CN113244226A - 伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及伞形花内酯的用途技术领域，尤其是涉及一种伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。本发明通过实验验证，伞形花内酯可显著提高UVB照射后的细胞活力；抑制UVB诱导的细胞凋亡和细胞炎性因子的分泌；降低UVB诱导的MMP‑1和MMP‑9的表达；抑制细胞凋亡、NF‑κB和MAPK信号通路的活化，证明了伞形花内酯是一种有效的抗皮肤光老化的物质。

Description

伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用
技术领域
本发明涉及伞形花内酯的用途技术领域，尤其是涉及一种伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。
背景技术
光老化约占皮肤老化的80％。光老化的一个主要原因是皮肤暴露于阳光下受到照射(波长290～320nm)。皮肤照射紫外线后可能是通过改变皮肤细胞的成分或导致细胞外基质(ECM)丢失，从而造成皮肤损伤。紫外线依据波长被分为UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)、UVC(200～280nm)。由于大多数UVC可以被臭氧层吸收而不会到达地球，因此UVA和UVB是损害皮肤(皮肤是紫外线照射的主要器官)的两大主要紫外线辐射。特别是UVB具有更强的遗传毒性，比UVA具有高约1000倍的晒伤能力。皮肤长期暴露于UVB会导致红斑、晒伤、氧化损伤、凋亡和炎症，有时甚至会导致皮肤癌。
UVB辐射可导致皮肤细胞中过量产生活性氧(ROS)。过量的ROS产生诱导白介素(IL)-6的表达，IL-6通过级联反应能促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。此外，UVB诱导还增加了环氧合酶2(COX-2)的表达水平。先前的体内研究还发现，紫外线辐射产生的ROS导致人类皮肤中至少四种MMP的表达增加，即MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。其中，MMP-1是降解胶原蛋白的主要蛋白酶，MMP-9是降解明胶的主要蛋白酶。因此，评估MMP-1和MMP-9表达已成为抗光老化剂的初步筛选过程。
UVB辐射诱导产生的ROS被认为是激活NF-κB和MAPK信号通路的起点。MAPK是丝氨酸和酪氨酸激酶家族，包含细胞外信号调节激酶(ERK)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和P38促分裂素原活化蛋白激酶(P38MAPK)，参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症。通过转录和转录后机制调节P38MAPK途径，以影响细胞死亡信号传导以及促凋亡(Bax)和抗凋亡B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)。随后，胱天蛋白酶信号转导途径(Caspase3)被改变，导致细胞凋亡。因此，靶向MAPK调控的信号通路可能在UVB诱导的细胞凋亡中具有潜在价值。人皮肤中的转录因子NF-κB是由P50/P65亚基组成的异二聚体，MMP-1和MMP-9基因的启动子具有NF-κB结合位点，表明它们受此信号传导途径调控。
伞形花内酯存在于伞形科植物胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa DC)的根、豆科植物多变小冠花(Coronilla varia L.)的种子、芸香科植物芸香(Ruta graveolensL.)全草中，具有抗菌、平滑肌松弛、抗凝血和光敏等多种功效，虽然伞形花内酯的某些生物学功能已被报道，但抗皮肤光老化等作用尚未见报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。
本发明的第二目的在于提供一种抗皮肤光老化的组合物。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。
本发明通过实验验证，结果表明：伞形花内酯可显著提高UVB照射后的细胞活力；抑制UVB诱导的细胞凋亡和细胞炎性因子的分泌；降低UVB诱导的MMP-1和MMP-9的表达；抑制细胞凋亡、NF-κB和MAPK信号通路的活化，证明了伞形花内酯是一种有效的抗皮肤光老化的物质。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物包括护肤品和药物中的至少一种。
本发明还提供了抗皮肤光老化的组合物，所述组合物中含有伞形花内酯。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物中，所述伞形花内酯的质量分数为0.1％～1％，优选为0.2％～0.8％，更优选为0.4％～0.6％。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物中还包括辅料。
