CN105664187B - 聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法 - Google Patents

聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法，4mmol的四水合氯化锰与10mL聚乙二醇二羧酸在通氮条件下磁力搅拌加热至90‑100℃溶解为均一溶液；继续加热到140℃反应1小时，再加热到180℃反应4小时；停止加热，冷却至室温后透析除去未反应的聚乙二醇分子和锰离子，得到水溶性的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂；将氧化锰纳米对比剂保存在4℃条件中。一步制备法制备氧化锰磁共振纳米对比剂步骤简单，对制备条件要求宽松，采用聚乙二醇二羧酸作为反应溶剂和表面活性剂制备的氧化锰纳米对比剂粒径小、大小均一、分散性好、稳定，表面修饰的聚乙二醇减少纳米粒子的非特异性吸附，所携带的羧基可用于靶向分子的连接，具有良好的生物相容性。

Description

聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法
技术领域
本发明涉及一种对比剂的制备方法，具体涉及一种聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法。
背景技术
磁共振成像技术自1973年提出后，被广泛应用于生物医学领域，并已经成为临床诊断和基础研究中必不可少的重要工具之一。磁共振分子成像利用磁共振成像技术对体内特定分子进行成像，以达到对病变早期、特异性诊断与疗效监测的目的（申宝忠，分子影像学(第二版)，北京：人民卫生出版社，2010：2-413）。磁共振分子成像除了拥有良好的组织穿透性和空间分辨率之外，磁共振成像信号的取得不依赖于结合与未结合试剂的分离或者光的使用，不易受到周围微环境的影响，因此在浑浊和悬浮样品检测中具有明显的优势（Perez J. M.； Josephson L.； O’Loughlin T.； Hogemann D.； Weissleder R. Nat. Biotech.2002, 20, 816-820.）。尽管磁共振成像技术已在临床上得到了广泛的应用，但是其灵敏度相对较低的缺陷成为限制其发展的主要障碍。
在磁共振成像技术中，对比剂的使用对于改善MRI的灵敏度以便更好地反映活体条件下生物细胞内的正常或病理状态具有重要作用。常用的MRI对比剂分为两类：一类是以氧化铁纳米粒子为基础的阴性信号对比剂（negative contrast agent），能产生强烈的T2阴性信号造影，在MRI和多模式成像中应用较多。另一类是以钆离子螯合物Gd-DTPA为代表的阳性信号对比剂（positive contrast agent），在临床上广泛使用。为了降低Gd3+本身的毒性，人们采取制备钆离子螯合物的方式来提高对比剂的生物相容性（Li W.-H.； LuoJ.；. Chen Z.-N. Inorganic Chemistry Communications.2011,14, 1898-1900.）。但螯合物的形成会降低对比剂的对比度，因为与水合钆离子的8-9个位点来说，钆离子螯合物中可与水质子交换的配位点的数目只有1-2个。另一方面，绝大多数的钆对比剂的血液循环时间较短，对组织和细胞缺少选择性，难于表面功能化也限制了其进一步应用。同时，钆离子螯合物中的Gd3+一旦去螯合或者与人体中存在的其他离子如Zn2+等交换螯合后被释放有可能会带来潜在的毒性（Tasciotti E.；Liu X. W.；Bhavane R.；Plant K.；Leonard A. D.；Price B. K.；Cheng M. M. C.； Decuzzi P.；Tour J. M.；Robertson F.；Ferrari M.Nat. Nanotechnol.2008,3,151-157.），而且有报道指出钆基对比剂会对生物体肾小管造成直接损害，引起肾细胞纤维化（沈晶； Hoppe H.； Spagnuolo S.； Froehlich J. M.；Nievergelt H.； Dinkel H. P.； Gretener S.国际医学放射学杂志，2010，3，292.）。
