CN113278627B - 一种调控苹果果形和大小的基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于苹果分子遗传育种技术领域，公开了一种调控苹果果形和大小的基因及应用，所述调控苹果果形和大小的基因为MdERECTA基因，所述MdERECTA基因的gDNA序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过对297份苹果种质成熟果实进行果实纵横径、果重和果形指数进行测定，丰富苹果品质种质资源库；通过对果实大小变异丰富的自然群体进行GWAS分析，鉴定果实大小调控的关键基因MdERECTA；通过对MdERECTA基因的功能研究有助于了解苹果果实果形和大小的进化规律和调控机制，对研究高品质苹果选育具有重要意义。

Description

一种调控苹果果形和大小的基因及应用

技术领域

本发明属于苹果分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种调控苹果果形和大小的基因及应用。

背景技术

目前，苹果作为我国园艺作物中重要的果树之一，苹果果实的形状和大小往往是消费者评价苹果品质最重要的参数之一。同时，根据水果的分级标准，畸形果往往会被淘汰，所以果实外观品质问题制约着我国许多产业地区苹果质量，培育果实个头大、形状好的果实是目前产业中急需的。苹果在我国分布范围广泛，资源极其丰富，在果实形状、大小、色泽等方面表现出极为丰富的遗传多样性。但是苹果果实形状和大小会受到很多因素的影响，进而影响苹果产量。

苹果果实的果形和果重都属于多基因控制的数量性状。

杂交后代的果形指数接近于双亲果形指数的平均值，但是会受到温度、水分、光照、位置等环境因素的影响。如苹果花后气温降低，会导致果实变长，果形指数变大。生产上使用赤霉素和细胞分裂素按一定比例混合的拉长剂能有效提高果实果形指数。Sun等利用红玉和金冠的杂交F1代进行QTL(Mapping Quantitative Trait Loci)定位和集群分离分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)分析，确定了5个与果形指数相连锁的分子标记，分别位于红玉的LG11，LG12，LG13和金冠的LG10上，其中红玉的LG11上存在两个主基因位点。常源升则进一步利用SSR和SNP技术对该F1群代进行QTL分析，并确定了果形指数相关基因14个。

果实重量可以作为衡量果实大小的指标。刘志等对富士的12种杂交组合后代果实单果重进行统计发现，12个杂交组合的平均单果重都低于亲本中值。皇家嘎啦和藤牧一号的杂交后代果实单果重同样呈现多基因控制的数量性状遗传，但是杂种后代果实单果重表现出向大果型方向遗传的趋势，表明可能存在加性效应与非加性效应。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：相对于模式植物或者一二年生植物，多年生果树的果实形状和大小的研究和报道较少，主要原因在于果树杂合程度高，研究周期长，并且易受到环境等众多因素影响。此外，材料的匮乏也限制了苹果果实大小和形状相关调控基因的挖掘。因此，亟需寻找一种快速有效确定果实果形和大小相关基因的方法。

解决以上问题及缺陷的难度为：苹果属于多年生果树，并且高度杂合，常规的遗传育种技术生产周期极长，并且不一定能够获得预期的目标性状，从而有浪费人力物力的可能。

解决以上问题及缺陷的意义为：通过对大量的苹果种质资源进行调查研究并进行全基因组测序，能够快速确定果实性状相关的基因，进而针对相关基因进行研究，从而大大缩短分子遗产育种的周期，并且为以后苹果其他性状的研究提供了理论依据和研究基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控苹果果形和大小的基因及应用。

本发明是这样实现的，一种调控苹果果形和大小的基因，所述调控苹果果形和大小的基因为MdERECTA基因，所述MdERECTA基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的调控苹果果形和大小的基因的利用全基因组关联分析鉴定果实大小和性状相关基因的方法，所述利用全基因组关联分析鉴定果实大小和性状相关基因的方法，包括：