在实际操作中，通过采用不同的辅料配合，将组合物制成相应的剂型后使用。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物包括水剂、凝胶剂、乳剂、膏剂、洗剂、搽剂和贴剂中的任一种。
本发明还提供了上述抗皮肤光老化的组合物的制备方法，包括如下步骤：将各组分按比例混合均匀。
在本发明的具体实施方式中，将辅料和水混合均匀后，于35～40℃条件下与伞形花内酯混合均匀，降温出料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过实验验证，结果表明：伞形花内酯可显著提高UVB照射后的细胞活力；抑制UVB诱导的细胞凋亡和细胞炎性因子的分泌；降低UVB诱导的MMP-1和MMP-9的表达；抑制细胞凋亡、NF-κB和MAPK信号通路的活化，可有效抗皮肤光老化；
(2)本发明提供了含伞形花内酯的多种组合物，性状稳定，可用于皮肤表面，可提高皮肤含水量、增强皮肤弹性等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的伞形花内酯对经过UVB照射后的细胞的活力测定结果；
图2为本发明实施例提供的伞形花内酯对经过UVB照射后的细胞的凋亡率测定结果；
图3为本发明实施例提供的IL-6的标准曲线；
图4为本发明实施例提供的伞形花内酯对经过UVB照射后的细胞的IL-6含量的测定结果；
图5为本发明实施例提供的实时荧光定量(RT-PCR)检测的伞形花内酯对经过UVB照射后的细胞中的MMP-1(A)和MMP-9(B)的mRNA表达的影响结果；
图6为本发明实施例提供的蛋白质免疫印迹检测的伞形花内酯对经过UVB照射后的细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase3、NF-κB、p-NF-κB、JNK、P38MAPK、ERK1/2、p-JNK、p-P38MAPK、p-ERK1/2等蛋白的影响结果。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。
本发明通过实验验证，结果表明：伞形花内酯可显著提高UVB照射后的细胞活力；抑制UVB诱导的细胞凋亡和细胞炎性因子的分泌；降低UVB诱导的MMP-1和MMP-9的表达；抑制细胞凋亡、NF-κB和MAPK信号通路的活化，证明了伞形花内酯是一种有效的抗皮肤光老化的物质。
伞形花内酯可抑制UVB诱导的细胞凋亡；伞形花内酯可抑制UVB诱导的细胞炎性因子的分泌；伞形花内酯可抑制UVB诱导的MMP-1和MMP-9的表达；伞形花内酯可抑制细胞凋亡、NF-κB和MAPK信号通路的活化。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物包括护肤品和药物中的至少一种。
本发明的组合物可作为药物使用于皮肤表面，以治疗或预防光老化，也可作为护肤品使用于皮肤表面，在日常情况下兼顾护肤和抗光老化。
本发明还提供了抗皮肤光老化的组合物，所述组合物中含有伞形花内酯。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物中，所述伞形花内酯的质量分数为0.1％～1％，优选为0.2％～0.8％，更优选为0.4％～0.6％。
如在不同实施方式中，所述组合物中，伞形花内酯的质量分数可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等等。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物中还包括护肤品领域可接受的辅料或药学上可接受的辅料。如保湿剂、乳化剂、溶剂、助溶剂等等。
在实际操作中，通过采用不同的辅料配合，将组合物制成相应的剂型后使用。
在本发明的具体实施方式中，所述组合物包括水剂、凝胶剂、乳剂、膏剂、洗剂、搽剂和贴剂中的任一种。所述组合物的剂型不限于此，其余的可均匀用于皮肤表面的剂型也可。
本发明提供了几种含有伞形花内酯的组合物的不同剂型的原料组分及配比，具体如下：
在本发明的具体实施方式中，所述水剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油4.5％～5.5％、丙二醇4.5％～5.5％、透明质酸钠0.01％～0.06％、尿囊素0.08％～0.12％、海藻糖0.8％～1.2％、卡波姆0.008％～0.012％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、5％氢氧化钠水溶液0.08％～0.12％、苯氧乙醇0.18％～0.22％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
进一步的，所述水剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油5％、丙二醇5％、透明质酸钠0.05％、尿囊素0.1％、海藻糖1％、卡波姆0.01％、羟苯甲酯0.1％、5％氢氧化钠水溶液0.1％、苯氧乙醇0.2％、伞形花内酯0.5％和87.94％。
