CN113249263B - 枯草芽孢杆菌ujswl01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明筛选获得一株枯草芽孢杆菌UJSWL01，保藏编号为CGMCCNo.22175，该菌株耐受性广，环境pH对降解能力影响小，在水处理中具有重大意义，对人体无毒无害，安全性高。该菌可作为新型生态制剂的良好菌株，具有较好的应用前景。

Description

枯草芽孢杆菌UJSWL01及其应用
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌UJSWL01及其应用，属于利用微生物对水治理的技术领域。
背景技术
近年来，随着全球湖泊富营养化的加剧，放线菌等微生物次生代谢所产生的嗅味物质(T&O)已经成为湖泊水质控制的普遍问题。最常见的嗅味物质(T&O)主要化合物有Geosmin(GSM,earthy)、2-methyloisoborneol(2-MIB,musty)、2,4,6-trichloroanisole(2,4,6-TCA,musty/moldy)、2-ispropyl-3-methoxy pyrazine(IPMP)和2-isobutyl-3-methoxy pyrazine(IBMP)。它们在光合细菌生长过程中合成，淡水中已知浓度的嗅味化合物不具有不良病理效应，但长时间暴露在气味中会对人体健康产生负面影响，从焦虑、不安或抑郁等情绪压力，到眼睛刺激、头痛、呼吸问题、恶心或呕吐等身体症状。
水处理厂的常规处理过程，如混凝、沉淀和氯化，无法有效去除水源中的嗅味物质。嗅味物质去除是一个极其复杂的过程，嗅味物质处理技术分为三类，即化学(热氧化、催化氧化、臭氧化)、物理(冷凝、吸附、吸收)和生物(微生物降解法、生物接触氧化法、生物滤池、生态耦合等方法)。
物理和化学技术应用广泛，活性炭等吸附剂已被广泛使用和研究，通常在水处理厂中用于严重爆发期间的处理，但将嗅味物质去除到低于检测阈值需要大量活性炭，成本高，且在天然水中有机化合物(NOM)颗粒大小和浓度比嗅味物质高，大大降低了活性炭的吸附能力。其他处理方法包括使用不同的催化剂进行紫外线辐射(UV)、臭氧化和高级氧化过程(AOP)。AOP依赖于高反应性的羟自由基，该自由基是非选择性时，能够氧化富含电子生物有机化合物，但添加化学晶是昂贵的，并可能导致形成消毒副产物(DBPs)。
在过去的几年中，生物处理已广泛用于去除饮用水和废水中污染物。生物技术是目前公认的最佳的嗅味物质处理技术，特别是生物滤池、砂滤池始终用于大多数水处理厂，并且在大多数情况下，这些滤池可增加生物活性，已经发现，砂子生物过滤对于去除2-MIB/GSM有效。与物理化学相比，生物降解过程在本质上通常是氧化，产生的化合物如二氧化碳、水、硫酸盐和硝酸盐是生态安全的。
发明内容
本发明从中国无锡太湖(N31°15’，E120°12’)藻类聚集区域的淤泥样品中筛菌获得一株芽孢杆菌属的嗅味物质降解菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UJSWL01，该菌株已于2021年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22175，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。将基因组上传至NCBI，得到的GenBank登录号为8010384。
枯草芽孢杆菌UJSWL01能够高效降解嗅味物质(降解率可达99％以上)，该菌可通过固定化方法应用于饮用水源的净化；该枯草芽孢杆菌UJSWL01可快速降解嗅味物质，可利用嗅味物质作为碳源生长，从而促进嗅味物质降解。
本发明的菌株枯草芽孢杆菌UJSWL01的形态特征：
菌株枯草芽孢杆菌UJSWL01为革兰氏阳性菌，细胞直径0.7-0.8μm，有芽孢，有鞭毛，具有运动性。在LB平板上培养36h后可观察到浅黄的、表面光滑的菌落，菌落粘稠，边缘整齐。
枯草芽孢杆菌UJSWL01的降解培养基特征：
好氧，生长温度范围5-37℃，最适生长温度范围为30-35℃。可以在pH5.0-8.0的环境生长，其中最适pH为6.5-7.0。
本发明的有益效果：本发明的菌株可有效降解嗅味物质的枯草芽孢杆菌，菌株耐受性较广，环境pH对细菌降解影响较小，无论在环境偏酸、偏碱均能高效降解嗅味物质，在饮用水治理中具有重大意义，将枯草芽孢杆菌UJSWL01接种于饮用水体中，安全性高，相比化学和物理，经济有效，不会造成二次污染；且菌株在较高浓度时也不会对人体产生毒害作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为枯草芽孢杆菌UJSWL01在不同pH下的降解效果图；
