CN113249336A - 鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 - Google Patents

鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供两种鼠抗（1,3）‑β‑D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗（1,3）‑β‑D葡聚糖抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗（1,3）‑β‑D葡聚糖基因工程抗体的研发奠定了基础；该鼠源抗（1,3）‑β‑D葡聚糖单克隆抗体与（1,3）‑β‑D葡聚糖反应高效价，且结合特异性强，可用于（1,3）‑β‑D葡聚糖的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。

Description

鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域，尤其是涉及鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
背景技术
葡聚糖（Glucan）是真菌细胞壁的特征和主要成分。根据种类，可以分为不同的葡聚糖多糖。这些多糖不同之处在于D-葡萄糖单体的键合可以是α-或β-构型并形成1,3、1,4或1,6 O-糖苷键。连接键和聚合物长度定义了葡聚糖大分子的物理性质，其可以形成其他细胞壁结构的支架并影响壁的刚性和弹性。 β-1,3-葡聚糖对许多真菌病原体的生存能力至关重要。真菌细胞壁β-葡聚糖也是一种重要的病原体相关分子模式（PAMP）。为了躲避先天免疫，许多真菌病原体依赖于细胞壁α-葡聚糖的合成，该α-葡聚糖的功能是作为一种隐身分子来掩盖β-葡聚糖本身或将其他掩盖结构连接至细胞壁。
β-葡聚糖（β-glucans）是真菌和细菌细胞壁内最丰富的多糖类型之一。尽管所有β-葡聚糖均由通过（1-3），（1,4）或（1,6）线性β-糖苷链连接在一起的葡萄糖分子组成，但葡聚糖的类型在长度和分支结构上有所不同，其中分支可能附着在骨架上的不同位置，由一到多个单糖苷单元组成。根据定义，构成β-葡聚糖的D-吡喃葡萄糖聚合物以β端基异构体连接，而α-D-葡聚糖将其D-吡喃葡萄糖单元以α构型连接。从核心糖苷链上的分支通常是（1-4）或（1-6），其中真菌β-葡聚糖通常具有（1-3）连接的主链和（1-6）侧链，而细菌则倾向于具有（1-4）侧链。真菌β-葡聚糖本身具有丰富的结构多样性，并已从多种真菌来源中分离出来。造成人类霉菌病的许多生物（包括白色念珠菌，烟曲霉和隐球菌）产生的壁富含β-（1,3）-葡聚糖，它一直是并且仍然是深入学习的重点。因此，检测β-（1,3）-葡聚糖抗原不仅可以帮助临床早期发现真菌感染并进行早期干预，还可以对治疗效果进行监测和评估，同时对患者的临床结果起到提示作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
本发明采用的技术方案是：鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，命名为AG10，保藏编号为CGMCC No.21918；或者，命名为DD1，保藏编号为CGMCC No.21919。
鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体，抗体AG10包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ ID NO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ IDNO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1
GFNIKDYYMH
SEQ ID NO:2
WIDPEHGDTEYAPKFQG
SEQ ID NO:3
YGNFWYFNV
SEQ ID NO:4
SASSSVSYLH
SEQ ID NO:5
DTSKLSS
SEQ ID NO:6
QQWSSNPYT
或者，
抗体DD1，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ IDNO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3；
SEQ ID NO:11
GYSITSDYYWS
SEQ ID NO:12
YIKYDGSNKYNPSLQN
SEQ ID NO:13
VTYTAYFAY
SEQ ID NO:14
KASQDINKYIG
SEQ ID NO:15
YTSTLQP
SEQ ID NO:16
LQYDNLWT
优选地，抗体AG10重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:7
GAEVVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEHGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAHLQLSSLTSEDAAVYYCNAYGNFWYFNVWGAGTTLTVSSAKT
轻链可变区序列
SEQ ID NO:9
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYLHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLSSGVPARFSGSGSGTSFSLTISSMEVEDAATYYCQQWSSNPYTFGGGTKLEIKR
或者，
抗体DD1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:17
GPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSDYYWSWIRQFPGNKLEWMGYIKYDGSNKYNPSLQNRISITRDPSENQFFLDLSAVTTEDTARYYCARVTYTAYFAYWGQGTLVTVSAAKT
轻链可变区序列
SEQ ID NO:19
DIVMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIGWYQHKPGKGPRLLILYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIKRAD
优选地，抗体AG10由保藏编号为CGMCC No.21918的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生；
抗体DD1由保藏编号为CGMCC No.21919的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生。
核酸分子，包含编码权利要求2或3所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体的核苷酸。
优选地，所述核酸分子编码抗体AG10的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体AG10的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:8
GGGGCAGAGGTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGCATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCCACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACGCTGCCGTCTATTACTGTAATGCGTATGGTAACTTCTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGCTCACCGTCTCTTCAGCCAAAACA
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:10
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGTCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTTCTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGTTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGTACACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