在本发明的具体实施方式中，所述凝胶剂中包括按质量百分比计的如下组分：卡波姆0.45％～0.55％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、甘油7.5％～8.5％、丙二醇4.5％～5.5％、丁二醇4.5％～5.5％、透明质酸钠0.01％～0.05％、5％氢氧化钠水溶液2.2％～2.5％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
进一步的，所述凝胶剂中包括按质量百分比计的如下组分：卡波姆0.53％、羟苯甲酯0.1％、甘油8％、丙二醇5％、丁二醇5％、透明质酸钠0.02％、5％氢氧化钠水溶液2.4％、苯氧乙醇0.5％、伞形花内酯0.5％和水77.95。
在本发明的具体实施方式中，所述乳剂中包括按质量百分比计的如下组分：C14-22醇1.2％～1.8％、聚二甲基硅氧烷0.8％～1.2％、异壬酸异壬酯0.8％～1.2％、棕榈酸乙基己酯3.5％～4.5％、羟苯丙酯0.08％～0.12％、甘油5.5％～6.5％、丙二醇3.5％～4.5％、卡波姆0.04％～0.08％、尿囊素0.08％～0.12％、生物糖胶-1 0.8％～1.2％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、Sepigel 305 0.5％～0.7％、5％氢氧化钠水溶液0.2％～0.3％、烟酰胺0.8％～1.2％、甜菜碱0.8％～1.2％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
进一步的，所述乳剂中包括按质量百分比计的如下组分：C14-22醇1.5％、聚二甲基硅氧烷1％、异壬酸异壬酯1％、棕榈酸乙基己酯4％、羟苯丙酯0.1％、甘油6％、丙二醇4％、卡波姆0.06％、尿囊素0.1％、生物糖胶-1 1％、羟苯甲酯0.1％、Sepigel 305 0.6％、5％氢氧化钠水溶液0.25％、烟酰胺1％、甜菜碱1％、苯氧乙醇0.5％、伞形花内酯0.5％和水77.29％。
在本发明的具体实施方式中，所述膏剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油硬脂酸酯1.5％～2.5％、硬脂醇3％～4％、聚二甲基硅氧烷1.5％～2.5％、辛酸/癸酸甘油三酯2.5％～3.5％、异壬酸异壬酯1.5％～2.5％、鲸蜡硬脂醇1.5％～2.5％、羟苯丙酯0.08％～0.12％、透明质酸钠0.01％～0.03％、甘油4.5％～5.5％、丁二醇4.5％～5.5％、卡波姆0.18％～0.22％、尿囊素0.08％～0.12％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、5％氢氧化钠水溶液0.8％～1％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
进一步的，所述膏剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油硬脂酸酯2％、硬脂醇3.5％、聚二甲基硅氧烷2％、辛酸/癸酸甘油三酯3％、异壬酸异壬酯2％、鲸蜡硬脂醇2％、羟苯丙酯0.1％、透明质酸钠0.02％、甘油5％、丁二醇5％、卡波姆0.2％、尿囊素0.1％、羟苯甲酯0.1％、5％氢氧化钠水溶液0.91％、苯氧乙醇0.5％、伞形花内酯0.5％和水73.07％。
本发明还提供了上述抗皮肤光老化的组合物的制备方法，包括如下步骤：各组分按比例混合均匀。
在本发明的具体实施方式中，将辅料和水混合均匀后，于35～40℃条件下与伞形花内酯混合均匀，降温出料。
在相对较低的温度下将其余物料与伞形花内酯混合，避免高温对活性成分伞形花内酯的稳定性造成影响，保证组合物的有效性。
为了进一步提高各剂型的分散均匀性以及性状稳定性，本发明提供了不同剂型的制备方法，具体如下：
在本发明的具体实施方式中，水剂的制备方法包括如下步骤：甘油、丙二醇、透明质酸钠、尿囊素、海藻糖、卡波姆、羟苯甲酯和水于20～30r/min搅拌速率下加热至80～85℃；于1800～2200r/min均质处理2～3min，加入5％氢氧化钠水溶液，保温处理20～25min；然后降温至45～50℃，加入苯氧乙醇，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，然后降温至35～45℃，加入伞形花内酯，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，降温至35℃以下出料。
在本发明的具体实施方式中，凝胶剂的制备方法包括如下步骤：卡波姆、羟苯甲酯、甘油、丙二醇、2/5～3/5量的丁二醇、透明质酸钠和水于20～30r/min搅拌速率下加热至80～85℃；于1800～2200r/min均质处理2～3min，加入5％氢氧化钠水溶液，保温处理20～25min；然后降温至45～50℃，加入苯氧乙醇和余量丁二醇，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，然后降温至35～45℃，加入伞形花内酯，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，降温至35℃以下出料。
