CN113249401A - 一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法。本发明揭示了雷帕霉素生产菌中参与三羧酸循环、脂肪酸合成或芳香族氨基酸合成途径的一些目标基因与该生产菌的雷帕霉素产量密切相关，下调所述目标基因，可以极为显著地提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量。同时，本发明还优化了重组表达体系以及表达菌株，设计了有效的重组表达构建物、配合雷帕霉素生产菌的群感效应系统，实现了兼顾菌株生长以及雷帕霉素生产的动态控制。

Description

一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法

技术领域

本发明属于发酵生物学领域，更具体地，本发明涉及一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法。

背景技术

雷帕霉素是一种非常重要的链霉菌次生代谢产物，具有抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等多种生物活性。雷帕霉素作为免疫抑制剂具有独特的优势，比钙调神经磷酸酶抑制剂-环孢菌素A作用强10～100倍。不仅可以有效抑制急性器官移植免疫排斥反应，还可以有效抑制FK506和环孢菌素A不能抑制的慢性器官移植免疫排斥反应，同时避免了环孢霉素引发肿瘤的可能性。FDA分别在1999年批准其用于减轻肾移植免疫排斥反应和2003批准其用于药物洗脱支架涂料。在抗肿瘤方面FDA分别在2007、2008、2010和2011批准其用于肾细胞癌、套细胞淋巴瘤、结节性硬化症和胰腺癌的治疗。随着研究的深入，发现雷帕霉素还能够显著提升酵母、线虫、果蝇和小鼠的寿命。近的报道显示，雷帕霉素在减缓人体皮肤衰老方面也有显著的效果。因此，雷帕霉素的市场前景非常广阔。

雷帕霉素的生物发酵产量极低，通过传统代谢工程策略改造菌株的效果不佳。究其原因，是因为不能在恰当的时间点平衡初级代谢和次级代谢，优化代谢流的分配。因此，通过动态代谢调控来优化雷帕链霉菌的代谢网络，是值得重点考虑的提高雷帕霉素产量的一种潜在有效策略。

现有的动态调控系统分为以下几种类型：(1)基于外源添加诱导剂的动态调控系统，需要人为的监测细胞的生长状态、在合适的时间点添加诱导剂改变基因表达。(2)途径依赖型动态调控系统，通过高度特异性的动态调控元件(转录因子、核糖开关等)自动响应宿主细胞中的代谢产物。(3)途径非依赖型动态调控系统，利用调控元件如群感效应(QS)系统将基因表达与细胞生长状态自动关联。这些动态调控系统虽然各具特点，但存在的共性问题是通用性差且难以实现对多基因不同表达强度的控制。因此构建一种能够同时控制多基因、控制强度可方便更改的、普适性强且容易操作的动态调控系统，将会大大加强我们改造微生物的能力，进一步提升不同类型目的产物的产量

迄今为止利用动态调控提高雷帕霉素产量的文章尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产雷帕霉素的方法，所述方法包括：(1)下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达；其中，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm；(2)培养(1)的雷帕霉素生产菌，生产雷帕霉素。

在一个优选例中，所述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2。

在另一优选例中，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

在另一优选例中，所述的下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达包括：(a)在雷帕霉素生产菌中敲除或沉默所述目标基因；(b)将下调所述目标基因的下调剂引入雷帕霉素生产菌中；或(c)调节(如上调或下调)雷帕霉素生产菌中所述目标基因的上游信号通路或上游基因，以下调所述目标基因。

在另一优选例中，所述的下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达包括：通过基因编辑敲除或沉默所述目标基因，或所述的下调剂为基因编辑试剂；较佳地：靶向于所述gltA1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；靶向于所述gltA2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；靶向于所述gltA3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3；靶向于所述fabH1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:4；靶向于所述fabH2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5；靶向于所述fabH3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16；靶向于所述cm1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7；靶向于所述cm2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；靶向于所述cm3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9；或靶向于所述cm4基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

在另一优选例中，通过基因编辑敲除或沉默所述目标基因时，利用雷帕霉素生产菌的群感效应体系进行表达；较佳地，以srbA基因的启动子(srbAp)驱动Cas酶与sgRNA的表达，该启动子能感应雷帕霉素生产菌的生长，在生长转换期启动表达。较佳地，所述srbA基因的启动子序列包含srbA基因上游的2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内、800bp以内、600bp以内、500bp以内、300bp以内、200bp以内、150bp以内或120bp以内碱基的核酸片段；更佳地包含srbA基因的ATG前第-105位到+8位。

