CN113274493A - 介孔二氧化硅纳米颗粒联合pd-1抗体在制备抗肿瘤及增敏药物中的应用 - Google Patents

介孔二氧化硅纳米颗粒联合pd-1抗体在制备抗肿瘤及增敏药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD‑1抗体在制备抗肿瘤及增敏药物中的应用，介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为45nm、65nm和100nm，长径比为3:1、4:1和8.5:1，MSNs联合PD‑1抗体在抑制肿瘤复发中得以应用；本发明的MSNs能够克服肿瘤对PD‑1抗体的耐药性，增敏了PD‑1抗体的治疗效果，这种联合治疗的方法能够有效抑制肿瘤的生长和复发，并且没有明显毒性作用，且治疗效果与MSNs的尺寸和形貌相关，呈现粒径和长径比依赖性；MSNs能够克服肿瘤对PD‑1抗体的耐药性，为MSNs以及其他纳米材料在肿瘤免疫治疗中的潜在应用提供了理论基础，为进一步开发新型纳米药物提供了科学依据。

Description

介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备抗肿瘤及增敏药 物中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备抗肿瘤及增敏药物中的应用。
背景技术
近年来，肿瘤免疫治疗作为备受关注的创新肿瘤治疗方案，已成为与手术、化疗和放疗并列齐驱的第四种肿瘤治疗方法。其中，PD-1抗体疗法作为代表性的肿瘤免疫治疗方法，在临床应用中展现出了显著的治疗效果。目前经美国食品药品管理局批准上市的抗PD-1单抗药物有多种，包括纳武利尤单抗(Nivolumab)和帕博利珠单抗(Pembrolizumab)。抗PD-L1单抗药物有3种，分别为阿特朱单抗(Atezolizumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)和阿维鲁单抗(Avelumab)。PD-1抗体在临床上的适应症较广，可用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、肝癌、宫颈癌、肾细胞癌、胃癌、头颈癌、梅克尔细胞癌、尿路上皮癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤和微卫星高度不稳定性的任何癌症。
尽管PD-1抗体展现出前所未有的持久应答率，但是仍有大多数患者并没有从治疗中受益。有些患者从一开始就不响应治疗(原发性耐药)；有些患者刚开始响应治疗，经过一段时间后肿瘤会重新进展(继发性耐药)；有些患者治疗初期肿瘤进展，但是持续治疗后，肿瘤会变小(假进展)；有些患者肿瘤非但没有变小，随着治疗反而增大(超进展)。几种常见的癌症类型显示出非常低的响应频率(乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)，同一肿瘤的不同个体对PD-1抗体治疗的响应频率也不同。
以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点信号通路是肿瘤发生免疫逃逸的主要机制之一。尽管PD-1抗体在多种肿瘤的临床治疗中都取得了巨大的成功，但仍有一部分患者由于原发性或获得性耐药而无法从中受益，急需发展新的技术和方法以进一步增强PD-1抗体的临床响应率，增强PD-1抗体的抗肿瘤效果。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。基于PD-1抗体耐药的多种肿瘤细胞构建PD-1抗体耐药的小鼠皮下肿瘤模型，经非功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silicananoparticles,MSNs)联合PD-1抗体治疗后，增强机体的抗肿瘤效果。
本发明的目的之二是提供一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备增敏药物中的应用。
本发明的目的之三是提供一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在抑制肿瘤复发中的应用。
为达到目的之一，本发明的解决方案是：