在本发明的具体实施方式中，乳剂的制备方法包括如下步骤：甘油、丙二醇、卡波姆、尿囊素、生物糖胶-1、羟苯甲酯和水于20～30r/min搅拌速率下加热至80～85℃，加入预热至80～85℃的C14-22醇、聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯、棕榈酸乙基己酯和羟苯丙酯的混合物，于2400～2600r/min均质处理3～5min，然后加入Sepigel 305，以2400～2600r/min均质处理2～3min，加入5％氢氧化钠水溶液，于20～30r/min搅拌速率下保温处理20～25min；降温至48～50℃，加入预先溶解于水中的烟酰胺和甜菜碱，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，然后降温至43～45℃，加入苯氧乙醇，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，再降温至35～40℃，加入伞形花内酯，以20～30r/min搅拌速率搅拌8～10min，降温至35℃以下出料。
在本发明的具体实施方式中，膏剂的制备方法包括如下步骤：透明质酸钠、甘油、丁二醇、卡波姆、尿囊素、羟苯甲酯和水于20～30r/min搅拌速率下加热至80～85℃，加入预热至80～85℃的甘油硬脂酸酯、硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、辛酸/癸酸甘油三酯、异壬酸异壬酯、鲸蜡硬脂醇和羟苯丙酯的混合物，于2400～2600r/min均质处理5～6min，然后加入5％氢氧化钠水溶液，于20～30r/min搅拌速率下保温处理20～25min；降温至45～50℃，加入苯氧乙醇，以15～25r/min搅拌速率搅拌8～10min，再降温至35～40℃，加入伞形花内酯，以15～25r/min搅拌速率搅拌8～10min，降温至35℃以下出料。
本发明下述实施例中所采用的伞形花内酯均为市售伞形花内酯，其CAS号为93-35-6。
实施例1
伞形花内酯(Umbelliferone)的抗光老化作用
(1)人永生化角质形成细胞(HaCaT)细胞的培养
实验方法：按照HaCaT细胞(货号：CL-0090，公司：武汉普诺赛生命科技有限公司)说明书进行细胞复苏，配制DMEM完全培养基：含89％DMEM培养基(Gibco)、10％胎牛血清(FBS)(Gibco)和1％青链霉素混合液(Gibco)，将细胞转移至DMEM完全培养基中，于湿度为95％、含5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)UVB照射
实验方法：当HaCaT细胞长至60％～70％丰度时(为培养适宜时间，下同)予以UVB照射。
将细胞从培养箱取出，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。
每孔加入等量的薄层PBS，然后用50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射后立即弃去PBS，加入DMEM完全培养基，置培养箱中培养。
(3)细胞活力测定
MTT溶液的配制：精密称定75mg MTT粉(货号：715F051，公司：北京索莱宝科技有限公司)，用PBS定容至15mL，即得5mg/mL的MTT溶液。
实验方法：为了检测伞形花内酯是否能够抑制UVB诱导的细胞毒性，本实施例用MTT法测定细胞活力。实验分设三组：
对照组(C)、UV组(U)和治疗组(T)，每组各设6个复孔。取生长状态良好的HaCaT细胞制成密度为104个/mL单细胞悬液，以各孔接种体积为100μL接种于96孔板。培养适宜时间后，T组加入2μM的伞形花内酯，与HaCaT细胞共同培养2h，随后弃去培养基，用PBS清洗2次，U组和T组给予50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射结束后，三组都给予DMEM完全培养基，继续培养24h。培养结束后弃去培养基，用PBS进行清洗，之后向各孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h。终止培养后，弃去溶液，直接向各孔加入100μL DMSO。在酶标仪中摇1min于490nm处测定各孔的吸光度OD值，以此来计算各组细胞相对活性。
结果：如图1所示，C为对照组的实验结果，U为UV组的实验结果，T为治疗组的实验结果，其中设定对照组的吸光度OD值表示100％的细胞活性，U组的吸光度OD值与C组的OD值吸光度比值和T组的吸光度OD值与U组的OD值吸光度比值来表示U组和T组的细胞相对活性。与C组相比，U组的细胞活力显著下降，表明UVB照射对细胞产生了毒性，而用伞形花内酯处理的细胞其活力与U组相比提高了10.24％，这提示伞形花内酯可以抑制UVB诱导的细胞毒性。***表示U组和C组相比，具有统计学意义(P<0.001)，##表示T组和U组相比，具有统计学意义(P<0.01)。
(4)细胞流式术