或者，
所述核酸分子编码抗体DD1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体DD1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:18
GGACCCGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTATTCCATCACCAGTGATTATTATTGGAGCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAATTGGAATGGATGGGCTACATAAAATACGACGGTAGCAATAAGTATAATCCATCTCTCCAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACCCATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGGACTTGAGTGCTGTGACTACTGAGGACACAGCAAGATATTACTGTGCAAGAGTAACTTACACAGCCTACTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACG
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:20
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGGCAAGCCAAGACATTAACAAGTATATAGGTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATTCTTTACACATCTACATTACAGCCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTACTATTGTCTACAGTATGATAATCTGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGC
鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体在制备检测（1,3）-β-D葡聚糖抗原试剂中的应用。
优选地，将鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
检测（1,3）-β-D葡聚糖的试剂盒，含有权利要求2-4中任一所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体。
优选地，抗体DD1用于制备磁珠包被物，抗体AG10用于制备酶标结合物；或者，抗体AG10用于制备磁珠包被物，抗体DD1用于制备酶标结合物。
本发明具有的优点和积极效果是：提供了鼠源性抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体，由其制备的腹水与（1,3）-β-D葡聚糖反应效价高达106，不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、曲霉菌半乳甘露聚糖产生交叉反应，基于这些特性该单克隆抗体可用于（1,3）-β-D葡聚糖的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。
附图说明
图1抗体AG10的纯化后蛋白电泳图；1. AG10; 2. Marker
图2抗体DD1的纯化后蛋白电泳图；3. Marker ; 4. DD1
图3抗体AG10的腹水效价测定结果；
图4抗体DD1的腹水效价测定结果；
图5抗体AG10的交叉反应测定结果；1、1，3-β-D葡聚糖，2、隐球菌荚膜多糖，3、白色念珠菌甘露聚糖，4、曲霉菌半乳甘露聚糖，5、肽聚糖，6、脂多糖；
图6抗体DD1的交叉反应测定结果；1、1，3-β-D葡聚糖，2、隐球菌荚膜多糖，3、白色念珠菌甘露聚糖，4、曲霉菌半乳甘露聚糖，5、肽聚糖，6、脂多糖；
图7 测定样本离群值检验分析；
生物材料：AG10，保藏日期为2021年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 21918；
生物材料：DD1，保藏日期为2021年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 21919。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，其中一株生物材料命名为AG10，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No. 21918；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2021年3月24日，检测为存活。另有一株鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株生物材料命名为DD1，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No. 21919；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2021年3月24日，检测为存活。
本发明涉及鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗（1,3）-β-D葡聚糖基因工程抗体的研发奠定了基础。
鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生的抗体AG10，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ IDNO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1GFNIKDYYMH
SEQ ID NO:2WIDPEHGDTEYAPKFQG
SEQ ID NO:3YGNFWYFNV
SEQ ID NO:4SASSSVSYLH
SEQ ID NO:5DTSKLSS
SEQ ID NO:6QQWSSNPYT
抗体AG10重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:7
GAEVVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEHGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAHLQLSSLTSEDAAVYYCNAYGNFWYFNVWGAGTTLTVSSAKT
轻链可变区序列
SEQ ID NO:9
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYLHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLSSGVPARFSGSGSGTSFSLTISSMEVEDAATYYCQQWSSNPYTFGGGTKLEIKR
编码抗体AG10重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码抗体AG10的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:8
GGGGCAGAGGTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGCATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCCACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACGCTGCCGTCTATTACTGTAATGCGTATGGTAACTTCTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGCTCACCGTCTCTTCAGCCAAAACA
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:10