一种介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)联合PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，介孔二氧化硅纳米颗粒包括球形介孔二氧化硅纳米颗粒和棒状介孔二氧化硅纳米颗粒。
优选地，球形介孔二氧化硅纳米颗粒的制备过程为：十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺反应，然后滴加四乙氧基硅烷继续反应，真空干燥得到。
优选地，球形介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为45nm、65nm和100nm。
优选地，棒状介孔二氧化硅纳米颗粒的制备过程为：十六烷基三甲基溴化胺和氨水反应，然后滴加四乙氧基硅烷继续反应，真空干燥得到。
优选地，MSNs的长径比为3:1、4:1和8.5:1。
为达到目的之二，本发明的解决方案是：
一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备增敏药物中的应用。
为达到目的之三，本发明的解决方案是：
一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在抑制肿瘤复发中的应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的MSNs能够克服肿瘤对PD-1抗体的耐药性，增敏了PD-1抗体的治疗效果，这种联合治疗的方法能够有效抑制肿瘤的生长和复发，并且没有明显毒性作用，且治疗效果与MSNs的尺寸和形貌相关，呈现粒径和长径比依赖性；另外，首次证明非功能化的MSNs(没有额外的功能设计)能够克服肿瘤对PD-1抗体的耐药性，为MSNs以及其他纳米材料在肿瘤免疫治疗中的潜在应用提供了理论基础，为进一步开发新型纳米药物提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明的MSNs的不同粒径(45nm、65nm和100nm)的扫描电镜(SEM)结构表征示意图。
图2为本发明的MSNs的不同粒径(45nm、65nm和100nm)的投射电镜(TEM)结构表征示意图。
图3为本发明的MSNs的不同长径比(3:1、4:1和8.5:1)的扫描电镜(SEM)结构表征示意图。
图4为本发明的MSNs的不同长径比(3:1、4:1和8.5:1)的投射电镜(TEM)结构表征示意图。
图5为本发明的不同粒径的MSNs联合PD-1抗体在不同肿瘤模型(B2m-sgRNAB16F10、H22和CT26)中的抗肿瘤情况。
图6为本发明的不同长径比的MSNs联合PD-1抗体在不同肿瘤模型(B2m-sgRNAB16F10、H22和CT26)中的抗肿瘤情况。
图7为本发明的MSNs联合PD-1抗体在不同肿瘤模型中抑制肿瘤复发的情况(H22肿瘤手术切除后，测量复发肿瘤的体积；CT26肿瘤手术切除后，测量复发肿瘤的体积；B2m-sgRNA B16F10肿瘤手术切除后，测量再接种肿瘤的体积)。
图8为本发明的MSNs联合PD-1抗体在不同肿瘤模型中抑制肿瘤复发率的情况(H22肿瘤手术切除后，测量肿瘤复发率；CT26肿瘤手术切除后，测量肿瘤复发率；B2m-sgRNAB16F10肿瘤手术切除并再接种新的B2m-sgRNA B16F10肿瘤，测量小鼠存活率)。
具体实施方式
本发明提供了一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备抗肿瘤及增敏药物中的应用。
1、介孔二氧化硅纳米颗粒的制备
1.1、合成球形介孔二氧化硅纳米颗粒：
1)2g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，Sigma-Aldrich)和0.01g三乙醇胺(TEA，国药集团化学试剂有限公司)混合在20mL去离子水中，混合溶液在室温下超声分散。
2)溶液放置于磁力搅拌器上，在80℃，300rpm条件下搅拌20min。
3)滴加1.5mL的四乙氧基硅烷(TEOS，国药集团化学试剂有限公司)继续搅拌4h。
4)冷却至室温，18000rpm离心20min收集产物。
5)乙醇和去离子水洗涤3次，10％的盐酸乙醇溶液在78℃下循环回流3次提取MSNs，用适量乙醇洗涤3次。
6)真空干燥获得100nm的球形介孔二氧化硅纳米颗粒的白色粉末。
