加4mL水淬灭反应，加入5M氢氧化钠水溶液，析出固体，过滤，得到白色固体M3。
S40：将1g M3，0.5g A1溶于10mL甲苯，5mL N-甲基吡咯烷酮，120°C搅拌4小时，反应完毕，过滤，滤饼20mL二氯甲烷洗涤，得浅绿色固体M4。
S50：将1gM4溶于10mL甲醇中，分批加入0.33g NaBH4，反应完毕，加入饱和氯化铵淬灭，过滤，加入20mL乙酸乙酯析出固体，过滤，滤饼烘干，得黄色固体M5。
S60：将1gM5，0.33g三苯基膦，0.33g四氯化碳溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌12小时，反应完毕，粗品经C18液相纯化得目标产品TM。
2.对检测样本进行染色标记操作：
抗体试剂选择T细胞特异性抗体，其余操作如实施例1中进行。
3.检测抗体试剂
上机检测，使用的流式细胞仪需要包括（488nm和640nm激光器），得到图14所示数据，进行分析。
【实施例3】
1.TM荧光探针的制作：
S10：将1gA，2g 4-氯甲基苯甲酸甲酯，1g氢氧化钠溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，80°C反应6小时，过滤，反应液置于60mL水和40mL乙酸乙酯中，萃取，无水硫酸钠干燥有机相，浓缩，粗品经柱层析得到无色油状物A1。
S20：将1gM1溶于10mL氯甲烷中，50°C闷罐反应4天，过滤，40mL乙酸乙酯洗涤滤饼，烘干得到白色固体M2。
S30：将0.5g 3-二甲氨基丙烯醛，溶于5mL乙腈中，冰浴下，滴加1g三氯氧磷，搅拌10分钟，完毕，混合液冰浴下滴加至1g M2的5mL乙腈中；滴毕，升至室温反应4小时，滴加4mL水淬灭反应，加入5M氢氧化钠水溶液，析出固体，过滤，得到白色固体M3。
S40：将1g M3，1.5g A1溶于10mL甲苯，5mL N-甲基吡咯烷酮，120°C搅拌4小时，反应完毕，过滤，滤饼20mL二氯甲烷洗涤，得浅绿色固体M4。
S50：将1gM4溶于10mL甲醇中，分批加入0.5g NaBH4，反应完毕，加入饱和氯化铵淬灭，过滤，加入20mL乙酸乙酯析出固体，过滤，滤饼烘干，得黄色固体M5。
S60：将1gM5，0.66g三苯基膦，0.66g四氯化碳溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌12小时，反应完毕，粗品经C18液相纯化得目标产品TM。
2.对检测样本进行染色标记操作：
抗体试剂选择B细胞特异性抗体，其余操作如实施例1中进行。
3.检测抗体试剂
上机检测，得到图15所示数据，进行分析。
【实施例4】
1.TM荧光探针的制作：
具体操作如实施例1中所示。
2.对检测样本进行染色标记操作：
抗体试剂选择NK细胞特异性抗体，其余操作如实施例1中进行。
3.检测抗体试剂
上机检测，得到图16所示数据，进行分析。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种同时检测细胞内线粒体膜电位和质量的探针，其特征在于，结构式为：
2.一种同时检测细胞内线粒体膜电位和质量的探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：将化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氢氧化钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，反应得到A1；
S20：将化合物M1溶于氯甲烷中，闷罐反应，得到M2；
S30：将3-二甲氨基丙烯醛溶于乙腈中，冰浴下，滴加三氯氧磷，搅拌，混合液冰浴下滴加至M2的乙腈溶液中，反应得到M3；
S40：将M3、A1溶于甲苯、 N-甲基吡咯烷酮溶液中，反应得到M4；
S50：将M4溶于甲醇中，分批加入NaBH4，淬灭，过滤，析出固体，过滤，烘干滤饼，得到M5；
S60：将M5、三苯基膦、四氯化碳溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌，粗品经C18液相纯化得到目标产品TM；
其中A、A1、M1、M2、M3、M4、M5、TM的结构式分别为：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S10中的反应条件为在80°C下反应6小时，过滤，萃取，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩，粗品经过柱层析得到A1。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S30中的反应条件为升至室温反应4小时，加水淬灭反应，加入氢氧化钠水溶液，析出固体，过滤。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S10中所述化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氢氧化钠的质量比为1：（1~2）：（0.5~1）。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S30中所述3-二甲氨基丙烯醛和所述三氯氧磷的质量比为1：（1~2）。
7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S40中所述M3和所述A1的质量比为1：（0.5~1.5），所述甲苯溶液和所述N-甲基吡咯烷酮溶液的体积比为2:1。
8.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S50中所述M4和所述NaBH4的质量比为（2~3）：1。
9.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤S60中所述M5、三苯基膦和四氯化碳的质量比为3：（1~2）：（1~2）。
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