图2为枯草芽孢杆菌UJSWL01在不同温度下的降解效果图；
图3为枯草芽孢杆菌UJSWL01对2-MIB初始浓度为200μg/L的嗅味物质降解过程曲线；
图4为固定化枯草芽孢杆菌UJSWL01在固定床中降解效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
具有降解嗅味物质功能的枯草芽孢杆菌UJSWL01的富集及筛选
在分离筛选中，所用的样品为太湖淤泥样，用灭菌后的磷酸盐缓冲溶液，稀释样品，得到样品液。将样品液通过LB培养基富集培养稀释涂至LB平板中，在30℃、培养72h后，挑选长势良好、不同形态的菌落，分离纯化直至形成菌落形态一致的单菌落。
将分离出来的单菌进行嗅味物质降解试验，筛选出降解能力最强的单菌。该枯草芽孢杆菌UJSWL01菌种保藏于CGMCC No.22175，该菌在含有20μg/L嗅味物质的无机盐培养基中30℃培养72h后，可降解99％以上的嗅味物质，使其中嗅味物质的含量符合国家标准。
筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时将进行活化，获得一定数量的纯种菌。
枯草芽孢杆菌UJSWL01培养方法，包括如下步骤：
菌种活化：将处于休眠状态的菌种接入LB培养基中，于30℃活化72h。
上述所用的培养基配置方法如下：
磷酸盐缓冲溶液按所用的培养基按取80％1/15mol磷酸氢二钠、10％1/15mol磷酸二氢钠配置，混匀即可得到pH为7.38的磷酸盐缓冲溶液，并在121℃灭菌30min。
LB培养基按1L蒸馏水、1％蛋白胨、0.5％酵母膏粉、0.5％NaCl的配方配置，并在121℃灭菌30min，pH自然。
LB平板按1L蒸馏水、1％蛋白胨、0.5％酵母膏粉、0.5％NaCl、2％琼脂粉的配方配置，并在121℃灭菌30min，pH自然。
无机盐培养基按1L蒸馏水、0.01％NH4NO3、0.01％K2HPO4、0.005％MgSO4.7H20、0.002％KCl的配方配置，并在121℃灭菌30min，pH控制在7.5。
枯草芽孢杆菌UJSWL01菌种鉴定
1、形态观察
挑取单菌落，采用三区划线方法接种于LB平板表面，30℃恒温箱中培养36h观察菌落形态特征。UJSWL01菌株菌落照片见图1，该菌落表面光滑，有突起；菌落呈现淡黄色，不透明。
2、分子鉴定
取UJSWL01菌株纯培养菌，以基因组DNA为模板，利用通用引物27F/1492R(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rRNA扩增并测序，将测序所得到的基因序列经Blast搜索比对，该菌与Bacillus subtilis有较高同源性，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。结合形态及16S rRNA序列分析，鉴定为Bacillus subtilis，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UJSWL01。
不同pH条件下枯草芽孢杆菌UJSWL01降解嗅味物质试验
本试验无机盐培养基装液量为100mL，使用1M NaOH和HCl调节降解培养基pH为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0这六个梯度，121℃灭菌30min，在超净工作台中转接1mL活化菌液，在30℃、150r/min条件下培养72h后，取样，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用的方法测定嗅味物质浓度。
不同温度条件下枯草芽孢杆菌UJSWL01降解嗅味物质试验
本试验无机盐培养基装液量为100mL，121℃灭菌30min，在超净工作台中转接1mL活化菌液，调节摇床温度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，摇床转速固定在150r/min条件下培养72h后，取样，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用的方法测定嗅味物质浓度。
以上实验除了考察因素外，降解条件都是枯草芽孢杆菌UJSWL01培养液以1％(v/v)的接种量接种于含嗅味物质的无机盐培养基中，在30℃、150rpm下培养72h后，取样测定各条件培养基中嗅味物质的含量。以培养pH值、温度为横坐标，降解效率为纵坐标绘制各自曲线。由图2可知，枯草芽孢杆菌UJSWL01最适降解pH为6.5，温度为30℃，当环境pH在5.0-8.0之间时，枯草芽孢杆菌UJSWL01均能高效降解嗅味物质，降解率均在70％以上。实施例中用到的嗅味物质均为2-甲基异茨醇。