通过改变TEA的量来合成不同粒径大小的球形介孔二氧化硅纳米颗粒。粒径为100nm、65nm和45nm分别对应0.01g、0.02g和0.06g TEA。
1.2、合成棒状介孔二氧化硅纳米颗粒：
1)0.2g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB，国药集团化学试剂有限公司)和0.7mL、85.5mmol/L的NH3·H2O混合在70mL去离子水中。
2)溶液放置于磁力搅拌器上，在30℃，450rpm条件下搅拌30min。
3)滴加1.5mL的四乙氧基硅烷继续搅拌4h。
4)冷却至室温，18000rpm离心15min收集产物。
5)乙醇、去离子水和乙醇分别洗涤3次，每次洗涤都在室温条件下超声20min，10％的盐酸乙醇溶液在78℃下循环回流3次提取MSNs。
6)真空干燥获得长径比为3:1的棒状介孔二氧化硅纳米颗粒的白色粉末。
通过改变CTAB和NH3·H2O的摩尔量来合成不同长径比(L/D：Length to diameterratio)的棒状介孔二氧化硅纳米颗粒。长径比为3:1、4:1和8.5:1分别对应8.0mmol/L、11.8mmol/L、23.6mmol/L的CTAB和85.5mmol/L、171.0mmol/L、171.0mmol/L的NH3·H2O。
通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜对介孔二氧化硅纳米颗粒进行结构表征。
2、构建B2m-sgRNA B16F10细胞
2.1、设计sgRNA：Control sgRNA：GCGAGGTATTCGGCTCCGCG；B2m sgRNA：AGTATACTCACGCCACCCAC。
2.2、构建lentiCRISPRv2-sgRNA表达载体：
1)取5μg的lentiCRISPRv2空载质粒，加入3μL FastDigestBsmBI(NEB)、3μLFastAP(Thermo Fisher Scientific)、6μL 10×FastDigest Buffer(Thermo FisherScientific)和0.6μL 100mmol/L现配的二硫苏糖醇DTT(Thermo Fisher Scientific)，加水至终体积为60μL，放置于37℃孵育30min。lentiCRISPRv2经过酶切后，DNA凝胶电泳回收2kb左右大小的条带。
2)sgRNA单链退火合成具有粘性末端的双链DNA，反应体系为：1μL sgRNA Oligo1、1μL sgRNA Oligo2、1μL 10×T4 Ligation Buffer(NEB)、0.5μL T4 PNK(NEB)，加水至终体积为10μL，放置于37℃孵育30min，95℃孵育5min并放置于室温环境下冷却。
3)sgRNA双链产物稀释200倍后，取1μL，加入50ng回收的lentiCRISPRv2、5μL 2×Quick Ligase Buffer(TOYOBO)、1μL Quick Ligase(TOYOBO)，加入至终体积为11μL，室温孵育10min后，即成功构建表达载体。
4)活化DH5α感受态中，加入lentiCRISPRv2-sgRNA表达载体，插入湿冰中孵育30min。
5)将DH5α感受态放入42℃水浴中孵育45s，迅速插入湿冰中静置5min。
6)加入600μL的LB培养基，放入37℃恒温摇床中，250rpm培养1h。
7)取30μL涂板于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板皿上，倒置放入37℃的培养箱中过夜。
8)挑选出阳性克隆，测序鉴定后扩增阳性克隆并抽取质粒。
2.3、慢病毒包装：
1)培养293T细胞，当细胞密度达到50-60％之间时，更换为无血清培养基培养1h。
2)将lentiCRISPRv2-sgRNA表达载体与慢病毒包装质粒pMDLg/pRR、pCMV-VSVG和pRSV-Rev质粒以及lipo-2000共转染到293T细胞中，4-6h后根据细胞的状态更换为新鲜的完全培养基。
3)分别在转染48h和72h后，收集细胞培养上清。
4)用0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片和其他杂质，过滤后的细胞培养上清在4℃、20000g速度下离心2h，去除上清，管底沉淀即为病毒颗粒。用无血清DMEM培养基溶解沉淀后，立即使用或分装保存。