随着纳米技术的飞速发展，MRI纳米对比剂的开发引起了人们越来越多的关注，除了最早出现的四氧化三铁阴性纳米对比剂外，更多的阳性纳米对比剂被逐渐开发出来，比如Gd2O3纳米对比剂。与Gd-DTPA、Gd-DOTA相比，Gd2O3纳米粒子作为对比剂不但拥有更高的弛豫率，而且由于纳米粒子的特性，更易于进行表面功能化（Bridot J.-L.； Faure A.-C.；Laurent S.； Riviere C.； Billotey C.； Hiba B.； Janier M.； Josserand V.； CollJ.-L.； Elst L. V.； Muller R.； Roux S.； Perriat P.； Tillement O.J. Am. Chem. Soc.2007, 129, 5076-5084.Faucher L.； Tremblay M.； Lagueux J.； Gossuin Y.；Fortin M.-A.ACS Appl. Mater. Interfaces2012, 4, 4506-4515. Li J. J.； You J.；Dai Y.； Shi M. L.； Han C. P.； Xu K.Anal. Chem.2014, 86, 11306-11311.Sun S.-K；Dong L.-X.； Cao Y.； Sun H.-R.； Yan X.-P.Anal. Chem.2013, 85, 8436-8441.）。同时，许多研究者考虑用Mn2+替代Gd3+，因为锰是人体必需的微量元素，并且Mn2+具有作为对比剂的优良特性，如自旋磁矩大，弛豫率高等,基于Mn的MRI纳米对比剂也因此引起了人们的兴趣（Huang J.； Xie J.； Chen K.； Bu L. H.； Lee S.； Cheng Z.； Li X. G.； Chen X.Y. Chem. Commun.2014, 46, 6684-6686. Chen N.； Shao C.； Qu Y.； Li S.； Gu W.；Zheng T.； Ye L.； Yu C. ACS Appl. Mater. Interfaces.2014, 6, 19850-19857.）。
氧化锰纳米对比剂的制备通常采用两步法：首先引入高温热分解法，即以高沸点的十八烯作为溶剂，以油酸锰化合物为前体制备油酸锰纳米粒子。为了实现油酸锰的生物医学应用，再对制备得到的油酸锰纳米粒子进行表面修饰以提高其水溶性、分散性和稳定性（Na H. B.； Lee J. H.； An K.； Park Y. I.； Park M.； Lee I. S.； Nam D.-H.； KimS. T.； Kim S.-H.； Kim S.-W.； Lim K.-H.； Kim K.-S.； Kim S.-O.； Hyeon T. Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46, 5397-5401.）。但是这种制备水溶性氧化锰纳米对比剂的方法操作步骤繁杂，而且在由油相向水相的转移过程中会造成沉淀、弛豫率降低等问题。因此，开发一步法制备具有良好生物相容性和较高弛豫率的水溶性氧化锰纳米对比剂仍然十分必要。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法，解决传统合成氧化锰纳米对比剂中实验条件苛刻、操作步骤复杂繁多的缺陷。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法，包括以下步骤：
4mmol的四水合氯化锰与10mL聚乙二醇二羧酸在通氮条件下磁力搅拌加热至90-100℃溶解为均一溶液；
随后继续加热到140℃反应1小时，然后再加热到180℃反应4小时；
停止加热，冷却至室温后透析除去未反应的聚乙二醇分子和锰离子，得到水溶性的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂；
将氧化锰纳米粒子保存在4℃条件中。
进一步的，所述的聚乙二醇二羧酸的分子量为600。
本发明的有益效果是：一步制备法制备氧化锰纳米对比剂步骤简单，对制备条件要求相对宽松，另外，采用聚乙二醇二羧酸作为反应溶剂和表面活性剂，一步法制备的氧化锰纳米对比剂粒径小，在1.78nm左右，大小均一、分散性好、稳定，而且表面修饰的聚乙二醇减少纳米粒子的非特异性吸附，所携带的羧基可用于靶向分子的连接，制备的氧化锰纳米对比剂具有良好的生物相容性，在磁共振成像时有助于增强T1信号。
附图说明
图1A为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的透射电镜；
图1B为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的高分辨电镜图；
图1C为本发明所制备氧化锰纳米对比剂粒径大小分布图；
图2A为本发明所制备氧化锰纳米对比剂MRI弛豫率测定曲线图；
图2B为不同浓度水溶性氧化锰纳米对比剂的MRI图像和T1 map图；