提取不同品种苹果叶片DNA，进行全基因组测序和SNP分析，利用全基因组关联分析鉴定关键位点和基因。

进一步，所述利用全基因组关联分析鉴定果实大小和性状相关基因的方法，还包括：

选取297种苹果品种，在各个品种果实完全成熟的时候，摘取果实称重和测量果实纵横径，并计算果实果形指数；摘取各个品种的叶片利用CTAB法提取DNA，交付给测序公司进行全基因组测序；进行全基因组关联分析，根据关联分析定位到与果实纵横径相关的位点，进而对其中位点上存在的一个基因进行验证。

进一步，所述对位点上存在的基因进行验证，包括：

将所述MdERECTA基因进行番茄植株的转化，验证MdERECTA基因在生产实践上的可行性。

本发明的另一目的在于提供一种所述的调控苹果果形和大小的基因在果实果形研究中的应用。

进一步，所述调控苹果果形和大小的基因在果实果形研究中的应用，包括：

所述调控苹果果形和大小的基因在果实纵径、横径、果重和果形指数中的应用。

进一步，所述苹果果形和大小的调控方法，包括：

在番茄植株中超量表达MdERECTA基因来提高果实重量并提高果实纵横径和果形指数。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明通过对297份苹果种质成熟果实进行果实纵横径、果重和果形指数进行测定，鉴定了一批果实大小显著差异的苹果种质材料，丰富了苹果品质种质资源库。GWAS分析能有效的鉴定数量性状的遗传调控位点。因此，本发明克服现有材料和技术的缺点，通过对果实大小变异丰富的自然群体进行GWAS分析，鉴定果实大小调控的一个关键基因MdERECTA；通过对MdERECTA基因的功能研究有助于进一步了解苹果果实果形和大小的进化规律和调控机制，对研究高品质苹果选育具有重要意义，同时提供了一种快速确定苹果性状相关基因的方法。

本发明揭示了苹果自然群体中果实具有遗传多样性，为苹果改良育种提供了材料基础。

本发明提供了一种SNP鉴定并关联分析的方法。

本发明通过GWAS关联分析快速有效的鉴定果实大小相关调控基因。

MdERECTA基因的鉴定提供了一种调控果实形状和大小的机制。

为进一步验证MdERECTA基因在生产实践上的可行性，本发明通过对MdERECTA基因进行番茄植株的转化，结果显示，超表达MdERECTA基因可以显著提高番茄果实重量和果形指数。因此，该GWAS关联分析技术确定的MdERECTA基因应用具有可行性，并且其应用将有助于实现苹果果实形态改良，提高苹果单位面积产量，从而提高苹果外观品质改良育种效率。

实验结果说明，苹果MdERECTA基因能够正向调控果实大小和果重，并且在苹果品种驯化过程中发挥重要作用，但由于苹果果实大小和果重是多基因控制的数量性状，且受到环境影响，MdERECTA基因对果实大小的调控可能还受到其他因素的制约。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍。需要注意的是，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的苹果果实的纵径、横径的全基因组关联分析示意图。

图1(a)是本发明实施例提供的果实纵径GWAS的曼哈顿图。

图1(b)是本发明实施例提供的果实纵径GWAS的Quantile-quantile示意图。

图1(c)是本发明实施例提供的果实横径GWAS的曼哈顿图。

图1(d)是本发明实施例提供的果实横径GWAS的Quantile-quantile示意图。

图1(e)是本发明实施例提供的15号染色体定位到的基因MdERECTA示意图。

图2是本发明实施例提供的不同位点SNP确定的大小果统计结果示意图。

图3是本发明实施例提供的转基因MdERECTA番茄的功能验证示意图。

图3(a)是本发明实施例提供的番茄果实纵径、横径统计结果示意图。

图3(b)是本发明实施例提供的番茄果形指数统计结果示意图。

图3(c)是本发明实施例提供的番茄平均单果重结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控苹果果形和大小的基因及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的调控苹果果形和大小的基因为MdERECTA基因，所述MdERECTA基因的gDNA序列cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明实施例提供的利用全基因组关联分析鉴定果实大小和性状相关基因的方法包括：提取不同品种苹果叶片DNA，进行全基因组测序和SNP分析，利用全基因组关联分析鉴定关键位点和基因，基因的功能验证。具体包括：

