CN113244415A - 一种纳米造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于分子影像领域,提供了一种纳米造影剂及其制备方法和应用,该纳米造影剂的制备方法包括以下步骤:将钆源、镥源、聚乙二醇和尿素置于溶剂中进行混合,得到混合溶液;将混合溶液进行加热反应,得到所述纳米造影剂。本发明实施例采用一步均相沉淀法可大量合成聚乙二醇修饰的二元稀土纳米造影剂。该纳米造影剂显示了良好的胶体稳定性、溶液分散性。体外成像结果显示该纳米造影剂具有高效的T1权重MRI成像能力;体内对皮下荷瘤小鼠模型成像,结果此纳米造影剂可用于活体层面的T1加权MRI成像和CT双模式成像能力。体内及体外毒性研究结果显示,该纳米造影剂具有较低生物毒性并具有很好的生物兼容性。
Description
技术领域
本发明属于分子影像领域,尤其涉及一种纳米造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前,医学影像学在临床中被广泛的应用于疾病的诊断,常用的成像技术包括磁共振成像(MRI)、X射线断层成像(CT)、正电子发射断层成像(PET)、放射性同位素成像(SPECT)、超声的优缺点,在应用上也具有互补性。如CT对平片检查较难显示的部分,例如同心、大血管重叠病变的显示,更具有优越性。MRI也存在不足之处,它的空间分辨率不及CT。对于某些特殊病例,单一的成像方式无法提供足够的信息来帮的信息。
近年来,随着纳米技术的飞速发展,具有多模式成像功能的纳米造影剂不断涌现。其可以实现单一注射后,在不同成像模式下得到更为丰富的信息,提高疾病诊断的准确度。镧系元素(Ln)独特的磁学性质主要来源于其4f外层电子结构.利用Ln磁学性质合成的无机稀土纳米造影剂被广泛用作磁共振成像(MRI)造影剂。(CAs)稀土Gd作为核磁共振成像(MRI)技术的造影试剂已经在临床上使用,其可以在1H-NMR 谱图上分辨出正常的和非正常的器官;而Lu元素高的原子序数、强的X射线吸收及于临床电压下合适的K能级能量,因此基于Lu的纳米材料能够作为CT造影剂被研究。然而,合成方法复杂、合成产率低、合成量小等因素极大的限制了这些稀土基纳米造影剂在临床中的实际应用。
因此,目前急需探索出一种简易、高效、可大量合成且兼容性优良的高效多模式造影剂。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种纳米造影剂的制备方法,旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
将钆源、镥源、聚乙二醇和尿素置于溶剂中进行混合,得到混合溶液;
将混合溶液进行加热反应,得到所述纳米造影剂。
作为本发明实施例的一个优选方案,所述钆源、镥源和尿素的摩尔比为(2~4):(2~4):(150~250)。
作为本发明实施例的另一个优选方案,所述钆源为硝酸钆,当然,钆源也可以采用其他钆盐。
作为本发明实施例的另一个优选方案,所述镥源为硝酸镥,当然,钆源也可以采用其他镥盐。
作为本发明实施例的另一个优选方案,每2~4mmol的镥源所要添加的聚乙二醇的量为1~3g。
作为本发明实施例的另一个优选方案,每1~3g的聚乙二醇所要添加的溶剂的量为300~500mL。
作为本发明实施例的另一个优选方案,所述溶剂为去离子水,当然,溶剂也可以采用其他能够用于溶解上述原料的有机或无机溶剂。
作为本发明实施例的另一个优选方案,加热反应的温度为85~95℃。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的纳米造影剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的纳米造影剂在磁共振成像和/或X射线断层成像中的应用。
本发明实施例提供的一种纳米造影剂的制备方法,采用一步均相沉淀法可大量合成聚乙二醇(PEG)修饰的二元稀土纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。该纳米造影剂显示了良好的胶体稳定性、溶液分散性。体外成像结果显示该纳米造影剂具有高效的T1权重MRI成像能力;体内对皮下荷瘤小鼠模型成像,结果此纳米造影剂可用于活体层面的T1加权MRI成像和CT双模式成像能力。体内及体外毒性研究结果显示,该纳米造影剂具有较低生物毒性并具有很好的生物兼容性。
附图说明
图1为实施例8制得的纳米造影剂的合成及相关表征的结果图。
图2为实施例8制得的纳米造影剂的细胞毒性实验结果图。
图3为实施例8制得的纳米造影剂的CT模式成像效果图。
图4为实施例8制得的纳米造影剂的MRI成像效果图。
图5为实施例8制得的纳米造影剂的长期毒性实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将2mmol的Gd(NO3)3·6H2O、2mmol的Lu(NO3)3·6H2O、1g的PEG 6000和250mmol尿素依次加入到500mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至85℃,继续进行搅拌反应2h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例2