实验方法：实验分设三组：对照组(C)、UV组(U)和治疗组(T)，每组各设3个复孔。HaCaT细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到12孔板中，每孔2mL。培养适宜时间后T组加入2μM的伞形花内酯和HaCaT细胞共同培养2h，随后弃去培养基，用PBS清洗2次，U组和T组给予50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射结束后，三组都给予DMEM完全培养基，继续培养24h。
在上述处理之后，按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号：HY0821，公司：UE)说明书操作，使用EXFLOW流式细胞仪测定各组HaCaT细胞的细胞凋亡率。
结果：如图2所示，C为对照组的实验结果，U为UV组的实验结果，T为治疗组的实验结果。C组细胞凋亡率为6.27％，说明在正常情况下，细胞便存在一定量的凋亡。与C组相比，U组的细胞凋亡率显著升高，高可达65.60％，再次表明UVB照射对细胞产生了毒性，而用伞形花内酯处理的细胞其凋亡率与U组相比降低了20.26％，这再次提示伞形花内酯可以抑制UVB诱导的细胞毒性。***表示U组和C组相比，具有统计学意义(P<0.001)，#表示T组和U组相比，具有统计学意义(P<0.05)。
(5)IL-6含量测定
实验方法：实验分设三组：对照组(C)、UV组(U)和治疗组(T)，每组各设3个复孔。HaCaT细胞以每孔4×105个细胞的密度接种到60mm细胞培养皿中，接种体积每个细胞培养皿为3mL。培养适宜时间后T组加入2μM的伞形花内酯，和HaCaT细胞共同培养2h，随后弃去培养基，用PBS清洗2次，U组和T组给予50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射结束后，三组都给予DMEM完全培养基，继续培养24h。
在上述处理之后，收集HaCaT细胞的上清液，并以3000rpm离心10min，取上清，之后按照ELISA试剂盒(货号：202006，公司：上海岚派生物科技有限公司)说明书步骤测量IL-6的浓度，在450nm波长下检测各组吸光度OD值。根据标准曲线来计算IL-6的含量。
结果：绘制IL-6标准曲线如图3，标曲拟合公式为Y＝0.0283X+0.0387。拟合优度R2值为0.9996，接近1，表明回归直线对观测值的拟合程度较高。
将实验各组的吸光度OD值带入标准曲线中求得各组IL-6的浓度含量，结果见图4。图4中，C为对照组的实验结果，U为UV组的实验结果，T为治疗组的实验结果。与C组相比，U组的IL-6浓度含量显著升高，UVB照射HaCaT细胞后将IL-6的浓度含量显著提高了1.2倍，表明UVB照射促进了细胞炎性因子的分泌，而用伞形花内酯处理细胞后IL-6的浓度含量与U组相比被降低了1倍，这提示伞形花内酯可以抑制UVB诱导的炎性因子的分泌。**表示U组和C组相比，具有统计学意义(P<0.01)，##表示T组和U组相比，具有统计学意义(P<0.01)。
(6)实时荧光定量(RT-PCR)
实验方法：实验分设三组：对照组(C)、UV组(U)和治疗组(T)，每组各设3个复孔。将HaCaT细胞(4×105细胞/孔)接种在6孔板中。培养适宜时间后T组加入2μM的伞形花内酯和HaCaT细胞共同培养2h，随后弃去培养基，用PBS清洗2次，U组和T组给予50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射结束后，三组都给予DMEM完全培养基，继续培养24h。
在上述处理之后，将6孔板置于冰上，每孔加入1mL Triol(货号：15596018，公司：Thermo)，常规提取实验各组的RNA。经过质量检查和纯化后，使用逆转录试剂盒(货号：11141ES60，公司：上海翊圣生物科技有限公司)将2μg RNA反转录为cDNA。具体步骤如下：
①去除残留基因组DNA
在RNase free离心管中配制下列混合液，并用移液枪混合均匀，42℃孵育2min。
表1去除残留基因组DNA混合液各组分用量
Figure BDA0003111056920000121
Figure BDA0003111056920000131
②逆转录
反应体系见表2，反应程序见表3。
表2逆转录反应体系配制
Figure BDA0003111056920000132
表3逆转录反应程序设置
温度(℃) 时间(min)
25 5
55 15
85 5
获得cDNA模板后，根据PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒(货号：#N21109，公司：TRNA)说明书进行操作，按照表4加入各个物质，选用SYBR Green Master Mix在Bio-Rad IQ5检测系统中进行RT-PCR。将GAPDH作为内参，同时为每个样品设置三个孔。使用2-△△Ct法计算相对基因表达量。实验中所用引物序列详见表5。
表4扩增体系
Figure BDA0003111056920000133
Figure BDA0003111056920000141
表5实验所用引物序列一览表
Figure BDA0003111056920000142