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGTCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTTCTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGTTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGTACACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生的抗体DD1，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ IDNO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3；
SEQ ID NO:11GYSITSDYYWS
SEQ ID NO:12YIKYDGSNKYNPSLQN
SEQ ID NO:13VTYTAYFAY
SEQ ID NO:14KASQDINKYIG
SEQ ID NO:15YTSTLQP
SEQ ID NO:16LQYDNLWT
抗体DD1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:17
GPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSDYYWSWIRQFPGNKLEWMGYIKYDGSNKYNPSLQNRISITRDPSENQFFLDLSAVTTEDTARYYCARVTYTAYFAYWGQGTLVTVSAAKT
轻链可变区序列
SEQ ID NO:19
DIVMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIGWYQHKPGKGPRLLILYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKLEIKRAD
编码抗体DD1重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，编码抗体AG10的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
重链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:18
GGACCCGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTATTCCATCACCAGTGATTATTATTGGAGCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAATTGGAATGGATGGGCTACATAAAATACGACGGTAGCAATAAGTATAATCCATCTCTCCAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACCCATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGGACTTGAGTGCTGTGACTACTGAGGACACAGCAAGATATTACTGTGCAAGAGTAACTTACACAGCCTACTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACG
轻链可变区核苷酸序列
SEQ ID NO:20
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGGCAAGCCAAGACATTAACAAGTATATAGGTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATTCTTTACACATCTACATTACAGCCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTACTATTGTCTACAGTATGATAATCTGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGC
杂交瘤细胞AG10和杂交瘤细胞DD1所产生的鼠源性抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体可用于检测（1,3）-β-D葡聚糖抗原，由这种鼠源性抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体制备的腹水与（1,3）-β-D葡聚糖反应效价高达106，并且其不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、曲霉菌半乳甘露聚糖产生交叉反应，基于这些特性该单克隆抗体可用于（1,3）-β-D葡聚糖的检测。具体可将其制备成体外诊断试剂盒或微流体芯片。例如可制成化学发光法试剂盒，其中抗体DD1用于制备磁珠包被物，抗体AG10用于制备酶标结合物，制备得到的试剂盒检测能力与G实验检测能力比较，具有很高的检测符合率。另外，也可将抗体AG10用于制备磁珠包被物，抗体DD1用于制备酶标结合物，但从效果上比较，其检测能力稍弱。
下面结合附图对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株的筛选
取10mg/ml 海带多糖，3ml。冰浴，缓慢加入100mg/ml CDAP 150ul。1min后，加入0.1M TEA调pH 9.0，混匀，加入2.5ml 1M ADH，调pH 8.0，4℃反应2h，0.01M PBS 3500D透析24h。上述溶液加入233ul 21.5mg/ml BSA，加入122mg EDAC，使其终浓度为0.15M，4℃反应2h。0.02M PBS 50kD透析过夜，离心后鉴定。用于动物免疫。
首次免疫剂量为50ug/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，皮下多点注射，与二次免疫间隔时间为2周；二次免疫免疫剂量为50ug/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，腹腔注射，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：8000以上进行细胞融合。
融合前3天免疫50ug糖，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合（以10：1比例），融合时在37℃水浴的环境下，将50%的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。
融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测OD值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至 24 孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37°C、5% CO2孵箱培养；培养 10 天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24 孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为AG10 和DD1，分别为鼠源IgG1亚型和鼠源IgG2b亚型，轻链为κ链。
实施例2：鼠源性抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体的制备
2.1 腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的抗体进行粗纯，粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。纯化后结果见附图1和附图2。
2.2 单克隆抗体效价检测
以间接ELISA方法进行腹水效价测定。包被（1,3）-β-D葡聚糖10ug/ml，100ul/孔。1%BSA作为封闭液。将腹水从1：1000开始进行倍比稀释，共稀释12个梯度，Promega酶标抗体作为二抗1：6000稀释后使用，OD为450nm读值，同时设定不包被组进行对照，抗体稀释2048000倍时的OD值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达1：2048000。结果见附图3和附图4，抗体AG10 和抗体DD1制备的腹水与（1,3）-β-D葡聚糖反应效价高达106。
2.3 与其他多糖的交叉反应性
用间接ELISA方法检测单克隆抗体与其他糖的交叉反应性。将隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-D葡聚糖和曲霉菌半乳甘露聚糖按照10ug/ml浓度进行包被，纯化后的抗体作为一抗，Promega抗鼠酶标抗体作为二抗。结果见图5和图6。可见抗体AG10 和抗体DD1与其他糖无交叉反应，表明该抗体具有很强的特异性。
