CN113267574A - O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途 - Google Patents

O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了O‑硫化酪氨酸在制备急慢性肾功能不全和/或冠状动脉粥样硬化检测的诊断试剂中的用途，以及一种非诊断目的的O‑硫化酪氨酸浓度的检测方法，该检测方法采用质谱仪测定O‑硫化酪氨酸浓度；质谱检测中的流动相A为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液；流动相B为乙腈或甲醇。本发明提供的O‑硫化酪氨酸浓度的检测方法，操作简便、灵敏度高且稳定性好，为慢性肾功能不全的快速测试提供了一种实用的方法，且本发明的O‑硫化酪氨酸的检测方法也可以用于诊断受试者冠状动脉粥样硬化严重程度，具有较高的科学和应用价值。

Description

O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途
技术领域
本发明属于体外诊断领域，涉及一种O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途，尤其是O-硫化酪氨酸在制备临床急慢性肾功能不全和/或冠状动脉粥样硬化的诊断试剂中的用途。
背景技术
肾功能不全是因肾脏滤过功能下降而引起的临床症候群，其病因包括原发性肾病以及继发性的高血压肾病，糖尿病肾病等，临床表现为水肿，低蛋白血症，凝血功能异常等。目前，临床医生通过检测病人血清中肌酐，尿素氮水平，计算肾小球滤过率(GFR)，评估病人肾功能不全水平。美国肾脏病基金会肾脏病预后质量倡议工作组(KDOQI)根据GFR水平将肾功能不全分为5组，包括GFR≥90mL/min；60≤GFR＜90mL/min；30≤GFR＜60mL/min；15≤GFR＜30mL/min；GFR＜15mL/min。GFR下降病人包括急性肾功能不全(Acute Kidney Disease，AKD)及慢性肾功能不全(Chronic Kidney Disease，CKD，定义为GFR<60ml/min持续至少3个月)。综合分析病人的既往病史、体检和化验检查结果，对肾功能异常的病人进行诊断，可用于区分急性肾功能不全或慢性肾功能不全临床症候群指导治疗。急慢性肾功能不全临床诊断的局限性是显而易见的。例如，初诊中通过影像学或超声学检查肾脏体积，若肾脏体积变小通常提示慢性肾功能不全；另外，血常规检查结果显示轻中度贫血，通常也考虑慢性肾功能不全。以上诊断往往依据临床经验，可能会存在偏差，不利于指导治疗。
据文献(Niewczas M A,Mathew A V,Croall S,et al.Circulating ModifiedMetabolites and a Risk of ESRD in Patients With Type 1Diabetes and ChronicKidney Disease,American Diabetes Association Diabetes Care,2017March,40(3),383-390)报道，在1型糖尿病合并肾功能不全的病人中，血清中的硫酸盐代谢物O-硫化酪氨酸水平与肾功能下降相关。血清中O-硫化酪氨酸水平可以反映机体整体硫化状态，与病理状态之间存在一定的关系，并提示血清O-硫化酪氨酸对某些疾病发生和预后具有潜在的预测价值。
酪氨酸是构成蛋白质的氨基酸，具有电离的芳香环侧链，在人及动物体内由苯丙氨酸羟化而产生，所以当苯丙氨酸营养充足时，是非必需氨基酸。酪氨酸O-硫化是机体一种较常见的蛋白翻译后修饰，即在肽段的酪氨酸基团上添加一个硫酸盐基团。据报道，约1％的蛋白质经过酪氨酸O-硫化反应，该反应在反式高尔基体中由酪氨酸蛋白硫转移酶(TPSTs)催化进行。
蛋白硫酸化在蛋白间相互作用、蛋白水解过程和分泌蛋白的分泌速率等多种生物功能方面发挥重要作用，机体的硫化状态在感染性疾病、癌症、动脉粥样硬化和自身免疫性疾病中发挥重要作用。但是文献(Hoffhines A J,Damoc E,Bridges K G,et al.Detectionand purification of tyrosine-sulfated proteins using a novel anti-sulfotyrosine monoclonal antibody[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(49):37877-37887.)中记载，由于酪氨酸硫化免疫抗体的非特异性以及蛋白硫化修饰的不稳定性，阻碍了蛋白酪氨酸硫化检测方法的发展。因此本领域亟需一种特异地、高灵敏地检测O-硫化酪氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中针对急慢性肾功能不全在临床诊断过程中易出现偏差以及O-硫化酪氨酸检测准确性低的缺陷，提供了一种O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途。
