CN113234169A

CN113234169A - 靶向cll1嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN113234169A
Application number: CN202011461194.7A
Authority: CN
Inventors: 李光超; 罗敏; 丁雯; 周兆; 王学俊
Original assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: EP4039712A1; AU2020480789A1; JP2023510465A; GB202207722D0; CN113234169B; WO2022120942A1; KR20220084040A; GB2606869A; US20220354890A1; EP4039712A4

Abstract

本发明提供了靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；所述抗原结合结构域为抗CLL1抗体。本发明采用抗CLL1抗体作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体分子，靶向CLL1嵌合抗原受体对CLL1阳性肿瘤细胞具有特异性靶向作用，表达靶向CLL1嵌合抗原受体的免疫细胞体内外杀伤作用显著，与CLL1阳性肿瘤细胞共培养后分泌大量的细胞因子IFN‑γ，对CLL1阳性肿瘤细胞具有特异性清除作用。

Description

靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

C型凝集素样分子1(CLL1)，又称C型凝集素域家族12成员A(CLEC12A)，是一种II型跨膜蛋白。研究表明，CLL1限制性地表达于造血细胞上，主要包括外周血和骨髓中髓系来源的细胞，比如单核细胞、树突状细胞、粒细胞以及大多数急性髓细胞白血病(AML)细胞。值得注意的是，虽然CLL1大量表达于外周血和骨髓中的髓细胞上，但是在外周组织中的髓系来源的细胞上不表达，比如组织巨噬细胞和组织树突状细胞均不表达CLL1。研究还发现，CLL1表达于AML干细胞(CD34+/CD38-)以及一小部分造血祖细胞(CD34+/CD38+或者CD34+/CD33+)上，但是在正常的造血干细胞(CD34+/CD38-或者CD34+/CD33-)上不表达。

由于这种特殊的表达模式，CLL1有望成为潜在的诊断和治疗AML的靶点。但目前鲜有靶向CLL1的免疫疗法报道。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用，所述靶向CLL1嵌合抗原受体采用对CLL1具有结合能力的抗CLL1抗体为抗原结合结构域，不仅可以结合纯化的或游离的CLL1蛋白，还可以结合细胞表面的CLL1蛋白，表达所述靶向CLL1嵌合抗原受体的免疫细胞在肿瘤治疗领域具有重要应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了靶向CLL1嵌合抗原受体，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗CLL1抗体。

本发明中，采用对CLL1具有结合能力的抗CLL1抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，使得嵌合抗原受体可以特异性结合CLL1阳性肿瘤细胞，实现对CLL1阳性肿瘤的特异性靶向作用。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2通过连接肽连接形成抗CLL1抗体19C1；

SEQ ID NO:1：

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIFPGSGSIKYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVHYCARGGTYNDYSLFDYWGQGTTLTVSS；

SEQ ID NO:2：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIFDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELK。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4通过连接肽连接形成抗CLL1抗体23D7；

SEQ ID NO:3：

QVQLQQPGSDLVRPGASVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGHGLEWIGYIYPGSGTSNYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTREARYTMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:4：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPGLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSFPPTFGAGTKLELK。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6通过连接肽连接形成抗CLL1抗体27H4；

SEQ ID NO:5：

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYHMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGAASHNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:6：

DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYTYPYTFGGGTKLEIK。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8～10之一所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8通过连接肽连接形成抗CLL1抗体H27H4L1，SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:9通过连接肽连接形成抗CLL1抗体H27H4L2，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10通过连接肽连接形成抗CLL1抗体H27H4L3；

SEQ ID NO:7：

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQRLEWMGRINPYNGAASHNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO:8：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIK；

SEQ ID NO:9：

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIK；

SEQ ID NO:10：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIK。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12通过连接肽连接形成抗CLL1抗体1075.7；

SEQ ID NO:11：

DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGRNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:12：

ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLEL。

优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区。

优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区和/或CD28跨膜区，优选为CD8α跨膜区。

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、DAP10或OX40中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽和/或IgGκ轻链信号肽。

作为优选技术方案，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括信号肽、抗CLL1抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体19C1-CAR包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:13：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIFDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIFPGSGSIKYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVHYCARGGTYNDYSLFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体23D7-CAR包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:14：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPGLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSFPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGSDLVRPGASVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGHGLEWIGYIYPGSGTSNYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTREARYTMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体27H4-CAR包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:15：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYTYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYHMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGAASHNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体H27H4-CAR包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:16：

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQRLEWMGRINPYNGAASHNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体1075.7-CAR包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:17：

MALPVTALLLPLALLLHAARPENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELGGGGSGGGGSGGGGSDIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGRNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

第二方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的靶向CLL1嵌合抗原受体的编码基因。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:18所示的核酸序列，为19C1-CAR的编码基因；

SEQ ID NO:18：

atggccctcccagtcacagctctgctgctcccactcgccctgctgctgcacgccgcacggcctcagatcgtcctcacccagtctccagccatcatgagcgcctctccaggcgagaaggtgacaatgacttgttccgcaagcagctcagttagttacatgtattggtaccagcagaaaccaggctcttctccaaggctcctgatcttcgacacttctaacctggcatccggagtcccagtgcggttcagcggcagcggcagtggaacatcttatagcctgactattagccggatggaggcagaagatgcagctacctactactgtcaacagtggtctagttatccactcacttttggtgcagggaccaagctggagctcaaaggtggaggaggatctggcggcggagggagtggaggaggcggctcacaggtccaactgcagcaatctggtgcagaactgatgaagcctggagcaagcgttaaaatctcttgcaaagcaacaggatacaccttttcttcctactggatagagtgggtgaaacaaagaccaggacacggactggaatggataggagagatctttcctggcagcggctcaatcaagtataacgagaagttcaaagggaaagccaccttcacagccgatacctcttctaatacagcctatatgcagctgtcatccctgaccagcgaagattctgctgttcactactgtgcacgcggaggaacatacaatgactactctctgtttgactattggggacagggcaccacactgactgtgagttctactacgacccctgcaccgcggccgcctactcctgcacctacaatcgcaagtcagccactgagtctcagacccgaagcatgccgccctgctgcaggcggagctgtccatacacgcggactggactttgcatgcgatatatacatctgggcaccactggccggcacttgcggcgtgctgctcctgtccctcgtgattaccctgtactgcaaacgcggcaggaagaagctcctgtatatctttaaacagcccttcatgaggccagtgcagaccactcaagaggaagacggttgtagctgccggtttcccgaggaagaagagggaggctgcgagctccgcgtgaagttctcccgctcagccgatgcacccgcctatcagcaagggcagaaccagctgtacaatgagctcaacctgggaagaagggaggaatatgacgttctggataaacggcgcggtcgcgatcccgaaatgggtgggaagcctcgcaggaagaatcctcaggaagggctctacaatgagctgcagaaagacaaaatggcagaggcctattctgaaatcggcatgaagggcgagcgccgcagaggcaaaggacacgacggcctgtaccagggcctgtctacagccaccaaggacacctatgacgctctccacatgcaagccctgccaccaaggtga。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:19所示的核酸序列，为23D7-CAR的编码基因；

SEQ ID NO:19：

atggctctccctgttactgcactcctgctcccactggcactgctgctgcatgccgctcggccacaaatagttctgactcagagtcctgccattatgtcagcctctcctggagagaaggtcacaatgacttgctctgcctctagtagtgtgtcttacatatactggtaccagcagaagcctggttcttctcccggactgctgatctatgacacatccaatctggcttcaggcgttcccgtcagattcagcgggtctggatctggcacaagctattctctgaccatctcaagaatggaggctgaagatgctgctacttattattgccaacagtggtcttcctttccaccaaccttcggtgcaggtaccaagctcgaactcaaaggtggaggaggaagcggaggaggcggtagtggtggaggtgggtcccaagttcagctgcaacagcccggatctgatctggttcggcccggagctagcgtgaaactgtcttgcaaggctagcggatacactttcacccgctattggatgcactgggttaagcagcggccaggacacggactggagtggattggctatatctacccaggcagcgggacaagtaactacgatgagaaattcaagagtaaggctactctgactgtcgatacaagttcctcaaccgcttacatgcagctctcttcactcaccagcgaagacagtgctgtttattactgcaccagggaagctcggtacaccatggattattggggtcaaggaacttctgtgacagtgtcaagcactacgacccctgcaccgcggccgcctactcctgcacctacaatcgcaagtcagccactgagtctcagacccgaagcatgccgccctgctgcaggcggagctgtccatacacgcggactggactttgcatgcgatatatacatctgggcaccactggccggcacttgcggcgtgctgctcctgtccctcgtgattaccctgtactgcaaacgcggcaggaagaagctcctgtatatctttaaacagcccttcatgaggccagtgcagaccactcaagaggaagacggttgtagctgccggtttcccgaggaagaagagggaggctgcgagctccgcgtgaagttctcccgctcagccgatgcacccgcctatcagcaagggcagaaccagctgtacaatgagctcaacctgggaagaagggaggaatatgacgttctggataaacggcgcggtcgcgatcccgaaatgggtgggaagcctcgcaggaagaatcctcaggaagggctctacaatgagctgcagaaagacaaaatggcagaggcctattctgaaatcggcatgaagggcgagcgccgcagaggcaaaggacacgacggcctgtaccagggcctgtctacagccaccaaggacacctatgacgctctccacatgcaagccctgccaccaaggtga。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:20所示的核酸序列，为27H4-CAR的编码基因；