在另一优选例中，所述的下调剂是特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，所述的雷帕霉素生产菌包括选自下组的菌：雷帕链霉菌，游动放线菌或伊氏链霉菌。

在本发明的另一方面，提供目标基因的用途，用于作为提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量的靶标，制备提高雷帕霉素产量的下调剂；其中，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm。

在本发明的另一方面，提供下调目标基因的下调剂的用途，用于提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量，其中所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm；较佳地，所述下调剂包括(但不限于)：基因编辑试剂；特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在一个优选例中，所述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2；较佳地，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

在本发明的另一方面，提供一种雷帕霉素生产菌，该雷帕霉素生产菌中，目标基因被下调；较佳地，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm。

在一个优选例中，述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2；较佳地，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

在另一优选例中，所述雷帕霉素生产菌中包括表达构建体，其包括操作性连接的：srbA基因的启动子(srbAp)，Cas酶表达基因，靶向所述目标基因的sgRNA。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的雷帕霉素生产菌的用途，用于生产雷帕霉素。

在本发明的另一方面，提供一种生产雷帕霉素的试剂盒，其中包含：前面任一所述的遗传工程化的雷帕霉素生产菌；或下调雷帕霉素生产菌中所述目标基因的下调剂；较佳地，所述下调剂包括(但不限于)：基因编辑试剂；特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在一个优选例中，所述基因编辑试剂包括表达构建体，包括操作性连接的：srbA基因的启动子(srbAp)，Cas酶表达基因，靶向所述目标基因的sgRNA。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、在srbAp和ermE*p驱动下lacZ酶活的变化；图中显示为3次生物学重复的结果。图中，2001为出发菌株(未转入质粒)，2001-p为对照菌株(转入空质粒pSET152)。

图2、分别使用群感效应与CRISPR技术相配合的体系(QSC系统)抑制三羧酸循环途径基因、脂肪酸合成途径基因或芳香族氨基酸合成途径基因，雷帕霉素的产量；

图2A、使用QSC系统抑制三羧酸循环途径基因后，雷帕霉素的产量；

图2B、使用QSC系统抑制脂肪酸合成途径基因后，雷帕霉素的产量；

图2C、使用QSC系统抑制芳香族氨基酸合成途径基因后，雷帕霉素的产量；

图中显示为3次生物学重复的结果；图中，2001-p-dcas为(转入仅表达Cas的pSET152质粒)。

图3、分别使用QSC系统优化抑制强度后，抑制三羧酸循环途径基因、脂肪酸合成途径基因或芳香族氨基酸合成途径基因后，雷帕霉素的产量；

A、使用QSC系统抑制三羧酸循环途径基因后，雷帕霉素的产量；

B、使用QSC系统抑制脂肪酸合成途径基因后，雷帕霉素的产量；

C、使用QSC系统抑制芳香族氨基酸合成途径基因后，雷帕霉素的产量；

D、使用QSC系统同时抑制三条代谢通路相关基因后，雷帕霉素的产量；

图中显示为3次生物学重复的结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现雷帕霉素生产菌中参与三羧酸循环、脂肪酸合成或芳香族氨基酸合成途径的一些目标基因与该生产菌的雷帕霉素产量密切相关，下调所述目标基因，可以极为显著地提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量。同时，本发明人还优化了重组表达体系以及表达菌株，设计了有效的重组表达构建物、配合雷帕霉素生产菌的群感效应系统，实现了兼顾菌株生长以及雷帕霉素生产的动态控制。

本发明中，所述的“目标基因”是指对于调控雷帕霉素产量有用的感兴趣的基因，包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA(三羧酸合成酶，citratesynthase)、脂肪酸合成途径基因fabH(3-氧酰基-ACP合酶，3-oxoacyl-ACP synthase)，芳香族氨基酸合成途径基因cm(chorismate mutase)。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”或“可操作性地构建”是指两个或多个核酸区域或核酸元件的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“构建体”或“构建物”包括“质粒”、“体外转录产物”或病毒载体等。

如本文所用，所述的“元件”是指一系列功能性的核酸序列，所述的“元件”可被系统地构建以形成一种构建物(构建体)。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