本发明首次发现，在慢性肾功能不全病人的样本中可检测到O-硫化酪氨酸的存在且有所升高；而急性肾功能不全病人的样本中，虽然血肌酐等检测指标可提示病人肾功能下降明显，但其体内氧硫化程度并未升高，其中，O-硫化酪氨酸含量与肾功能正常志愿者的样本相似。本发明中O-硫化酪氨酸浓度的检测方法，操作简便、灵敏度高且稳定性好，为慢性肾功能不全的快速测试提供了一种实用的方法，具有较高的科学和应用价值，以及对该病的指导治疗提供了依据。此外，冠状动脉粥样硬化病变严重程度的常用评价方法为SYNTAX评分法，发明人意外地发现，O-硫化酪氨酸的浓度和SYNTAX评分的结果有直接相关性(相关系数R≥0.9，统计学意义P<0.05)。因此本发明的O-硫化酪氨酸的检测方法也可以用于诊断受试者冠状动脉粥样硬化严重程度。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明第一方面的技术方案为：提供了一种O-硫化酪氨酸在制备急慢性肾功能不全和/或冠状动脉粥样硬化检测的诊断试剂中的用途。
其中，优选地，所述诊断试剂为生物标志物；和/或，所述O-硫化酪氨酸的浓度采用质谱仪测定。
本发明中，所述质谱仪测定采用本发明第二方面的技术方案。
本发明中，所述的急慢性肾功能不全可分为急性肾功能不全和慢性肾功能不全。
本发明中，所述的急性肾功能不全可为本领域常规的概念，例如急性发生的肾功能不全，GFR<60mL/min且持续时间小于3个月。
根据本领域公知常识，所述的慢性肾功能不全根据肾小球滤过率(GFR)、内生肌酐清除率(Ccr)及血肌酐(Scr)水平等肾功能指标的不同可分为1期：GFR≥90mL/min；2期：60≤GFR＜90mL/min；3期：30≤GFR＜60mL/min；4期：15≤GFR＜30mL/min；5期：GFR＜15mL/min。
本发明中，所述的慢性肾功能不全可为本领域常规的概念，例如GFR<60mL/min且持续3个月以上。
本发明第二方面的技术方案为：提供了一种非诊断目的的O-硫化酪氨酸浓度的检测方法，所述检测方法采用质谱仪器测定O-硫化酪氨酸浓度；
所述质谱仪的质谱检测中，流动相A为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液；流动相B为乙腈或甲醇。
其中，所述流动相A优选为0.1％的甲酸水溶液。
本发明中，所述的“非诊断目的”的检测方法，例如可以用于实验室样品O-硫化酪氨酸的检测，可以用于建立O-硫化酪氨酸浓度与和人体疾病的诊断和治疗无关的指标(例如代谢组学分析中的一些常见代谢物)之间相关性时的O-硫化酪氨酸的检测，也可以用于一些疾病的机理研究时的O-硫化酪氨酸的检测。
本发明中，所述质谱检测可为自动进样，进样温度可为4℃～8℃，优选为8℃。所述质谱检测的柱温可为25℃～45℃，优选为45℃。所述质谱检测的流速可为150μL/min～500μL/min，优选为300μL/min。较佳地，洗脱的时间为2.5min～4min；优选为4min。
本发明中，较佳地，洗脱的条件依次如下述步骤所示：
a.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；优选在本步骤中的洗脱时间为1.5min～2.0min；
b.所述流动相A的体积百分比为0％，所述流动相B的体积百分比为30％；优选从所述步骤a至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.3min～2.0min；
c.所述流动相A的体积百分比为10％，所述流动相B的体积百分比为90％；优选从所述步骤b至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.2min～0.5min；更优选在达到本步骤的洗脱条件后，继续洗脱1min；
d.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；优选从所述步骤c的洗脱条件等梯度换为本步骤的洗脱条件；更优选在本步骤中继续洗脱0.4min～0.5min；