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将4mmol的Gd(NO3)3·6H2O、4mmol的Lu(NO3)3·6H2O、3g的PEG 6000和150mmol尿素依次加入到300mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至95℃,继续进行搅拌反应4h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例3
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将2mmol的Gd(NO3)3·6H2O、4mmol的Lu(NO3)3·6H2O、1g的PEG 6000和150mmol尿素依次加入到300mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至88℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例4
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将4mmol的Gd(NO3)3·6H2O、2mmol的Lu(NO3)3·6H2O、3g的PEG 6000和250mmol尿素依次加入到500mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至92℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例5
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将2.5mmol的Gd(NO3)3·6H2O、2.5mmol的Lu(NO3)3·6H2O、2.5g的PEG 6000和180mmol尿素依次加入到350mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至90℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例6
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将3.5mmol的Gd(NO3)3·6H2O、3.5mmol的Lu(NO3)3·6H2O、1.5g的PEG 6000和220mmol尿素依次加入到450mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至90℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例7
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将2.8mmol的Gd(NO3)3·6H2O、3.2mmol的Lu(NO3)3·6H2O、2g的PEG 6000和180mmol尿素依次加入到420mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至90℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实施例8
该实施例提供了一种纳米造影剂的制备方法,其包括以下步骤:
S1、将3mmol的Gd(NO3)3·6H2O、3mmol的Lu(NO3)3·6H2O、2g的PEG 6000和200mmol尿素依次加入到400mL的去离子水中进行混合,并于室温下搅拌2h至完全溶解,得到混合溶液。其中,六水合硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O、Lu(NO3)3·6H2O、聚乙二醇(PEG 6000)、尿素均可购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;去离子水来源于Milli-Q超纯水系统。
S2、将上述混合溶液加热至90℃,继续进行搅拌反应3h,反应结束后离心收集产物,然后用水充分洗涤三次,并在真空干燥箱中进行干燥,即可得到纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。
实验例:
一、实验仪器:能量色散X射线光谱的场发射扫描电子显微镜(FE-SEM S4800,Hitachi)用于确定所制备样品的形态和组成;傅里叶变换红外光谱采用Bruker Vertex 70FT-IR光谱仪测试分析。
二、实验方法:
1、细胞培养:用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)来培养HeLa和HEK 293T细胞,并加入10%热灭活的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、NaHCO3(1.5 g/L)、链霉素(100 mg/mL)、谷氨酰胺(4 mmol/L)以及葡萄糖(4.5 g/L),在37℃,含5%(v/v)CO2的空气中培养。