本发明中，所述的“雷帕霉素生产菌”是具有生产雷帕霉素的生产机制的菌株，较佳地其为放线菌，更佳地为链霉菌属的菌株。在本发明的优选方式中，所述的雷帕霉素生产菌包括：雷帕链霉菌，游动放线菌或伊氏链霉菌，特别是雷帕链霉菌。本发明中，所述的“雷帕霉素生产菌”可以是来自于自然界的天然菌株，或者是在天然菌株基础上经一次或多次突变的菌株，或者是基因工程改造的重组菌株。

本发明中，所述的gltA1可以是GenBank登录号M271_28125的基因；所述的gltA2可以是GenBank登录号M271_34825的基因；所述的gltA3可以是GenBank登录号M271_31465的基因；所述的fabH1可以是GenBank登录号M271_17610的基因；所述的fabH2可以是GenBank登录号M271_33380的基因；所述的fabH3可以是GenBank登录号M271_41260的基因；所述的cm1可以是GenBank登录号M271_28280的基因；所述的cm2可以是GenBank登录号M271_36305的基因；所述的cm3可以是GenBank登录号M271_37500的基因；所述的cm4可以是GenBank登录号M271_43345的基因。

任何与上述的基因或其编码的多肽同源性高(比如同源性为60％、70％、75％、80％、85％或更高；优选的，同源性为90％或更高；更优选的，同源性为95％或更高，如同源性98％或99％)的、且具上述基因或其编码的多肽相同功能的基因或多肽也包括在本发明内。这些同源性高的基因或多肽也可称为本发明的基因或其编码的多肽的同源物。

尽管本发明的具体实施例中，列举了具体的基因，但是应理解，由于雷帕霉素生产菌存在一些不同的变种，它们之间序列高度保守，来自于这些雷帕霉素生产菌中的同源基因或多肽也应被包含在本发明中，对这些同源基因或多肽的如本发明类似或相同的调控方法也应被包含在本发明中。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明首次确定雷帕霉素生产菌中参与三羧酸循环、脂肪酸合成或芳香族氨基酸合成途径的一些目标基因与该生产菌的雷帕霉素产量密切相关，下调所述目标基因有利于雷帕霉素的高产。基于该新发现，本发明提供了一种提高雷帕霉素产量的方法，包括：(1)下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达；其中，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm；(2)培养(1)的雷帕霉素生产菌，生产雷帕霉素。

在得知了所述的目标基因的调控作用后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节(下调)目标基因。包括但不限于：(a)在雷帕霉素生产菌中敲除或沉默目标基因；(b)将下调目标基因的下调剂转入雷帕霉素生产菌中；或(c)调节雷帕霉素生产菌中目标基因的上游信号通路或上游基因，以下调雷帕霉素生产菌中目标基因；等等。

所述的目标基因可以被组合地调控，在本发明的优选实施例中已发现，组合抑制多个目标基因，对于进一步提高雷帕霉素的产量是非常显著的。因此，在本发明的优选方式中，对所述的目标基因进行多基因联合抑制。

在雷帕霉素生产菌株中下调目标基因可以采用多种本领域已知的方法，包括基因沉默、基因阻断、基因敲除、基因抑制等。这些方法均被包含在本发明中。

例如，可以通过基于同源重组的基因插入阻断技术来改造基因组中的所述目标基因，从而使得所述目标基因被阻断；也可以针对所述目标基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使所述目标基因表达抑制或沉默。

一种下调所述目标基因的方法是基因阻断技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建所述目标基因阻断质粒，通过同源重组的方法，在雷帕霉素生产菌株染色体所述目标基因中插入其他无关元件，从而使得染色体上的所述目标基因不再能够编码活性的蛋白质。当进行基因阻断时，无关元件的选择是本领域技术人员易于选择到的，例如应用一些抗性基因。一种基因阻断(敲除)的方法例如可参见Genetic Manipulation ofStreptomyces:a Laboratory Manual中所记载的。较佳地，本发明实施例中，所述的无关元件包括pKC1139质粒中的部分元件，例如ori T、Ori pSG5、Apr。此外，将所述目标基因进行缺失敲除，使之缺少发挥功能的关键区域也是一种可行的下调基因的策略。