更佳地，所述洗脱的条件如表1：
表1
时间(min) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.300 90％ 10％
2.00 0.300 90％ 10％
2.30 0.300 70％ 30％
2.50 0.300 10％ 90％
3.50 0.300 10％ 90％
3.51 0.300 90％ 10％
4.00 0.300 90％ 10％
本发明中，本领域技术人员知晓所述连续梯度洗脱一般为在洗脱的单位时间中，流动相梯度渐变到目标值；所述等梯度为流动相的浓度直接变化。其中，所述等梯度变化的时间可为质谱仪更换流动相梯度所需的常规时间，例如为0.01min。
本发明中，所述质谱仪测定可使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统和三重四极杆液质联用系统。所述Waters ACQUITY UPLC I-Class系统和三重四极杆液质联用系统是串联使用。所述Waters ACQUITY UPLC I-Class系统用于分离；所述三重四极杆液质联用系统用于质谱检测。
本发明中，所述Waters ACQUITY UPLC I-Class系统的色谱柱优选为T3色谱柱、HILIC色谱柱或BEH amide色谱柱。
其中，所述T3色谱柱优选为Waters T3色谱柱。所述HILIC色谱柱优选为WatersHILIC色谱柱。所述BEH amide色谱柱优选为Waters BEH amide色谱柱。
本发明中，所述三重四极杆液质联用系统优选为Agilent三重四极杆液质联用系统或AB Sciex三重四极杆液质联用系统。
其中，所述Agilent三重四极杆液质联用系统可为Agilent 6460C或Agilent6470A。所述AB Sciex三重四极杆液质联用系统可为5500QTRAP。所述5500QTRAP的离子阱可以增强检测能力。
其中，所述5500QTRAP可采用负离子模式进行质谱分析。
其中，所述5500QTRAP的源条件可为：温度为550℃，离子源Gas1的流量为55sccm，离子源Gas2的流量为55sccm，气帘气体的流量为40sccm，离子电压为±4500V。
其中，所述5500QTRAP可采用MRM模式监测待测物离子对，如表2：
表2
Figure BDA0002385332620000061
注：加粗标记离子对为定量离子对。
本发明中所述的O-硫化酪氨酸浓度的检测方法，较佳地还包括收集和保存血浆样品、制备检测样本和配制检测试剂的步骤。
本发明中，所述的收集和保存血浆样品可按照美国Clinical&LaboratoryStandards Institute标准采集外周静脉血，并将所述静脉血保存在抗凝血剂中，离心后得到无血小板血浆。
其中，所述抗凝血剂可为含有2.5％EDTA的抗凝血管(常规抗凝血管，市售可得)，所述百分比为质量百分比。优选地，所述抗凝血管中还含有抗氧化剂。
所述离心的温度是4℃。所述离心的时间为10min。
本发明中，所述的制备检测样本可为将所述血浆样品震荡后，加入预冷甲醇，混合后静置于冰箱中，离心后取上清液，真空干燥后可得所述检测样本。
其中，所述震荡可为涡旋震荡。所述血浆样品和所述预冷甲醇的体积比可为1:5～1:200。所述混合可为涡旋混合。所述冰箱的温度可为4℃。所述静置的时间可为20min。
其中，所述离心的温度可为4℃。所述离心的离心力可为10000～15000g，优选14000g。所述离心的时间可为10min～30min，优选为10min。
其中，所述真空干燥的真空度可为35kPa。所述真空干燥的温度可为-60℃～-80℃。
本发明中，所述的配制检测试剂可为将标准品制备为10mg/mL的标准品储备液，建立标准曲线。
其中，所述标准储备液的溶剂为水；所述标准曲线的浓度梯度为500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL。
本发明中，所述的质谱检测后可包括数据处理。
其中，所述的数据处理可采用Analyst 1.6.3提取所述O-硫化酪氨酸的峰面积和保留时间，并根据所述标准曲线计算所述O-硫化酪氨酸的浓度。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的O-硫化酪氨酸的检测方法及其用途。本发明提供的O-硫化酪氨酸浓度的检测方法，操作简便、灵敏度高且稳定性好，为慢性肾功能不全的快速测试提供了一种实用的方法，且本发明的O-硫化酪氨酸的检测方法也可以用于诊断受试者冠状动脉粥样硬化严重程度，具有较高的科学和应用价值。