结果：如图5所示，图5中的A是MMP-1的检测结果，图5中的B是MMP-9的检测结果，其中，C为对照组的实验结果，U为UV组的实验结果，T为治疗组的实验结果。T-PCR结果显示，U组HaCaT细胞内的MMP-1和MMP-9的mRNA水平分别是C组的2.7倍和3.5倍，与C组比较差异均具有统计学意义(P<0.05和P<0.01)，提示UVB照射可以诱导HaCaT细胞表达MMP-1和MMP-9mRNA。与U组相比，用伞形花内酯处理细胞后细胞的MMP-1和MMP-9的mRNA水平均下降，T组HaCaT细胞内的MMP-1和MMP-9的mRNA水平分别是U组的0.39倍和0.48倍，提示伞形花内酯处理细胞后可以抑制UVB诱导的MMP-1和MMP-9mRNA的表达。*和**表示U组和C组相比，具有统计学意义(P<0.05和P<0.01)，#表示T组和U组相比，具有统计学意义(P<0.05)。
(7)蛋白质免疫印迹(Western-Blot)
实验方法：实验分设三组：对照组(C)、UV组(U)和治疗组(T)。HaCaT细胞以每孔4×105个细胞的密度接种到60mm细胞培养皿中，接种体积每个细胞培养皿为3mL。培养适宜时间后T组加入2μM的伞形花内酯和HaCaT细胞共同培养2h，随后弃去培养基，用PBS清洗2次，U组和T组给予50mJ/cm2剂量的UVB照射。照射结束后，三组都给予DMEM完全培养基，继续培养24h。
上述处理后，将细胞用PBS洗涤3次，并收集在RIPA缓冲液中30min。通过使用BCA蛋白质检测试剂盒(货号：50150，公司：康为世纪生物科技有限公司)确定蛋白质浓度。蛋白质样品经过SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将印迹与以下一抗(详细信息见表6)在4℃过夜孵育：GADPH(1﹕5000)，Bax(1﹕1000)，Bcl-2(1﹕1000)，Caspase3(1﹕1000)，p-NF-kB(1﹕1000)，NF-kB(1﹕1000)，p-P38MAPK(1﹕1000)，P38MAPK(1﹕1000)，p-JNK(1﹕1000)，JNK(1﹕1000)，p-ERK1/2(1﹕1000)，ERK1/2(1﹕1000)。孵育二抗(1﹕3000)(详细信息见表6)后使用化学发光分析仪将膜可视化。通过Quantity One软件分析蛋白质条带的相对密度。通过使用GADPH将光密度值标准化。
表6实验所用抗体一览表
Figure BDA0003111056920000151
Figure BDA0003111056920000161
结果：如图6所示，图6中的A和图6中的B是凋亡途径相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase3)的检测结果，图6中的C和图6中的D是NF-κB和p-NF-κB蛋白的检测结果，图6中的E～H是MAPK通路上的蛋白的检测结果。其中，图6中，A、C、E、G为凝胶图像，B、D、F、H为定量分析柱图。
实验分组中，C为对照组的实验结果，U为UV组的实验结果，T为治疗组的实验结果。
Western-Blot结果显示：
(i)图6中的A和图6中的B表明，与C组相比，U组中Bcl-2的表达显著降低；与U组相比，T组Bcl-2的表达明显增加。
Bax和Caspase3的表达变化趋势相反。这表明伞形花内酯可有效抵抗UVB诱导的细胞凋亡。
(ii)图6中的C和图6中的D表明，与C组相比，U组中p-NF-κB的表达显著升高；与U组相比，T组中p-NF-κB的表达明显下降。这表明伞形花内酯显著降低了UVB诱导的NF-κB磷酸化的增加。
(iii)图6中的E和图6中的F表明，HaCaT细胞中JNK、P38MAPK、ERK1/2蛋白含量无显著性变化。图6中的G和图6中的H表明，与C组相比，U组中p-JNK、p-P38MAPK、p-ERK1/2的表达显著升高；与U组相比，T组中p-JNK、p-P38MAPK、p-ERK1/2的表达明显下降。伞形花内酯显著降低了由UVB诱导的JNK、P38MAPK和ERK1/2磷酸化的增加。*、**和***表示U组和C组相比，具有统计学意义(P<0.05、P<0.01和P<0.001)，#和##表示T组和U组相比，具有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。
本实施例中，上述(3)至(7)的验证实验都重复至少3次，使用IBM SPSSStatistics 19数据软件对实验所得数据进行统计学分析：单因素方差分析(ANOVA)进行方法同质性检验，用LSD(L)和Dunnett’s T3(3)法对数据进行组间两两比较。使用GraphPadPrism 5进行作图。
本实施例的上述(3)至(7)的实验结果表明，伞形花内酯可以抑制UVB诱导的细胞毒性、细胞凋亡和细胞炎性因子的分泌，说明伞形花内酯具有抗光老化的作用，其机制与抑制细胞凋亡、NF-κB和MAPK信号通路的活化而减少MMP-1和MMP-9的表达有关。因此，伞形花内酯是一种有效的抗皮肤光老化化合物。
实施例2
本实施例提供了一种含伞形花内酯的水剂及其制备方法，所述水剂的处方剂量见表7。
表7含伞形花内酯的水剂的各组分用量
Figure BDA0003111056920000171