在设计用于进行基因阻断或敲除的构建物时，同时包含抗性筛选基因是优选的，从而有利于后续筛选出发生基因被阻断或敲除的菌株。

本发明人还优化了重组表达体系以及表达菌株，设计了有效的重组表达构建物、配合雷帕霉素生产菌的群感效应(QS)系统，实现了兼顾菌株生长以及雷帕霉素生产的动态控制。雷帕链霉菌中存在QS系统，其内源存在srbA和srbR基因，srbA基因的编码产物能够合成介导群体感应的γ丁内酯，srbR基因的编码产物则通过结合到srbA基因的启动子上，抑制srbA基因的表达。本发明人发现，通过应用srbA基因的启动子驱动靶向下调目标基因(可以是干扰试剂或基因编辑试剂)的表达，可以构成时序性良好的菌群感应体系。根据本发明的实施例结果，本发明建立的菌群感应体系能在适当的时候启动靶向下调目标基因的表达，使得群感效应与次级代谢在表达时间上高度一致，可良好地进行多基因表达强度的动态控制，使得菌体有足够的时间进行生长扩繁，以更为良好的状态进行雷帕霉素的生产。

在本发明的优选实施例中，建立了将群感效应与CRISPR技术相配合的体系，称为QSC系统，其具有很高的雷帕霉素产量。

本发明还提供了下调目标基因的雷帕霉素生产菌，该菌株不表达所述的至少一种目标基因或表达量显著性降低。在本发明的更为优选的方式中，所述雷帕霉素生产菌是包括了所述群感效应系统的雷帕霉素生产菌，较佳地，其表达构建体，该构建体其包括操作性连接的：srbA基因的启动子(srbAp)，Cas酶表达基因，靶向所述目标基因的sgRNA。在本发明的更为优选的方式中，所述雷帕霉素生产菌中两个或多个所述目标基因被组合下调。

本发明还涉及所述雷帕霉素生产菌的用途，用于生产雷帕霉素，且具有较高的生产效率。

基于本发明人的工作，本发明还提供了用于生产雷帕霉素的试剂盒，其中包含：本发明所述的遗传工程化的雷帕霉素生产菌。

本发明还提供了生产雷帕霉素的试剂盒，其中包含：下调雷帕霉素生产菌中目标基因的下调剂；所述的下调剂例如为用于靶向进行基因编辑的表达质粒，或RNA干扰试剂。当进行多个目标基因的联合下调时，可以设计多个靶向下调的表达构建体，置于该试剂盒中。

所述的生产雷帕霉素的试剂盒中，还可以包括其它应用于雷帕霉素生产过程的试剂，例如雷帕霉素生产菌的基础培养基。

所述的生产雷帕霉素的试剂盒中，还可以包括使用说明书，说明培养所述雷帕霉素生产菌的方法，或说明利用所述下调剂下调雷帕霉素生产菌中目标基因的方法。

本发明的积极效果在于：

本发明首次提出并验证了在雷帕链霉菌中靶向调控一些基因内对于增产的作用，本发明还设计了QSC系统动态控制代谢流。本发明的技术方案有效提高了雷帕霉素的产量。本发明还为后续链霉菌的代谢工程设计和改造提供了新思路。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、在雷帕链霉菌中表征群感效应系统的时序性

本实施例中，利用嗜热lacZ报告系统，利用srbAp驱动嗜热lacZ的表达，测定lacZ的酶活力。同时构建了组成型强启动子ermE*p驱动的嗜热lacZ作为对照。

实验步骤：

1)将雷帕链霉菌(吸水链霉菌)中srbA基因的启动子(ATG前，-105位到+8位)从基因组中克隆得到，并构建于pSET152载体上，并用srbAp(srbA基因的ATG前第-105位到+8位)驱动lacZ的表达，构建了质粒pSET-srbAp-lacZ，同理构建了质粒pSET-ermE*p-lacZ。

2)对1)中构建成功的载体，转化入雷帕链霉菌(内源带有srbR，srbA)中，发酵监测lacZ酶活力。

实验结果：

通过对含有质粒pSET152-srbAp-lacZ和pSET-ermE*p-lacZ的菌株进行发酵，发酵条件：YM培养基(25ml)，10％的接种量(v/v)，27℃下摇瓶培养，240rpm震荡。