附图说明
图1为实施例1中洗脱条件①标准品XIC图谱。
图2为实施例1中洗脱条件②标准品XIC图谱。
图3为实施例1中洗脱条件③标准品XIC图谱。
图4为实施例1中血浆样本XIC图谱。
图5为实施例1中标准曲线参数。
图6为慢性肾功能不全病人血清中O-硫化酪氨酸浓度显著提高示意图。
图7为慢性肾脏病病人血清中O-硫化酪氨酸水平和急性肾脏病病人血清中O-硫化酪氨酸水平示意图。
图8为慢性肾脏病4-5期病人血清中O-硫化酪氨酸水平和慢性肾脏病1-3期病人血清中O-硫化酪氨酸水平示意图。
图9为慢性肾功能不全病人SYNTAX评分组O-硫化酪氨酸的含量。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
测定5名肾功能不全志愿者血清中O-硫化酪氨酸浓度，包括以下步骤：
(1)收集和保存血浆样品：按照医学标准采集肾功能不全志愿者外周静脉血，并将所述静脉血保存在含有2.5％EDTA抗凝血管中，取血浆样品14000g在4℃条件下离心10min，得到无血小板血浆；
(2)制备检测样本：取50μL血浆样品作为检测样本，涡旋震荡后，加入250μL预冷甲醇，涡旋混合后静置于20℃冰箱20min，取血浆样品14000g在4℃条件下离心15min，再取200μL上清液，真空干燥后可得所述检测样本；
(3)配制检测试剂：将10mg标准品中加入1mL水，制备为10mg/mL的标准品储备液，建立标准曲线，所述标准曲线的浓度梯度为500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL；
(4)质谱检测及数据处理。
质谱检测的流动相为0.1％(体积分数)甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱；自动进样，进样温度为8℃；柱温45℃；流速300μL/min；
其中，洗脱条件①如表3，其标准品XIC图谱如图1；洗脱条件②如表4，其标准品XIC图谱如图2；洗脱条件③如表5，其标准品XIC图谱如图3；
表3
时间(min) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.300 90％ 10％
2.00 0.300 70％ 30％
2.50 0.300 10％ 90％
3.50 0.300 10％ 90％
3.51 0.300 90％ 10％
4.00 0.300 90％ 10％
表4
时间(min) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.300 90％ 10％
1.50 0.300 90％ 10％
2.00 0.300 70％ 30％
2.50 0.300 10％ 90％
3.50 0.300 10％ 90％
3.51 0.300 90％ 10％
4.00 0.300 90％ 10％
表5
Figure BDA0002385332620000091
Figure BDA0002385332620000101
本实施例中采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统和AB Sciex三重四极杆液质联用系统进行质谱检测，其中，Waters ACQUITY UPLC I-Class系统和三重四极杆液质联用系统是串联使用；Waters ACQUITY UPLC I-Class系统用于分离，三重四极杆液质联用系统用于质谱检测。
其中，AB Sciex三重四极杆液质联用系统为5500QTRAP；5500QTRAP采用负离子模式进行质谱分析；5500QTRAP的源条件为：温度为550℃，离子源Gas1的流量为55sccm，离子源Gas2的流量为55sccm，气帘气体的流量为40sccm，离子电压为±4500V；5500QTRAP采用MRM模式监测待测物离子对，如表6：
表6
Analyte name Q1(m/z) Q3(m/z) DP(V) CE(eV) CXP(V) EP(V)
O-Sulfotyrosine 260.2 180.0 -65 -26 -9 -10
O-Sulfotyrosine 260.2 199.0 -60 -23 -14 -10
O-Sulfotyrosine 260.2 119.1 -55 -33 -13 -10
注：加粗标记离子对为定量离子对。