实施例3：鼠源性抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体的基因验证
RT-PCR法克隆Ig可变区基因
总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法（试剂盒购自Invitrogen）提取AG10 和DD1杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶（购自Invitrogen）将总RNA逆转为cDNA文库。
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’（SEQ ID NO:11）
重链可变区下游引物
P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’（SEQ ID NO:12）
轻链前导肽上游引物
P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’（SEQ ID NO:13）
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’（SEQ ID NO:14）
配制PCR反应体系（50μl）如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10 X pfu Buffer Ⅱ:5μl；ddH2O:补足至50μl。
反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：
VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple) 载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。
连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系（25μl）如下：
菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10 μM) ：1μl；dNTP Mixture (各2.5Mm) 2 μl；Taq DNA聚合酶 (5U/μl)：0.5 μl；10×Taq Buffer (Mg2+ plus)：2.5 μl；补水至25μl。反应条件同前。
选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体AG10 和DD1的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。
实施例4：（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒（化学发光法）的制备及应用
基于上述抗体，通过磁微粒化学发光免疫分析技术，配套“全自动化学发光酶免分析仪”，开发出（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒（化学发光法），并进行了临床样本检测，试剂盒制备过程及临床样本检测结果如下。
4.1 磁珠包被物制备
使用0.1mg/mL的EDAC溶液活化羧基化的磁珠，加入抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体DD1，标量为2mg/mL，标记1h，封闭1h，洗涤3次，沉淀使用偶联缓冲液容至磁珠加入体积的4倍。使用PBS将磁珠包被抗体稀释10倍，再加入Tris粉末使其终浓度为0.1M，混匀，分装，冻干。
4.2 酶标结合物制备
采用高碘酸钠氧化进行辣根过氧化物酶（HRP）与抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体AG10的偶联标记，首先，称取10mgHRP，溶于去离子水，加入10mM的高碘酸钠溶液，4℃避光反应30min，加入乙二醇终止后，加入10mg该抗体，装入50KD透析袋中，在pH=9.6的碳酸钾溶液中反应6h，取出后加入硼氢化钠，反应2h后缓慢加入饱和硫酸铵进行沉淀，沉淀静置1h后进行高速离心，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，PBS过夜进行透析，次日取出后高速离心弃去上清，加入等体积甘油保存于-20℃。用时使用HRP抗体稀释液稀释HRP标记的抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体5000倍，分装。
4.3 组装试剂条
将磁珠包被物、酶标结合物、样本稀释液、洗液、发光底物溶液（A液和B液）、吸头、检测仓按规定进行组装，制备成试剂条。
4.4 临床样本检测
将（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒（化学发光法）作为考核系统，与天津喜诺生物医药有限公司真菌（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒（显色法），即G实验作为参比系统，进行对比试验，测定120例临床样本，对测定样本进行离群值检验，结果显示本次临床试验无离群点出现；对考核系统与参比系统每个样本测定值之差与相应两系统测试均值作散点图进行绝对偏倚分析以及对考核系统与参比系统每个样本测定值之比值与相应两系统测试均值作散点图进行相对偏倚分析，从偏差图可以分析出考核系统与参比系统呈混合型变化。如图7所示，以参比试剂的测定结果为X 轴，以考核试剂的测定结果为Y 轴作散点图，从回归线的散点图中可以看出，拟合回归直线的线性相关系数为0.9998，表明考核系统与参比系统之间不存在系统差异。
本试剂盒配套全自动化学发光酶免分析仪，采用化学发光免疫分析技术进行（1,3）-β-D葡聚糖的定量检测，不同于传统的G实验以鲎血变形细胞提取物为原料，采用生化方法进行（1,3）-β-D葡聚糖的检测，本方法创造性地通过制备抗（1,3）-β-D葡聚糖地单克隆抗体，实现了（1,3）-β-D葡聚糖的免疫学方法检测，摆脱了试剂开发过程中对鲎血的依赖，与传统方法对比检测符合率高。认为以该抗体为原料开发的试剂盒具有较好的临床应用价值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津一瑞生物科技股份有限公司
北京金山川科技发展有限公司
天津喜诺生物医药有限公司
<120> 鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
<130> 2021
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ile Asp Pro Glu His Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asn Val
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Ala Glu Val Val Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln
20 25 30
Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu His
35 40 45
Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr
50 55 60
Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Tyr Gly Asn Phe Trp
85 90 95
Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala
100 105 110
Lys Thr
<210> 8
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggggcagagg ttgtgaggtc aggggcctca gtcaagttgt cctgcacagc ttctggcttc 60
aatattaaag actactatat gcactgggtg aaacagaggc ctgaacaggg cctggagtgg 120
attggatgga ttgatcctga gcatggtgat actgaatatg ccccgaagtt ccagggcaag 180
gccactatga ctgcagacac atcctccaac acagcccacc tgcaactcag cagcctgaca 240
tctgaggacg ctgccgtcta ttactgtaat gcgtatggta acttctggta cttcaatgtc 300