选取297份苹果品种，在各个品种果实完全成熟的时候，摘取果实称重和测量果实纵横径，并计算果实果形指数；摘取各个品种的叶片利用CTAB法提取DNA，交付给测序公司进行全基因组测序；进行全基因组关联分析，根据关联分析定位到与果实纵横径相关的位点，进而对其中位点上存在的一个基因进行功能验证；

其中，对位点上存在的基因进行验证包括：将所述MdERECTA基因进行番茄植株的转化，验证MdERECTA基因在生产实践上的可行性。

本发明中涉及的基因或化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：MdERECTA基因的鉴定

本发明利用297份全球范围收集的苹果种质资源，采用GWAS技术确定果实纵横经关联的基因主要集中在15号染色体上，关联并克隆果实大小的关键基因MdERECTA。该基因是一个富含亮氨酸的受体样蛋白激酶，其DNA区域存在7个SNP位点。通过在番茄中超表达基因可以显著提高果实的纵横径。

本发明通过对297份苹果种质资源进行调查发现，果实纵径最大的为88.198mm，最小的为7.518mm；横径最大的为75.987mm，最小的为7.709mm。计算果形指数发现果形指数最大的为1.24，最小的为0.56，果实果形之间的变异幅度较大。野生资源果实偏小，栽培资源果实偏大，符合苹果驯化趋势。自然群体果实纵横径和果形指数呈现连续性分布，符合正态分布。这些结果表明果实大小是典型的数量性状，并且是由微效多基因控制。

本发明中，发明人收集297份苹果资源，同时测定各个资源成熟果实的纵横径。采用常规CTAB法从各个资源叶片中提取DNA，根据NEBNext Ultra DNA library Prep Kit(NEB Inc.，America)说明书，每个样本中使用至少5μg基因组DNA构建测序文库，并利用Illumina HiSeq4000测序仪进行测序。将测序结果与苹果参考基因组GDDH13(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/)进行比对，进行SNPs的鉴定和注释。全基因组关联分析发现纵径或者横径都在15号染色体上出现强关联度(见图1a,图1c)，并鉴定出存在多个SNP位点的候选基因MdERECTA。

调控苹果果实大小的MdERECTA基因其cDNA序列见SEQ ID NO.1所示。

本发明使用Mckenna等开发的HaplotypeCaller(GATK(version3.3-0-g37228af))检测SNP变异，利用R语言中Genomic Association and Prediction Integrated Tool包进行关联分析，采用混合线性模型MLM、一般线性模型GLM、多基因座混合线性模型MLMM和压缩混合线性模型CMLM等多个模型进行GWAS研究。SNP与性状关联的阈值利用Bonferroni校正。运用Wang等开发的ANNOVAR软件包将SNPs进行注释。应用CMplot包绘制得到曼哈顿图和QQ图。

本发明中证明果实纵径、横径两种性状均能强关联到15号染色体上，并且都能定位到MdERECTA基因(见图1)。其中位于MdERECTA基因DNA区域的两个SNP位点能够划分大小果群体(见图2)。

实施例2：目标基因相关生物学功能鉴定

为探究MdERECTA基因与果实大小的关系，本实施例从苹果中克隆了MdERECTA基因，并构建了35s启动子驱动的MdERECTA基因超表达载体pGWB414-MdERECTA。超表达载体构建如下所述。