上述数据处理采用Analyst 1.6.3提取所述O-硫化酪氨酸的峰面积和保留时间，并根据步骤(3)所述标准曲线计算所述O-硫化酪氨酸的浓度。
效果实施例1
1.标准品XIC图谱
图1～3为标准品XIC图谱。
图1(洗脱条件①)中O-硫化酪氨酸的色谱保留时间(RT)为0.974min；图2(洗脱条件②)中O-硫化酪氨酸的色谱保留时间(RT)为1.4min；图3(洗脱条件③)中O-硫化酪氨酸的色谱保留时间(RT)为1.8min。
由此可知，不同的液相梯度会影响检测样本的出峰时间。其中，图3的保留时间(RT)最长，检测效果最佳。
2.血浆样本XIC图谱如图4所示。
采用实施例1中的检测方法，能够检测到检测样本中的O-硫化酪氨酸，并且与图4所示的标准品XIC图谱相比，O-硫化酪氨酸的色谱峰形和专属性较好。
3.标准曲线参数如图5所示。
实施例2
(1)测定3名肾功能正常志愿者血清中O-硫化酪氨酸浓度，其步骤同实施例1。结果如图6所示，相比于肾功能正常志愿者，慢性肾功能不全病人血清中O-硫化酪氨酸浓度显著提高。
(2)采集135例(慢性肾功能不全病人115例，急性肾功能不全病人20例)病人的空腹静脉血。
(3)取3mL病人的空腹静脉血，2500转/min离心15min后取上层血清，冻存于-80℃冰箱待检测。
(4)取病人的空腹静脉血，检测血糖、血尿素氮、血肌酐、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白；采用质谱检测方法检测血清中O-硫化酪氨酸浓度，每例上层血清重复检测5次。
(5)采用SPSS21.0软件进行统计学分析；计量资料以均数±标准差表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。
如图7所示，115例慢性肾功能不全病人血清中O-硫化酪氨酸水平为406.01±417.35，显著高于20例急性肾功能不全病人血清中O-硫化酪氨酸水平131.34±81.09，p＝0.004。
同时，急性肾功能不全病人血清中O-硫化酪氨酸水平与肾功能正常志愿者血清中O-硫化酪氨酸水平(137.85±57.80，p＝0.872)相比，没有统计学差异。
进一步地，如图8所示，在115例慢性肾功能不全病人中，慢性肾功能不全4-5期病人血清中O-硫化酪氨酸水平为660.60±467.02，明显高于慢性肾功能不全1-3期病人血清中O-硫化酪氨酸水平242.35±281.52，p<0.001。
实施例3
收集临床接受冠脉造影检查的慢性肾功能不全病人的冠脉病变严重程度依据SYNTAX评分，并收集病人外周血浆检测其O-硫化酪氨酸含量。其中，实验排除标准包括：1)糖尿病；2)自身免疫性疾病；3)既往心梗病史；4)肿瘤；5)家族性高胆固醇血症。
根据本领域常规，SYNTAX评分主要针对冠状动脉左主干病变和/或三支病变，是根据冠状动脉病变解剖特点进行危险分层的积分系统；根据病变位置、严重程度、分叉、钙化等解剖特点定量评价冠脉病变的复杂程度，利用积分的高低评估冠状动脉病变严重程度。
实施例3中的实验结果表明：SYNTAX评分0分组21人，1-10分组17人，>10分组47人。根据图9的统计分析结果，SYNTAX积分高组其O-硫化酪氨酸含量也高，组间差异有统计学意义(R≥0.9，P<0.05)。由此表明，检测O-硫化酪氨酸的含量可用于判断慢性肾功能不全病人动脉粥样硬化的严重程度，从而指导治疗，例如可用于判断适合的手术方式。
综上所述，慢性肾功能不全病人血清中的O-硫化酪氨酸水平明显高于急性肾功能不全病人，而急性肾功能不全病人血清中的O-硫化酪氨酸水平与肾功能正常志愿者相当，并且，慢性肾功能不全4-5期病人血清中O-硫化酪氨酸水平明显高于慢性肾功能不全1-3期病人血清中O-硫化酪氨酸水平。由此可见，血清中的O-硫化酪氨酸可用于制备急慢性肾功能不全和/或冠状动脉粥样硬化检测的诊断试剂，进一步地，可以看出病人血清中的O-硫化酪氨酸水平与慢性肾功能不全及其严重程度有关。因此，将血清中的O-硫化酪氨酸水平作为慢性肾功能不全诊断及分期标准、以及慢性肾功能不全病人动脉粥样硬化的严重程度将具有重要的科学和应用价值。

Claims (10)

1.O-硫化酪氨酸在制备急慢性肾功能不全和/或冠状动脉粥样硬化检测的诊断试剂中的用途；优选地，所述诊断试剂为生物标志物，和/或，所述O-硫化酪氨酸的浓度采用质谱仪测定。
2.一种非诊断目的的O-硫化酪氨酸浓度的检测方法，所述检测方法采用质谱仪测定O-硫化酪氨酸浓度；