2、细胞毒性实验:将HeLa和HEK 293T细胞以每孔1×105个细胞(100 μL/孔)的密度接种在96孔板孵育24小时。然后,将细胞与不同材料共孵育额外12小时或24小时。之后,用PBS洗涤细胞。将MTT溶液加入96孔板,并将96孔板放入在CO2培养箱中再孵育4小时。用Bio-Rad model-680酶标仪测定490 nm处甲臜的吸光度值。存活率表示处理组与未处理对照组的百分比,三次测量取平均值。
3、纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)的CT成像性能:为了评价纳米造影剂的CT成像效果,将实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)与临床用碘比醇试剂以不同的浓度分别分散于PBS溶液中,浓度范围设置为0至100 mM。CT成像图像于Philips 256CT扫描系统(Philips Medical System)获得。成像参数设置如下:厚度,0.9 mm;螺距,0.99;扫描电压,120 KVp;扫描电流,300 mA;视场大小,350 mm;旋转时间,0.5 s;工作速率,158.9 mm/s。
4、纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)的MRI成像性能:为了评价纳米造影剂的T1权重MRI成像效果,将实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)的PBS溶液以不同的浓度固定于含有1%琼脂糖水凝胶的微量离心管中。样品制备完毕后,将其置于1.5T的MagnetomEspree MIR(西门子)成像系统,考察其MRI成像能力。
5、动物实验:实验动物吉林大学药理学实验中心(中国,长春):雌性ICR小鼠(6-8周龄,体重18-22 g)。环境温度和相对湿度分别保持在22±2℃和55±5%。在实验之前允许小鼠至少3天以适应实验室环境,允许小鼠自由进食实验室饲料和水。使用遵循NIH动物使用指南进行,符合吉林大学动物伦理委员会标准,所有实验设计均基于减少动物痛苦的初衷。
6、荷瘤小鼠建立及给药:将5×106个4T1细胞皮下接种于ICR小鼠右前肢腋下,待其生长至平均大小为50~500 mm3后,尾静脉给小鼠注射实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)(100 μL,2 mM)。于注射后动态监测MRI及CT影像。
7、MRI成像:采用磁共振仪扫描获取体内及体外T1加权MRI图像。将不同浓度的实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)和0.9% NaCl 溶液(生理盐水)封装于EP管中,其中,生理盐水作为空白对照,随后用3.0T 核磁共振仪进行扫描。小鼠腹腔注射10%水合氯醛, 将其麻醉。尾静脉注射实施例8制得的纳米造影剂(0.4 mg/mL)。T1加权MRI成像参数如下:重复时间(TR),3000 ms;回波时间(TE),104.6 ms; 扫描野(FOV),200 mm×200mm;层厚,2.0 mm。
8、CT成像:小鼠给药处理同上。CT 扫描参数:层厚 0.9 mm。螺距0.99,管电压120kVp,管电流300 mA,扫描野(FOV)350 mm,通过后处理重建获得胃肠道矢状位图像及三维图像。
9、长期毒性:将小鼠分为两组:生理盐水对照组和实施例8制得的纳米造影剂给药组,每组 6 只。两组小鼠分别尾静脉注射实施例8制得的纳米造影剂/生理盐水,观察小鼠3周,记录其行为。3周后,取该小鼠主要器官,采用10%甲醛溶液浸泡固定,石蜡包埋后进行H&E染色,显微镜(Leica Biosystems)下观察切片结果。
三、实验结果:
1、纳米造影剂的合成及相关表征
为了简便且大量合成PEG分子修饰的MRI/CT双模式纳米造影剂,PEG-Gd/Lu(OH)CO3纳米造影剂首先通过尿素参与的均相沉淀法获得。因尿素于高温下可以分解为OH-和CO3 2-,生成的阴离子可以与金属阳离子作用生成沉淀,故经典的尿素参与的沉淀法常用于制备稀土元素的碱式碳酸盐。其中,实施例8制得的纳米造影剂的合成及相关表征如图1所示。从图1的a可以看出,运用本发明实施例提供的制备方法可单次能够合成克级的纳米造影剂。从图1的b(SEM图像)可以看出,实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)为单分散性良好的球形粒子,平均半径约为200 nm。从图1的c可以看出,EDS分析说明该纳米造影剂中含有Gd、Lu、C 及O元素。从图1的d可以看出,FTIR光谱中出现在3350 cm-1和2950cm-1附近的吸收峰分别为O-H和C-H伸缩振动峰,预示着PEG分子成功修饰在纳米造影剂表面。从图1的e可以看出该纳米造影剂可以分散于包括PBS、FBS及DMEM在内的各种溶液体系,因此该纳米造影剂呈现出极好的胶质稳定性。
2、细胞毒性实验
在将实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)作为双模式造影剂用于生物医学应用前,首先利用标准的MTT实验考察了该纳米造影剂的体外毒性,其细胞毒性实验结果如图2(图2的A为HeLa细胞的存活率随纳米造影剂浓度变化而变化的趋势图,B为HEK293T细胞的存活率随纳米造影剂浓度变化而变化的趋势图)所示,低浓度的纳米造影剂与细胞孵育24小时后未发现明显凋亡现象,甚至在较高纳米造影剂浓度下,细胞存活率也达到90%以上,这些数据证明了该纳米造影剂具有较好的生物安全性。