所述含伞形花内酯的水剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配比称取A相各组分，于25r/min搅拌速率搅拌并加热至85℃，在2000r/min均质3min，加入B相组分，以25r/min搅拌并保温20min；
(2)将步骤(1)得到的物料降温至50℃，加入C相，以25r/min搅拌速率搅拌10min，再降温至40℃，加入D相，以25r/min搅拌速率搅拌10min，降温至35℃以下出料。
实施例3
本实施例提供了一种含伞形花内酯的凝胶剂及其制备方法，所述凝胶剂的处方剂量见表8。
表8含伞形花内酯的凝胶剂的各组分用量
Figure BDA0003111056920000181
所述含伞形花内酯的凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配比称取A相各组分，于25r/min搅拌速率搅拌并加热至85℃，在2000r/min均质3min，加入B相组分，以25r/min搅拌并保温20min；
(2)将步骤(1)得到的物料降温至50℃，加入C相，以25r/min搅拌速率搅拌10min，再降温至40℃，加入D相，以25r/min搅拌速率搅拌10min，降温至35℃以下出料。
实施例4
本实施例提供了一种含伞形花内酯的乳剂及其制备方法，所述乳剂的处方剂量见表9。
表9含伞形花内酯的乳剂的各组分用量
Figure BDA0003111056920000191
所述含伞形花内酯的乳剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配比称取A相各组分，加热至85℃备用；按配比称取E相各组分，将E向各组分混匀溶解备用；
(2)按配比称取B相各组分，于25r/min搅拌速率搅拌并加热至85℃，搅拌均匀后加入步骤(1)预加热处理的A相，于2500r/min均质5min，然后加入C相，于2500r/min均质3min，然后加入D相，于25r/min搅拌速率下保温处理20min；
(3)将步骤(2)得到的物料降温至50℃，加入步骤(1)预溶解的E相，以25r/min搅拌速率搅拌10min；
(4)将步骤(3)得到的物料降温至45℃，加入F相，以25r/min搅拌速率搅拌10min；
(5)将步骤(4)得到的物料降温至40℃，加入G相，以25r/min搅拌速率搅拌10min；降温至35℃以下出料。
实施例5
本实施例提供了一种含伞形花内酯的膏剂及其制备方法，所述膏剂的处方剂量见表10。
表10含伞形花内酯的膏剂的各组分用量
Figure BDA0003111056920000201
Figure BDA0003111056920000211
所述含伞形花内酯的膏剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配比称取A相各组分，加热至85℃备用；
(2)按配比称取B相各组分，于25r/min搅拌速率搅拌并加热至85℃，搅拌均匀后加入步骤(1)预加热处理的A相，于2500r/min均质6min，然后加入C相，于25r/min搅拌速率下保温处理20min；
(3)将步骤(2)得到的物料降温至45℃，加入D相，以20r/min搅拌速率搅拌10min；
(4)将步骤(3)得到的物料降温至40℃，加入E相，以20r/min搅拌速率搅拌10min；降温至35℃以下出料。
实验例1
人体试验功效评价
仪器：MPA580皮肤测试仪，皮肤水分含量测试探头Corneometer CM825，经皮水分流失测试探头Tewameter TM300，皮肤弹性测试探头Cutomerter，均为德国CK公司。
测试环境：测试环境温度21℃±1℃；测试环境湿度50％±10％，并进行实时动态监测。
受试志愿者要求：年龄在35～55周岁之间的志愿者24名；无较严重的系统性疾病或自身免疫性疾病，手背没有接受过皮肤治疗、美容治疗；无活动性过敏，无体质高度敏感，使用测试产品无过敏现象；未同时参加其他临床测试。24名志愿者在正式测试前先在手背涂抹适量的待测试的剂型要(本发明实施例2～5制备)观察是否有过敏现象。24名志愿者均无过敏现象，签署《志愿者知情同意书》后正式开始测试。
试验分组：24名志愿者随机分为4组，每组6人。分组后的志愿者采用自身对照方法进行后续实验，每名志愿者的左手背设为实验组，右手背设为对照组。
使用方法：实验组按2mg/cm2的剂量在手背涂抹待测试的剂型(分别为本发明实施例2～5制备的水剂、凝胶剂、乳剂、膏剂)，每日早、中、晚各涂抹一次，使用周期为28天，对照组手背按相同的剂量、相同方法涂抹未添加伞形花内酯的相应水剂、凝胶剂、乳剂或膏剂。
测试过程及指标：每次测试前，志愿者统一用温水清洗手背，在符合规定的功效评价室内等待30min后进行数据采集，共进行三次数据采集，基础数据采集完成后每间隔一周的同一时间点进行回访测试，每次测试指标分别为皮肤水分含量、经皮水分流失量、皮肤弹性。
实验结果：
1、皮肤水分
在使用产品前，各组水分值略微不同，但无统计学差异；经过28天的使用，发现各组的自身对照组几乎没有变化；水剂组在第28天时与其自身对照组有显著性差异；凝胶剂组、乳剂组、膏剂组在第28天时与各自自身对照组有极显著差异。数值越大，说明皮肤含水量越高，实验结果证明本发明具有提高皮肤含水量的功效(表11)。
表11受试部位水分测试值(％)(*P<0.05，**P<0.01)