SEQ ID NO:20：

atggctctgcctgttactgcactgctgctccctctggctctcctcctgcatgctgctcggcctgatatagtgatgtcccaaagcccatccagcctggccgtgtccgtcggcgaaaaggtgactatgagttgcaaatccagccaaagcctgctgtacagtgacaaccaaaagaactacctggcatggtaccagcagaagcctggacagtcaccaaagctcctcatctactgggctagcacaagggagagcggcgtcccagacaggtttactggcagcgggagtggcaccgatttcaccctgacaataagctctgtcaaggccgaagacctcgctgtgtactattgtcagcagtattatacctatccctatactttcggtggagggaccaaactcgagattaaaggaggtggcggctctggaggtggaggttccggcggtggcggtagtgaagtgcagctgcagcagagcgggcctgaactcgtgaaacctggtgcctccgttaaaatctcctgcaaggccagcggctactcattcacagggtatcacatgcattgggtgaagcagagccacgtcaaatcactggaatggatcggcaggattaatccatacaatggcgctgcttcacataaccagaagttcaaggacaaagccaccctgactgtcgataagtcatcaagtacagcatacatggagctgcattccctgactagcgaggacagcgctgtttactactgcgcacgcggctgggactacgacggtggctattacgccatggactactggggacaaggcaccagcgtcacagtttcaagtactacgacccctgcaccgcggccgcctactcctgcacctacaatcgcaagtcagccactgagtctcagacccgaagcatgccgccctgctgcaggcggagctgtccatacacgcggactggactttgcatgcgatatatacatctgggcaccactggccggcacttgcggcgtgctgctcctgtccctcgtgattaccctgtactgcaaacgcggcaggaagaagctcctgtatatctttaaacagcccttcatgaggccagtgcagaccactcaagaggaagacggttgtagctgccggtttcccgaggaagaagagggaggctgcgagctccgcgtgaagttctcccgctcagccgatgcacccgcctatcagcaagggcagaaccagctgtacaatgagctcaacctgggaagaagggaggaatatgacgttctggataaacggcgcggtcgcgatcccgaaatgggtgggaagcctcgcaggaagaatcctcaggaagggctctacaatgagctgcagaaagacaaaatggcagaggcctattctgaaatcggcatgaagggcgagcgccgcagaggcaaaggacacgacggcctgtaccagggcctgtctacagccaccaaggacacctatgacgctctccacatgcaagccctgccaccaaggtga。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:21所示的核酸序列，为H27H4-CAR的编码基因；

SEQ ID NO:21：

atggatatgagggttcctgcacaactcctgggactcctcctgctctggctgagaggcgcaagatgtgatatccagatgacccagtctcctagtagcctgtctgcctccgtcggcgatcgggtgaccattacttgcaaatcctcacagagcctcctctactccgataatcagaagaactacctcgcctggtatcaacagaaaccagggaaggcacctaagctgctgatctactgggctagtacccgcgaatccggcgtccctagcaggttctctggcagcgggagcgggacagatttcaccctcactatctcctccctgcagcctgaagacttcgcaacttactactgtcagcagtattatacttacccatacactttcggacagggaacaaaactggaaattaaaggtggaggtggatctggtggcggtggcagtggcggaggcgggtctgaagtccaactggtgcagagcggtgcagaggtgaagaagcctggagcatcagtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacacattcactggatatcatatgcattgggttaggcaggcacccggccagcggctggagtggatgggaagaatcaacccttataatggcgctgcctctcacaatcaaaagtttaaggatcgggtcactatcactcgggacacttccgcaagcaccgcctatatggagctgagcagcctgcggagtgaagacacagcagtctactactgtgctcgcggatgggactatgacggcggttattatgccatggattactggggacagggcacactggtcaccgtgagcagcactacgacccctgcaccgcggccgcctactcctgcacctacaatcgcaagtcagccactgagtctcagacccgaagcatgccgccctgctgcaggcggagctgtccatacacgcggactggactttgcatgcgatatatacatctgggcaccactggccggcacttgcggcgtgctgctcctgtccctcgtgattaccctgtactgcaaacgcggcaggaagaagctcctgtatatctttaaacagcccttcatgaggccagtgcagaccactcaagaggaagacggttgtagctgccggtttcccgaggaagaagagggaggctgcgagctccgcgtgaagttctcccgctcagccgatgcacccgcctatcagcaagggcagaaccagctgtacaatgagctcaacctgggaagaagggaggaatatgacgttctggataaacggcgcggtcgcgatcccgaaatgggtgggaagcctcgcaggaagaatcctcaggaagggctctacaatgagctgcagaaagacaaaatggcagaggcctattctgaaatcggcatgaagggcgagcgccgcagaggcaaaggacacgacggcctgtaccagggcctgtctacagccaccaaggacacctatgacgctctccacatgcaagccctgccaccaaggtga。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:22所示的核酸序列，为1075.7-CAR的编码基因；