在发酵过程的不同时间点上，分别监测lacZ酶活力。结果发现，srbAp驱动的lacZ在生长的转换期(图中约84～96小时)之后开始表达，而强启动子ermE*p驱动的lacZ则全程高表达，见图1。本发明人观测到，利用强启动子ermE*p使得产物产量较低，菌体在发酵过程中生长状态相对不够理想，其在初级代谢阶段受到影响；利用srbAp驱动表达，群感效应系统的时序性良好，其在初级代谢阶段生长相对理想，菌体前期基本不表达产物，而到生长转换期后再表达产物，兼顾了菌体生长和产物表达。

实施例2、抑制生物途径基因提高雷帕霉素产量

本实施例中，通过使用QSC系统分别抑制三羧酸循环途径、脂肪酸合成途径和芳香族氨基酸合成途径中的部分基因，发酵并检验对雷帕霉素产量的影响。

gltA1、gltA2、gltA3、fabH1、fabH2、fabH3、cm1、cm2、cm3、cm4这些基因中，gltA1、gltA2、gltA3为三羧酸循环相关基因；fabH1、fabH2、fabH3为脂肪酸合成途径相关基因；cm1、cm2、cm3、cm4为芳香族氨基酸合成途径相关基因。

实验方法：

将srbAp(质粒中称为srbAp)用于驱动dcas9的表达，并以pSET152为出发质粒构建如下重组质粒：

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA1，其中sg-gltA1序列为：CGCGGCGGTGTTGCCGTAAC(SEQID NO:1)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA2，其中sg-gltA2序列为：TTCGAGTCCGGGTACGAAGT(SEQID NO:2)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA3，其中sg-gltA3序列为：GGCCTCCAGCAACCGACCCT(SEQID NO:3)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH1，其中sg-fabH1序列为：GAGCGCCAGTACGTGCGAGC(SEQID NO:4)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH2，其中sg-fabH2序列为：AGCCGGGCTTTTGAGCACCC(SEQID NO:5)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH3，其中sg-fabH3序列为：GTGGCGCAGTGCCTTGAGAC(SEQID NO:6)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm1，其中sg-cm1序列为：CGCGGTGCCGATCACATGGG(SEQ IDNO:7)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm2，其中sg-cm2序列为：CTGGGTGCATTTGAAGCGCT(SEQ IDNO:8)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm3，其中sg-cm3序列为：ACCTGCTCATGCATGTGCTC(SEQ IDNO:9)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm4，其中sg-cm4序列为：ACGGCGATCAGCGCATGGCG(SEQ IDNO:10)。

上述中，sg-gltA1为靶向于gltA1的sgRNA，其后的其它sgRNA的命名也是如此。重组质粒中，dCas9以srbAp*启动子驱动，sgRNA以j23119为启动子。

将这些质粒分别转入雷帕链霉菌中，并测定对雷帕霉素产量的影响。

实验步骤：

1)构建上述10个质粒。

2)将1)中的构建的质粒转化进入雷帕链霉菌。

3)在2)的菌株发酵并在5、7、9、11、13天取样，通过高效液相色谱测定雷帕霉素的产量。

实验结果：

对分别抑制三羧酸循环途基因、脂肪酸合成途径基因和芳香族氨基酸合成途径基因的菌株进行发酵。YM培养基(25ml)，10％的接种量(v/v)，27℃下摇瓶培养，240rpm震荡。

取样并通过高效液相进行检测，发现对这三羧酸循环途径基因gltA1、gltA2或gltA3的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向gltA2的效果相对更理想，能显著提高到约550mg/L，见图2A。

对脂肪酸合成途径基因fabH1、fabH2或fabH3的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向fabH3的效果相对更理想，能显著提高到约800mg/L，见图2B。

对芳香族氨基酸合成途径基因cm1、cm2、cm3或cm4的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向cm2的效果相对更理想，能显著提高到约750mg/L，见图2C。