图3为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的傅立叶变换红外吸收光谱；
图4A为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的X射线光电子能谱分析（XPS）图谱（C1s）；
图4B为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的X射线光电子能谱分析（XPS）图谱（O1s）；
图4C为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的X射线光电子能谱分析（XPS）图谱（Mn2p）；
图5为本发明所制备氧化锰纳米对比剂的细胞生物相容性评估图；
图6为组织病理分析本发明所制备氧化锰纳米对比剂在体生物相容性评估图；
图7为肾癌移植瘤裸鼠模型在尾静脉注射本发明所制备氧化锰纳米对比剂后不同时间下的磁共振成像图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法，包括以下步骤：
4mmol的四水合氯化锰与10mL聚乙二醇二羧酸在通氮条件下磁力搅拌加热至90-100℃溶解为均一溶液；随后继续加热到140℃反应1小时，然后再加热到180℃反应4小时；停止加热，冷却至室温后透析除去未反应的聚乙二醇分子和锰离子，得到水溶性的聚乙二醇修饰氧化锰纳米对比剂；将氧化锰纳米对比剂保存在4℃条件中，聚乙二醇二羧酸的分子量为600。
如图1A、图1B、图1C、图2A、图2B所示，本发明制备的氧化锰纳米对比剂粒径小，在1.78 nm左右、大小均一、分散性好、稳定，弛豫率为12.942 mM.s-1；
如图3所示，2916 cm-1处有C-H收缩峰；在1587 cm-1处有C=O振动峰；在1118 cm-1处有C-O-C振动峰，说明氧化锰纳米对比剂表面成功修饰上聚乙二醇二羧酸分子；
如图4A所示，对于C1s，284.8eV是-C-C-，286.3eV是-C-O-，289.2eV是羧基中的-COO，287.5eV是-C=O-；如图4B所示，对于O1s，531.5eV对应金属-氧结合，532.2eV是-C-O-和羧基中的氧；如图4C所示，对于Mn2p，653.8eV是Mn2p1/2，641.8eV是Mn2p3/2。XPS图谱结果说明氧化锰纳米对比剂的形成及其表面成功修饰上聚乙二醇二羧酸分子。采用聚乙二醇二羧酸作为反应溶剂和表面活性剂，一步法制备的氧化锰纳米对比剂表面修饰的聚乙二醇减少纳米粒子的非特异性吸附，所携带的羧基可用于靶向分子的连接。
如图5所示，将不同浓度的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂溶液与肾癌786-0细胞株共培养24小时后，与未加入纳米对比剂的对照组细胞相比较，发现聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂具有良好的生物相容性。
如图6所示，将制备的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂通过尾静脉注射到小鼠体内，饲养24小时和7天后解剖分离小鼠心脏、肺、肝、脾、肾5个器官，进行HE染色，与未注射聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂的小鼠作为对照组，病理结果显示聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂对小鼠的各个器官无明显毒性，生物相容性好。
如图7所示，将制备的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂通过尾静脉注射到肾癌移植瘤裸鼠体内，在不同时间点进行磁共振成像扫描，观察裸鼠的肝脏、肾脏、肿瘤等器官的T1变化，发现各器官在不同时间有不同的T1信号增强。

Claims (1)

1.一种聚乙二醇修饰的氧化锰磁共振纳米对比剂的一步制备法，其特征在于，包括以下步骤：
4mmol的四水合氯化锰与10mL聚乙二醇二羧酸在通氮条件下磁力搅拌加热至90-100℃溶解为均一溶液，聚乙二醇二羧酸的分子量为600；
随后继续加热到140℃反应1小时，然后再加热到180℃反应4小时；
停止加热，冷却至室温后透析除去未反应的聚乙二醇分子和锰离子，得到水溶性的聚乙二醇修饰的氧化锰纳米对比剂；
将氧化锰纳米对比剂保存在4℃条件中。
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