超表达载体构建方法如下：本发明利用Gateway系统进行载体构建，在MdERECTA基因的上下游引物5’段分别加上BP/LR序列，然后进行PCR扩增。MdERECTA基因克隆所述引物：正向引物5’-atggggtttgatgagactgc-3’，反向引物：5’-tcactcactgttctgagatattacc-3’。Gateway系统所用引物：正向引物：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatggggtttgatgagactgc-3’，反向引物：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcactcactgttctgagatattacc-3’。扩增体系如下：

将PCR产物进行胶回收，然后利用BP反应将胶回收产物连接到pDONOR222载体。BP反应体系：胶回收产物(75ng/μL)1μL，pDONOR222质粒1μL，BP酶1μL，TE buffer 3μL，25℃孵育3h。

将BP反应产物加入到50μL的大肠杆菌感受态中，电击转化后，加入400μL的空白LB，37℃摇床复苏1h，5000rpm离心1min，保留100μL菌液均匀涂布在含有50mg/Lkana的LB固态培养基，37℃培养箱培养16h后挑单克隆于含有50mg/LKanamycin的液体LB中，37℃摇床培养8h，经菌液PCR检测，呈正确条带的菌液送公司测序，利用DNAman软件(LynnonBiosoft.,USA)比对，测序正确的菌液提取质粒，进行下一步酶切试验。

用Nru I对质粒进行酶切破坏载体Kanamycin抗性，酶切体系如下：Nru I1μL，5×Cutsmart buffer 5μL，质粒(100ng/μL)10μL，ddH₂O 34μL。将酶切产物进行胶回收，取1μL胶回收产物和pGWB414载体质粒进行LR反应，反应体系如下：胶回收产物(75ng/μL)1μL，pGWB414质粒(75ng/μL)1μL，LR酶1μL，TE buffer 3μL，25℃孵育3h。

将LR反应产物加入到50μL的大肠杆菌感受态中，电击转化后，加入400μL的空白LB，37℃摇床复苏1h，5000rpm离心1min，保留100μL菌液均匀涂布在含有50mg/Lkana的LB固态培养基，37℃培养箱培养16h后挑单克隆于含有50mg/LKanamycin的液体LB中，37℃摇床培养8h，经菌液PCR检测，呈正确条带的菌液送公司测序，利用DNAMAN软件比对，测序正确的菌液提取质粒，将质粒交付给公司进行番茄遗传转化，使用番茄品种为AC(S.lycopersicumMill.cv.Ailsa Craig)。

超表达MdERECTA基因后，转基因番茄果实的纵径、横径、果形指数和重量相较于野生型都显著增加(见图2)。

果形指数计算方法：果形指数＝纵径/横径。

结果说明苹果MdERECTA基因能够正向调控果实大小和果重，并且在苹果品种驯化过程中发挥重要作用，但由于苹果果实大小和果重是多基因控制的数量性状，且受到环境影响，MdERECTA基因对果实大小的调控可能还受到其他因素的制约。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种调控苹果果形和大小的基因及应用