实施例3、优化抑制生物途径的抑制作用

本实施例中，使用QSC系统分别优化对三羧酸循环基因、脂肪酸合成途径基因和芳香族氨基酸合成途径基因的抑制强度，发酵检验对雷帕霉素产量的影响。

实验方法：

将srbAp用于驱动dcas9的表达，并构建如下质粒，：

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA2-2，其中sg-gltA2-2序列为：GGAGAGGATGCCCACGCTGC(SEQ ID NO:11)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA2-3，其中sg-gltA2-3序列为：GGCCACGGCCTCCTCCAGCC(SEQ ID NO:12)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-gltA2-4，其中sg-gltA2-4序列为：CTCCGCCAGCGCCCGCTCCA(SEQ ID NO:13)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH3-2，其中sg-fabH3-2序列为：GTGCCGGCCGTAGGTCCAGC(SEQ ID NO:14)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH3-3，其中sg-fabH3-3序列为：TTCGTCCGGGAACCGGGCAC(SEQ ID NO:15)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-fabH3-4，其中sg-fabH3-4序列为：GGTCTCGATGCAGCGGTGGG(SEQ ID NO:16)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm2-1，其中sg-cm2-1序列为：CTGGGTGCATTTGAAGCGCT(SEQID NO:8)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm2-2，其中sg-cm2-2序列为：GATGAAGTTGAGCAGCTTCT(SEQID NO:17)；

pSET-srbAp-dCas9/sg-cm2-3，其中sg-cm2-3序列为：GATGAAGTTGAGCAGCTTCT(SEQID NO:18)。

上述中，sg-gltA2-2、sg-gltA2-3、sg-gltA2-4为靶向于gltA2的三个不同基因位点的sgRNA，其后的其它sgRNA的命名也是如此。

另外，本发明人还建立了同时抑制gltA2，fabH3和cm2这3个基因的组合抑制组，由以上3组9个质粒随机组合而成，共27个。

将这些质粒或质粒组合分别转入雷帕链霉菌中，并测定对雷帕霉素产量的影响。

实验步骤：

1)构建上述36个质粒。

2)将1)中的构建的质粒转化进入雷帕链霉菌。

3)在2)的菌株发酵并在5、7、9、11、13天取样，通过高效液相色谱测定雷帕霉素的产量。YM培养基(25ml)，10％的接种量(v/v)，27℃下摇瓶培养，240rpm震荡。

实验结果：

通过对三羧酸循环途径基因抑制程度优化后的菌株进行发酵、取样并通过高效液相进行检测。对基因gltA2的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向gltA2的sg-gltA2-3效果相对更理想，提高到约690mg/L，见图3A。

通过对脂肪酸合成途径基因抑制程度优化后的菌株进行发酵、取样并通过高效液相进行检测。对基因fabH3的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向fabH3的sg-fabH3-2效果相对更理想，提高到约800mg/L，见图3B。

通过对芳香族氨基酸合成途径基因抑制程度优化后的菌株进行发酵、取样并通过高效液相进行检测。发现对基因cm2的抑制能大幅提高雷帕霉素产量，尤以靶向cm2的sg-cm2-2效果相对更理想，提高到约750mg/L，见图3C。

本发明人还检测了组合靶向抑制多基因的情况，结果如图3D。

图3D中，432为以sg-fabH3-4、sg-gltA2-3、sg-cm2-2联合导入细胞，分别抑制该三个基因后的结果；433为以sg-fabH3-4、sg-gltA2-3、sg-cm2-3联合导入细胞，分别抑制该三个基因后的结果；443为以sg-fabH3-4、sg-gltA2-4、sg-cm2-3联合导入细胞，分别抑制该三个基因后的结果。

根据图3D，所构建的联合抑制试剂，能同时抑制这三条代谢通路中的相应基因，雷帕霉素产量最高为433的抑制方式，达到约1830mg/L；432次之，达到约1350mg/L；443则约1150mg/L。

根据上述可见，对于各个基因的靶向抑制都不同程度地提高雷帕霉素的产量，而将两个或多个基因进行联合抑制，则效果进一步又有很大的提高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种提高链霉菌雷帕霉素产量的方法

<130> 19A753

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

cgcggcggtg ttgccgtaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

ttcgagtccg ggtacgaagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

ggcctccagc aaccgaccct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

gagcgccagt acgtgcgagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

agccgggctt ttgagcaccc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gtggcgcagt gccttgagac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cgcggtgccg atcacatggg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ctgggtgcat ttgaagcgct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

acctgctcat gcatgtgctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

acggcgatca gcgcatggcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ggagaggatg cccacgctgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

ggccacggcc tcctccagcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ctccgccagc gcccgctcca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

gtgccggccg taggtccagc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

ttcgtccggg aaccgggcac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

ggtctcgatg cagcggtggg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

gatgaagttg agcagcttct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gatgaagttg agcagcttct 20

Claims (18)

1.一种生产雷帕霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达；其中，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm；