tggggcgcag ggaccacgct caccgtctct tcagccaaaa ca 342
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Val Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcct ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacttgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgt cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctctttc tctctcacaa tcagcagcat ggaggttgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtacacgtt cggtggtggg 300
accaagctgg aaataaaacg g 321
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Asn
1 5 10 15
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Val Thr Tyr Thr Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser
1 5 10 15
Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
20 25 30
Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp
35 40 45
Gly Ser Asn Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Asn Arg Ile Ser Ile Thr
50 55 60
Arg Asp Pro Ser Glu Asn Gln Phe Phe Leu Asp Leu Ser Ala Val Thr
65 70 75 80
Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Thr Tyr Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
100 105 110
Lys Thr
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggacccggcc tcgtgaaacc ttctcagtct ctgtctctca cctgctctgt cactggctat 60
tccatcacca gtgattatta ttggagctgg atccggcagt ttccaggaaa caaattggaa 120
tggatgggct acataaaata cgacggtagc aataagtata atccatctct ccaaaatcga 180
atctccatca ctcgtgaccc atctgagaac cagtttttcc tggacttgag tgctgtgact 240
actgaggaca cagcaagata ttactgtgca agagtaactt acacagccta ctttgcttat 300
tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcagccaaaa cg 342
<210> 19
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Leu Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
100 105
<210> 20
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gacattgtga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60
atcacttgca aggcaagcca agacattaac aagtatatag gttggtacca acacaagcct 120
ggaaaaggtc ctaggctgct cattctttac acatctacat tacagccagg catcccatca 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240
gaagatattg caacttacta ttgtctacag tatgataatc tgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgc 329

Claims (10)

1.鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为AG10，保藏编号为CGMCCNo.21918；或者，命名为DD1，保藏编号为CGMCC No.21919。
2.鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体，其特征在于：抗体AG10包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ IDNO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
或者，
抗体DD1，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3。
3.根据权利要求2所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体，其特征在于：抗体AG10重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
或者，
抗体DD1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO:19所示。
4.根据权利要求2或3所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体，其特征在于：抗体AG10由保藏编号为CGMCC No.21918的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生；
抗体DD1由保藏编号为CGMCC No.21919的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖杂交瘤细胞株产生。
5.核酸分子，其特征在于：包含编码权利要求2或3所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体的核苷酸。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码抗体AG10的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体AG10的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，
所述核酸分子编码抗体DD1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体DD1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
7.权利要求2-4中任一所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体在制备检测（1,3）-β-D葡聚糖抗原试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体在制备检测（1,3）-β-D葡聚糖抗原试剂中的应用，其特征在于：将鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
9.检测（1,3）-β-D葡聚糖的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2-4中任一所述的鼠抗（1,3）-β-D葡聚糖单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的检测（1,3）-β-D葡聚糖的试剂盒，其特征在于：抗体DD1用于制备磁珠包被物，抗体AG10用于制备酶标结合物；或者，抗体AG10用于制备磁珠包被物，抗体DD1用于制备酶标结合物。
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