2.4、慢病毒感染B16F10细胞及敲除效果检测：
1)培养B16F10细胞，当细胞密度达到50-60％之间时，更换为无血清培养基培养1h。
2)加入上述慢病毒溶液以及促病毒感染试剂polybrene(溴化己二甲铵)，感染6h后，根据细胞状态更换或添加新鲜的完全培养基。
3)感染48h后，细胞培养基更换为含5mg/mL的嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞，当未感染病毒的细胞在嘌呤霉素的筛选压力下全部死亡时，感染病毒并存活下来的细胞即为阳性克隆。
4)通过免疫印迹方法检测细胞敲除效率。
3、小鼠皮下肿瘤模型和治疗方案
培养B2m-sgRNA B16F10肿瘤细胞，选取原发耐药的H22和CT26肿瘤细胞，细胞消化后重悬于无血清培养基中，并加入20-30％的基底胶(Matrigel)。皮下注射2×105的B2m-sgRNA B16F10细胞在4-6周龄大小的雄性C57BL/6小鼠的左侧腹股沟；皮下注射1×106的H22细胞或CT26细胞在4-6周龄大小的雄性BALB/C小鼠的左侧腹股沟。每2-3天监测小鼠的体重和肿瘤的生长情况。当肿瘤体积达到50-100mm3时，小鼠随机分组，并给予小鼠相应的治疗。肿瘤体积的计算公式是1/2a×b2，其中a是肿瘤的长径，b为肿瘤的短径。
治疗方案：当小鼠肿瘤达到50-100mm3时，腹腔注射MSNs(10mg/kg小鼠体重)，仅给予一次；第二天腹腔注射PD-1抗体(5mg/kg小鼠体重)，给药频率为每2-3天给药一次，对照组给予IgG治疗。
4、小鼠肿瘤复发模型
肿瘤复发模型：荷瘤小鼠经过一段时间治疗后，停止治疗。腹腔注射80μL的体积分数6％的水合氯醛溶液麻醉小鼠，对皮下肿瘤进行手术切除。监测肿瘤复发的时间和肿瘤的体积。
肿瘤re-challenge模型：手术切除左侧皮下肿瘤后，在小鼠右侧重新接种肿瘤细胞，监测肿瘤的生长情况和小鼠的生存情况。
对上述过程进行如下实验。
1.MSNs的结构表征：
介孔二氧化硅的物理化学性质会影响其在机体内的分布和生物学功能。因此，为了更好地评估MSNs在肿瘤免疫治疗中的潜在影响，通过简单的溶胶-凝胶法合成了具有不同尺寸和形貌的MSNs。如图1和图2所示，通过调节碱性催化剂三乙醇胺和十六烷基三甲基氯化铵的质量比，合成了不同粒径大小的球形MSNs，这些球形MSNs具有良好的分散性和明显的介孔结构。
如图3和图4所示，通过在制备过程中改变CTAB)和NH3·H2O的量，合成了具有不同长径比的的棒状MSNs，这些棒状MSNs具有均匀分散的纳米结构和螺旋介孔。
2.在三种PD-1抗体耐药的肿瘤模型中，MSNs均能够增敏PD-1抗体治疗。
机体的抗肿瘤免疫反应主要通过免疫细胞识别并杀伤肿瘤细胞。然而，肿瘤抗原的缺失会导致免疫细胞无法识别，进而影响免疫治疗的疗效。肿瘤抗原的缺失是由于肿瘤细胞抗原呈递过程受阻，主要通过β2微球蛋白(B2m)、人类白细胞抗原(HLA)等基因发生突变。B2m基因是主要组织相容性复合物MHC-I类分子的重要组成部分，B2m缺乏会影响肿瘤抗原呈递过程，进而逃避免疫系统的识别，导致免疫治疗药物耐药。临床研究发现原本响应PD-1抗体治疗的黑色素瘤在B2m基因发生突变后，产生PD-1抗体耐药。因此，为了构建PD-1抗体耐药的肿瘤模型，在鼠源黑色素瘤细胞系B16F10中通过Crispr/cas9技术显著降低B2m和MHC-I分子的表达，建立B2m-sgRNA B16F10细胞株。将肿瘤细胞注射到小鼠皮下，建立小鼠皮下肿瘤模型。待肿瘤体积达到50-100mm3，腹腔注射MSNs(仅注射一次)和PD-1抗体(两天注射一次)，对照组给予溶剂处理，监测小鼠肿瘤的生长情况。实验结果表明，单独给予PD-1抗体并不能抑制肿瘤的生长，提示B2m-sgRNA B16F10肿瘤对PD-1抗体耐药(图5和图6)。仅仅注射一次MSNs就可以在PD-1抗体治疗后第二天产生显著的抗肿瘤反应，并且抗肿瘤免疫记忆会一直持续到治疗结束。荷瘤小鼠经过不同的MSNs和PD-1抗体治疗，测量肿瘤体积和体重。然而，在给予MSNs预处理后，除了100nm的MSNs外，其他粒径(45nm和65nm)和长径比L/D(3:1、4:1和8.5:1)的MSNs均能够克服肿瘤对PD-1抗体的耐药性，显著抑制肿瘤的生长，而且这种治疗效果存在粒径(图5)和长径比(图6)依赖性，即粒径(45nm)和长径比L/D(3:1)越小，MSNs增敏PD-1抗体的治疗效果越显著。