枯草芽孢杆菌UJSWL01对高初始浓度嗅味物质浓度降解的探究
将枯草芽孢杆菌UJSWL01接种至浓度为200μg/L的嗅味物质溶液的无机盐培养基中，判断解枯草芽孢杆菌UJSWL01对不同浓度嗅味物质的降解能力，具体操作如下：从平板中取枯草芽孢杆菌UJSWL01接种到100mL LB培养基中，在30℃150r/min的振荡培养箱中培养72h，培养后的LB培养基1000r/min5min离心取沉淀，使用灭菌水水洗3-4次，将沉淀加入到100mL无机盐培养基中制成菌悬液；从菌悬液中取1mL接种于含100mL无机盐的锥形瓶中，对照组加灭活的细菌，添加嗅味物质浓度至200μg/L，30℃，150r/min摇床培养，定时取样测定嗅味物质的浓度，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用的方法测定嗅味物质的浓度。结果如图3所示，枯草芽孢杆菌UJSWL01经过24h后，降解率趋于稳定，降解率达到99％以上。
枯草芽孢杆菌UJSWL01固定化方法
固定化载体按1L蒸馏水、2～3.5％海藻酸钠粉末、0.2～0.4％竹炭颗粒的配方配置，并在121℃灭菌30min。优选的，按1L蒸馏水、3％海藻酸钠粉末、0.3％竹炭颗粒的配方配置，并在121℃灭菌30min。
将活化的枯草芽孢杆菌UJSWL01倒入灭菌的50mL离心管中，于5000rpm离心10min，弃上清液，无菌水洗涤2-3次后，弃上清液，保留沉淀。
将沉淀与固定载体混合均匀，使用灭菌的500mL玻璃注射器压入CaCl2溶液中，静置30min，灭菌的筛网过滤，无菌水洗涤，存放于4℃冰箱备用。
上述CaCl2溶液按1L蒸馏水、2％CaCl2的配方配置，并在121℃灭菌30min。
固定化枯草芽孢杆菌在固定床中降解河水中嗅味物质试验
本试验在固定床填充率55％、停留时间3.5h、嗅味物质初始浓度200ng/L下运行，运行10d，在9h、12h、15h、18h、21h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、180h、192h、204h、216h、228h、240h时收集出水口样品，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用的方法测得嗅味物质浓度。
所用气相色谱-质谱仪：Agilent 7890N-5977B，美国安捷伦公司。采用顶空萃取时间为50分钟。进样方式：手动进样。进样口：GC。质谱仪：启用。色谱条件：柱型为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯度氦气，流速为1.2mL/min，进样温度为270℃，起始柱温40℃，保持1min，以5℃/min到130℃，再以8℃/min到200℃，最后以12℃/min速度升温到270℃，保持7min。质谱条件：离子源温度为230℃，四级杆温度为270℃，电离方式为EI，质量范围为50m/z到300m/z。该处为2-甲基异茨醇利用SPME-GC-MS测定方法。
固定化后的枯草芽孢杆菌UJSWL01生物量高且稳定、不易流失、活性高、耐毒害能力强，可连续应用，非常适合应用于枯草芽孢杆菌UJSWL01对嗅味物质的降解中。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）UJSWL01，其保藏编号为CGMCC No.22175，保藏日期：2021年4月12日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）UJSWL01在降解水体中嗅味物质中的应用，所述的嗅味物质为2-甲基异茨醇。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水体为饮用水体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）UJSWL01用海藻酸钠、竹炭颗粒和氯化钙固定后用来降解水体中的嗅味物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，固定化载体按1 L蒸馏水、2～3.5%海藻酸钠粉末、0.2～0.4%竹炭颗粒的配方配制 ，并在121 ℃灭菌30 min。
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