所述质谱仪的质谱检测中，流动相A为体积分数为0.05％～0.2％的甲酸水溶液；流动相B为乙腈或甲醇。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.1％的甲酸水溶液。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测为自动进样；
和/或，所述质谱检测的进样温度为4℃～8℃，优选为8℃；
和/或，所述质谱检测的柱温为25℃～45℃，优选为45℃；
和/或，所述质谱检测的流速为150μL/min～500μL/min。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的流速为300μL/min，和/或，洗脱的时间为2.5min～4min；较佳地，洗脱的条件依次如下述步骤所示：
a.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；优选在本步骤中的洗脱时间为1.5min～2.0min；
b.所述流动相A的体积百分比为0％，所述流动相B的体积百分比为30％；优选从所述步骤a至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.3min～2.0min；
c.所述流动相A的体积百分比为10％，所述流动相B的体积百分比为90％；优选从所述步骤b至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.2min～0.5min；更优选在达到本步骤的洗脱条件后，继续洗脱1min；
d.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；优选从所述步骤c的洗脱条件等梯度换为本步骤的洗脱条件；更优选在本步骤中继续洗脱0.4min～0.5min；
更佳地，所述洗脱的条件依次如下述步骤所示：
a.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；在本步骤中的洗脱时间为2.0min；
b.所述流动相A的体积百分比为70％，所述流动相B的体积百分比为30％；且从所述步骤a至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.3min；
c.所述流动相A的体积百分比为10％，所述流动相B的体积百分比为90％；且从所述步骤b至本步骤为连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱的时间为0.2min；并且在达到本步骤的洗脱条件后，继续洗脱1min；
d.所述流动相A的体积百分比为90％，所述流动相B的体积百分比为10％；且从所述步骤c的洗脱条件等梯度换为本步骤的洗脱条件后，继续洗脱0.49min。
6.如权利要求2-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述质谱仪测定使用WatersACQUITY UPLC I-Class系统和三重四极杆液质联用系统；
优选地，所述Waters ACQUITY UPLC I-Class系统的色谱柱为T3色谱柱、HILIC色谱柱或BEH amide色谱柱；和/或，所述三重四极杆液质联用系统为Agilent三重四极杆液质联用系统或AB Sciex三重四极杆液质联用系统。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述Agilent三重四极杆液质联用系统为Agilent 6460C或Agilent 6470A；所述AB Sciex三重四极杆液质联用系统为5500QTRAP。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述5500QTRAP采用负离子模式进行质谱分析；
和/或，所述5500QTRAP的源条件为：温度为550℃，离子源Gas1的流量为55sccm，离子源Gas2的流量为55sccm，气帘气体的流量为40sccm，离子电压为±4500V。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述5500QTRAP采用MRM模式监测待测物离子对。
10.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括收集血浆样品、保存血浆样品、制备检测样本和配制检测试剂的步骤。
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