Figure BDA0003111056920000231
2、皮肤弹性
在使用产品前，各组弹性的值略微不同，但无统计学差异；经过28天的使用，发现各组的自身对照组几乎没有变化；水剂组在第28天时与其自身对照组有显著性差异；凝胶剂组、乳剂组、膏剂组在第28天时与各自自身对照组有极显著差异。数值越接近1，说明皮肤弹性越好，实验结果证明本发明具有增强皮肤弹性的功效(表12)。
表12受试部位弹性测试值(*P<0.05，**P<0.01)
Figure BDA0003111056920000232
Figure BDA0003111056920000241
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.伞形花内酯在制备抗皮肤光老化的组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物包括护肤品和药物中的任一种。
3.抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，包括伞形花内酯。
4.根据权利要求3所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述组合物中，所述伞形花内酯的质量分数为0.1％～1％；
优选的，所述伞形花内酯的质量分数为0.2％～0.8％；
更优选的，所述伞形花内酯的质量分数为0.4％～0.6％。
5.根据权利要求3所是述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，还包括护肤品领域可接受的辅料或药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求3所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述组合物包括水剂、凝胶剂、乳剂、膏剂、洗剂、搽剂和贴剂中的任一种。
7.根据权利要求6所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述水剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油4.5％～5.5％、丙二醇4.5％～5.5％、透明质酸钠0.01％～0.06％、尿囊素0.08％～0.12％、海藻糖0.8％～1.2％、卡波姆0.008％～0.012％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、5％氢氧化钠水溶液0.08％～0.12％、苯氧乙醇0.18％～0.22％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
8.根据权利要求6所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述凝胶剂中包括按质量百分比计的如下组分：卡波姆0.45％～0.55％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、甘油7.5％～8.5％、丙二醇4.5％～5.5％、丁二醇4.5％～5.5％、透明质酸钠0.01％～0.05％、5％氢氧化钠水溶液2.2％～2.5％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
9.根据权利要求6所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述乳剂中包括按质量百分比计的如下组分：C14-22醇1.2％～1.8％、聚二甲基硅氧烷0.8％～1.2％、异壬酸异壬酯0.8％～1.2％、棕榈酸乙基己酯3.5％～4.5％、羟苯丙酯0.08％～0.12％、甘油5.5％～6.5％、丙二醇3.5％～4.5％、卡波姆0.04％～0.08％、尿囊素0.08％～0.12％、生物糖胶-10.8％～1.2％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、Sepigel 305 0.5％～0.7％、5％氢氧化钠水溶液0.2％～0.3％、烟酰胺0.8％～1.2％、甜菜碱0.8％～1.2％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
10.根据权利要求6所述的抗皮肤光老化的组合物，其特征在于，所述膏剂中包括按质量百分比计的如下组分：甘油硬脂酸酯1.5％～2.5％、硬脂醇3％～4％、聚二甲基硅氧烷1.5％～2.5％、辛酸/癸酸甘油三酯2.5％～3.5％、异壬酸异壬酯1.5％～2.5％、鲸蜡硬脂醇1.5％～2.5％、羟苯丙酯0.08％～0.12％、透明质酸钠0.01％～0.03％、甘油4.5％～5.5％、丁二醇4.5％～5.5％、卡波姆0.18％～0.22％、尿囊素0.08％～0.12％、羟苯甲酯0.08％～0.12％、5％氢氧化钠水溶液0.8％～1％、苯氧乙醇0.4％～0.6％、伞形花内酯0.4％～0.6％和水。
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