(2)培养(1)的雷帕霉素生产菌，生产雷帕霉素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

4.如权利要求1～3所述的方法，其特征在于，所述的下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达包括：(a)在雷帕霉素生产菌中敲除或沉默所述目标基因；(b)将下调所述目标基因的下调剂引入雷帕霉素生产菌中；或(c)调节雷帕霉素生产菌中所述目标基因的上游信号通路或上游基因，以下调所述目标基因。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的下调雷帕霉素生产菌中目标基因表达包括：通过基因编辑敲除或沉默所述目标基因，或所述的下调剂为基因编辑试剂；较佳地：

靶向于所述gltA1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；

靶向于所述gltA2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13；

靶向于所述gltA3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3；

靶向于所述fabH1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4；

靶向于所述fabH2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5；

靶向于所述fabH3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16；

靶向于所述cm1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7；

靶向于所述cm2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18；

靶向于所述cm3基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9；或

靶向于所述cm4基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过基因编辑敲除或沉默所述目标基因时，利用雷帕霉素生产菌的群感效应体系进行表达；较佳地，以srbA基因的启动子驱动Cas酶与sgRNA的表达，该启动子能感应雷帕霉素生产菌的生长，在生长转换期启动表达。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的下调剂是特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的雷帕霉素生产菌包括选自下组的菌：雷帕链霉菌，游动放线菌或伊氏链霉菌。

9.目标基因的用途，用于作为提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量的靶标，制备提高雷帕霉素产量的下调剂；其中，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm。

10.下调目标基因的下调剂的用途，用于提高雷帕霉素生产菌的雷帕霉素产量，其中所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm；较佳地，所述下调剂包括：基因编辑试剂；特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

11.如权利要求9或10所述的用途，其特征在于，所述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2；较佳地，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

12.一种雷帕霉素生产菌，其特征在于，该雷帕霉素生产菌中，目标基因被下调；较佳地，所述目标基因包括选自下组的基因或其组合：三羧酸循环途径基因gltA、脂肪酸合成途径基因fabH，芳香族氨基酸合成途径基因cm。

13.如权利要求12所述的雷帕霉素生产菌，其特征在于，所述三羧酸循环途径基因gltA包括选自下组的基因或其组合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH包括选自下组的基因或其组合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm包括选自下组的基因或其组合：cm1、cm2、cm3、cm4；较佳地，所述三羧酸循环途径基因gltA为gltA2；或，所述脂肪酸合成途径基因fabH为fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途径基因cm为cm2；较佳地，所述目标基因的组合包括：gltA、fabH和cm的组合；更佳地，包括选自下组的组合：fabH3、gltA2和cm2的组合。

14.如权利要求12所述的雷帕霉素生产菌，其特征在于，所述雷帕霉素生产菌中包括表达构建体，其包括操作性连接的：srbA基因的启动子，Cas酶表达基因，靶向所述目标基因的sgRNA。

15.权利要求12～14任一所述的雷帕霉素生产菌的用途，用于生产雷帕霉素。

16.一种生产雷帕霉素的试剂盒，其特征在于，其中包含：

权利要求12～14任一所述的遗传工程化的雷帕霉素生产菌；或

下调雷帕霉素生产菌中所述目标基因的下调剂；较佳地，所述下调剂包括：基因编辑试剂；特异性干扰所述目标基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以所述目标基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述基因编辑试剂包括表达构建体，包括操作性连接的：srbA基因的启动子，Cas酶表达基因，靶向所述目标基因的sgRNA。

18.如权利要求10、14或16所述，所述基因编辑试剂或靶向所述目标基因的sgRNA包括：

靶向于所述gltA1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1；

靶向于所述gltA2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13；

靶向于所述gltA3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3；

靶向于所述fabH1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4；

靶向于所述fabH2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5；

靶向于所述fabH3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16；

靶向于所述cm1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7；

靶向于所述cm2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:17，SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19；

靶向于所述cm3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9；或

靶向于所述cm4基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

靶向于所述gltA1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1；

靶向于所述gltA2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13；

靶向于所述gltA3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3；

靶向于所述fabH1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4；

靶向于所述fabH2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5；

靶向于所述fabH3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16；

靶向于所述cm1基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7；

靶向于所述cm2基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18；

靶向于所述cm3基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9；或

靶向于所述cm4基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

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