3、纳米造影剂的CT模式成像效果
通过CT扫描装有不同浓度实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)的EP管来评价纳米造影剂的体外CT成像效果,其结果如附图3所示。图3的A 显示出了浓度分别为 0、3.13、6.25、12.5、25和50 mg/mL时纳米造影剂的CT成像效果。可见,该纳米造影剂的CT成像能力随纳米造影剂浓度的增加而升高,并呈现良好的线性依赖关系(图3的B)。通过对BALB/C荷瘤小鼠尾静脉注射纳米造影剂悬浊液以进一步评估其体内成像效果。24h后,进行CT 扫描,结果如图3的C所示,成瘤部位成像显著加强。上述结果表明,实施例8制得的纳米造影剂具有作为CT造影剂的潜力。
4、纳米造影剂的MRI成像效果
同时,由于实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)中的Gd能够增加水中质子的纵向弛豫时间(T1),因此该纳米造影剂能够作为T1权重MRI成像造影剂被研究。采用1.5T西门子MRI成像系统研究该纳米造影剂的T1权重MRI成像能力,其结果如图4所示。如图4的A所示,与水相比纳米造影剂显示出增强的MRI信号,并且随着纳米造影剂浓度的增加,其T1权重MRI成像图也变得越来越亮,表明其可以作为T1权重MRI成像造影剂来使用。通过计算得出其纵向弛豫率为5.32 mmol-1·s-1,此值优于临床应用的T1权重MRI造影剂Gd-DTPA (3.7 mmol-1·s-)(图4的B)。综合以上实验结果,表明该纳米造影剂能够被当作MRI/CT双模式造影剂使用。通过对BALB/C荷瘤小鼠尾静脉注射纳米造影剂悬浊液以进一步评估其体内成像效果。记录注射5,10,30分钟后的MRI图, 结果如图4的C所示,成瘤部位成像显著加强。上述结果表明,实施例8制得的纳米造影剂同时具有作为MRI造影剂的潜力。
5、长期毒性实验结果
通过病理实验评估了实施例8制得的纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)的毒性。具体的,将小鼠分为实验组和对照组,尾静脉注射探针,连续观察3 周,所有小鼠均未发生行为和精神异常。将两组小鼠处死,并对主要脏器进行病理学评估,如图5(图5的A为对照组,B为实验组)所示,实验组心、肝、脾、肺、肾及胃等主要功能器官,其组织切片未见异常的病理变化。
四、实验结论:
综上所述,本发明实施例采用一步法成功合成了聚乙二醇(PEG)修饰的二元稀土纳米造影剂(PEG-Gd/Lu(OH)CO3 NPs)。该方法能够简便且大量的合成出此PEG修饰的二元稀土纳米造影剂。在该纳米造影剂中,PEG的修饰赋予其良好的溶液分散性、胶质稳定性和生物兼容性。成像研究结果表明该二元稀土纳米造影剂具有较好的T1权重MRI及CT双模式成像效果。
上述结果表明,该纳米造影剂有以下三方面优势:1.该合成简便且大量。2.具有良好生物兼容性T1权重MRI及CT双模式成像效果,且对比较强,提高肿瘤的检出率降低漏诊率。3.能够持续显影,目前的显影剂对于肿瘤显影存在的问题在于持续时间短暂,成像时窗口期已过,无法检测到肿瘤发生,而此造影剂能够持续显影,因此非常适用于临床诊断。
因此,本发明实施例提供的纳米造影剂能够成为有前途的双模式造影剂候选物,并且为造影剂的设计合成带来了机遇。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将钆源、镥源、聚乙二醇和尿素置于溶剂中进行混合,得到混合溶液;
将混合溶液进行加热反应,得到所述纳米造影剂。
2.根据权利要求1所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,所述钆源、镥源和尿素的摩尔比为(2~4):(2~4):(150~250)。
3.根据权利要求1或2所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,所述钆源为硝酸钆。
4.根据权利要求1或2所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,所述镥源为硝酸镥。
5.根据权利要求1或2所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,每2~4mmol的镥源所要添加的聚乙二醇的量为1~3g。
6.根据权利要求5所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,每1~3g的聚乙二醇所要添加的溶剂的量为300~500mL。
7.根据权利要求1所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,所述溶剂为去离子水。
8.根据权利要求1所述的一种纳米造影剂的制备方法,其特征在于,加热反应的温度为85~95℃。
9.一种如权利要求1~8中任一项所述制备方法制得的纳米造影剂。
10.一种如权利要求9所述的纳米造影剂在磁共振成像和/或X射线断层成像中的应用。
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