为了探究MSNs克服PD-1抗体耐药的效应是否也适用于其他肿瘤类型，选取其他两种已经被证明存在PD-1抗体耐药的肿瘤细胞，H22肝癌和CT26结肠癌细胞。结果显示，与B2m-sgRNA B16F10肿瘤类似，除了100nm MSNs，其它粒径(45nm、65nm)和长径比(3:1L/D、4:1L/D、8.5:1L/D)的MSNs均能够克服肿瘤对PD-1抗体的耐药性，显著抑制肿瘤的生长，而且治疗效果存在粒径和长径比依赖性(图5和图6)。
3.MSNs联合PD-1抗体增强抗原特异性的免疫记忆，抑制小鼠肿瘤术后复发
手术治疗是最早应用于肿瘤治疗的方法，也是目前大部分肿瘤治疗的首选疗法。许多早期肿瘤可以通过手术达到根治的目的。然而，肿瘤手术治疗后常常伴随着复发转移的产生，而且目前大多数药物无法抑制这种复发转移过程，所以肿瘤复发转移是肿瘤治疗最终失败的原因。相比传统疗法，肿瘤免疫治疗表现出的优势之一就是疗效具有持久性。如果免疫治疗能够在肿瘤患者中发挥抗肿瘤效果，则能长期发挥疗效，抑制肿瘤的复发，显著提高患者的生存期。因此，利用肿瘤复发模型进一步研究MSNs是否能够有效抑制肿瘤的术后复发过程。
首先构建了皮下肿瘤复发模型。在前期建立的皮下肿瘤模型的基础上，给予小鼠MSNs和PD-1抗体治疗后，手术切除肿瘤组织。结果表明，小鼠在术后两周(CT26)或5天(H22)后逐渐开始出现原位复发。与对照组相比(PD-1抗体治疗组)，MSNs联合PD-1抗体治疗组显著降低了术后复发肿瘤的生长和肿瘤复发率(图7和图8)，提示MSNs能够增强免疫记忆效应，产生了长期的治疗效果。为了进一步验证MSNs能够产生长期的抗肿瘤效果，我们构建了肿瘤re-challenge模型(图7和图8)。经过MSNs联合PD-1抗体治疗，手术切除B2m-sgRNAB16F10肿瘤组织后，在原位肿瘤对侧接种新的B2m-sgRNA B16F10肿瘤细胞。结果显示，MSNs联合PD-1抗体治疗组显著抑制新接种的肿瘤生长，小鼠总生存期显著提高(图8)，提示MSNs增强了全身性抗肿瘤免疫应答，当肿瘤再次出现的时候，机体迅速产生抗肿瘤免疫反应。
上述对具体实施方式的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些具体实施方式做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述介孔二氧化硅纳米颗粒包括球形介孔二氧化硅纳米颗粒和棒状介孔二氧化硅纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述球形介孔二氧化硅纳米颗粒的制备过程为：十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺反应，然后滴加四乙氧基硅烷继续反应，真空干燥得到。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述球形介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为45nm、65nm和100nm。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述棒状介孔二氧化硅纳米颗粒的制备过程为：十六烷基三甲基溴化胺和氨水反应，然后滴加四乙氧基硅烷继续反应，真空干燥得到。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述MSNs的长径比为3:1、4:1和8.5:1。
7.一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在制备增敏药物中的应用。
8.一种介孔二氧化硅纳米颗粒联合PD-1抗体在抑制肿瘤复发中的应用。
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CN108543077A (zh) * 2018-04-10 2018-09-18 武汉迈德森医药科技股份有限公司 一种双硫仑单体的介孔二氧化硅纳米颗粒及其制备方法和应用
CN109364267A (zh) * 2018-12-10 2019-02-22 四川大学华西医院 肿瘤组织和细胞双重靶向的介孔二氧化硅纳米载药颗粒及其制备方法

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