<160> 1

<210> 1

<211> 2976

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggtttgatgagactgcagttgtggcagttcgggtggagtttgtgcttctggttcttctgcttgggtgtatgagcttcggctatggggattcacagaacgatcaaggaacactgctggagataaagaaggcatttagggatgtggacaatgttctctatgaatggacagacccaccctctttagattattgtgtttggagaggcgtcacatgtgataactctctcaatgtcattgcacttaatctatcgggtttgaatcttggaggggaaatctcatctgtaataggggatctcgaaaacctccagtctatcgatttgagggggaaccacctatccggccagatcccagatgagattggtgactgttcggctctgcaaaacattgacttgtccttcaatgagatatttggagacataccattttcgatatccaagttaaaacagctggaaaatctgattttgaaaaataatcaattgattggtccacttccttcgacgttgtcccagattccgaatctgaagattttagacctagcacagaataatctcactggggaaataccaaggcttatatactggaatgaagttctacagtatcttggtttgcgagggaacaatttagtcggaaccctttctccagatatgtgccagttgactgggttatggtattttgatgtgcgaaacaacagtttgaccggtagcattcctcaaaatatagggaactgcactgctttccaggttttggatctgtcctacaaccagctaactggagagattccatttaatatcgggttcctgcaagtagccaccttatcattacaaggtaatcaactttctgggccaatcccatctgtgatcggcctaatgcaggctctcgctgtattggatttgagcagcaacgcgttaagtggatcgatccctcctatcctggggaatttgacttatacagagaaattgtatttgcatggtaacaagcttaatggatccattcccccagagcttggacagatgacaaagctacattatttggaattgaacgataaccatcttacgggatatattccacctgaacttgggaagcttacggatttgtatgacctaaacgttgcgaacaactatcttcaagggcccattcctgataatcttagttcgtgtacaaatctgaacagcctcaatgtgcatgggaacaagttgaatggaaccattccgcctgctcttcagaggctcgagagtatgacttatctaaatctatcctccaaccatcttcgtggcccaattcctatcgagctgtctcggattggtaacttggatactttggatatttcaaataacaaactaagtggaaccattccttcatcacttggggatttggaacatcttttaaagctgaatttgagtcgaaaccatttgacgggatttattccaggggagtttggtaatttaaggagtgttatggaaatagacctttcaagtaatcagctcacgggattaattcctcaagagctcagtcagctgcagaacatgaatttattgagattagaccacaacaatatatccggggatgtggtatcgctgataaactgcttcagcctttctgtattaaatgtatcttacaacaacttggcaggcgatattcccacgagcaagaacttctcaaggttttcaccagacagttttattggaaaccctgatctttgtggctattggctcaattctcgatgtcatgagtctcgtccaacagagcgagtgacactatctaaagctgctatcctgggaatcgctcttggtgcccttgtgattcttctcatgattcttgttgctgcatgcaggccatataatccaactccctttcctgacggtacatttgacaaaccagttaattactcaactccgaagctggtgatccttaacatgaatatggcacttcatgtatacgaggacatcatgaggatgaccgaaaacttgagcgagaagtatataattggttatggtgcatcgagtacagtgtacaaatgtgttctgaaaaattgtaagccagtggctatcaagaaactttactcgcactatcctcagtgcatgaaggagtttgagactgaacttgcgacagttggaagcatcaagcatcggaatctggtgaccctccaggggtactccttgtcttcctccggaaaccttctcttttacgattacatggaaaatggcagtctctgggatctccttcacggcccttccaagaagaaaaagctcgactggacaactcgtctccagattgcccttggaacagcccaagggcttgcctacctgcatcatgattgcagccccagaatcatacaccgggatatcaagtcgtccaacattctactggacaaggattttgaagctcatttaactgatttcggcattgccaagaacttatgcccctcaaagacccatacgtctacttacataatgggcacgattggctatatagatcctgagtatgcgagaacgtcacgcctcactgagaagtccgatgtgtatagttacggcattgttctgctggagctgctgacgggaaggaaagccgtagacaatgaatccaatctccatcatttgatattatctaagacggcaaacaatgctgtcatggaaaccgtagattctgacgtcacggccacatgcacggacctcggagcagtaaagaaggttttccagcttgcccttctgtgcacaaagcggcagccaacagaccggccaacaatgcatgaagtaactcgcgtgctggggagtctcgtgccttcccctgcaccaccaaaacaaccagcctccgccaacccaccatcgacacaacacccgtctgccaaagcgccgtgctacgtggacgagtacgcgaatctcaaaacgccgcacatgctaaattgtccatccatgagcacctcagatgcccagctgtttctcaagtttggagaggtaatatctcagaacagtgagtga

Claims (1)

1.MdERECTA基因在提高番茄果实纵径、横径、果重和果形指数中的应用，其特征在于，所述应用为在番茄植株中超量表达，MdERECTA基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

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