SEQ ID NO:22：

atggctctgcctgttactgcactcctcctcccactggcactcctcctgcatgcagccaggcccgagaatgtgctgacacagtctccagccatcatgagcgcctctcccggtgaaaaggttactatgacctgtcgggcaagttcaaatgtgatctcctcttatgtgcactggtaccagcagcgctcaggtgcaagcccaaagctgtggatctattccacttctaacctggcctccggtgtcccagcccgcttttctggaagcgggtcaggcacctcatactccctcaccatatcaagtgtggaagctgaggatgcagctacttactactgccaacagtactctggttacccactgaccttcggagccgggacaaagctggaactgggaggaggcgggtccggcggtggagggtccggaggtggcgggtccgatatccagctgcaagagtcaggcccaggcctggtcaaaccttcccaaagcctgagtctcacctgttccgtgacaggttattccattactagcgcatattactggaactggataagacaattcccaggaaacaaactcgagtggatgggctacatctcatacgacgggcggaacaactataacccatccctgaagaatcggatttccatcactagagacacatccaagaaccagttctttctcaagctgaatagcgtgacaactgaggatacagcaacctactattgcgccaaggaaggagactatgatgttggcaactattatgcaatggactattggggacagggcacatcagtgaccgtgagcagcactacgacccctgcaccgcggccgcctactcctgcacctacaatcgcaagtcagccactgagtctcagacccgaagcatgccgccctgctgcaggcggagctgtccatacacgcggactggactttgcatgcgatatatacatctgggcaccactggccggcacttgcggcgtgctgctcctgtccctcgtgattaccctgtactgcaaacgcggcaggaagaagctcctgtatatctttaaacagcccttcatgaggccagtgcagaccactcaagaggaagacggttgtagctgccggtttcccgaggaagaagagggaggctgcgagctccgcgtgaagttctcccgctcagccgatgcacccgcctatcagcaagggcagaaccagctgtacaatgagctcaacctgggaagaagggaggaatatgacgttctggataaacggcgcggtcgcgatcccgaaatgggtgggaagcctcgcaggaagaatcctcaggaagggctctacaatgagctgcagaaagacaaaatggcagaggcctattctgaaatcggcatgaagggcgagcgccgcagaggcaaaggacacgacggcctgtaccagggcctgtctacagccaccaaggacacctatgacgctctccacatgcaagccctgccaccaaggtga。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的病毒载体或非病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

优选地，所述非病毒载体包括Piggybac转座子系统、Sleeping Beauty转座子系统或纳米载体中的任意一种。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第一方面所述的靶向CLL1嵌合抗原受体。

本发明中，表达靶向CLL1嵌合抗原受体的免疫细胞利用嵌合抗原受体的抗原结合结构域靶向CLL1阳性肿瘤细胞，发挥免疫细胞的杀伤功能分泌细胞因子IFN-γ，在不同效靶比下实现对CLL1肿瘤的杀伤作用。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种。

优选地，所述T细胞包括αβΤ细胞和/或γδΤ细胞。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的靶向CLL1嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第六方面所述的药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述恶性肿瘤包括急性髓系白血病。

第八方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第六方面所述的药物组合物，并同时、分开或依次施用一种或多种抗肿瘤药物。

优选地，所述癌症包括急性髓系白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用抗CLL1抗体作为抗原结合结构域构建CAR分子，表达靶向CLL1CAR的T细胞依赖于CAR元件在不同的效靶比下对CLL1阳性肿瘤细胞发挥杀伤作用，其中，H27H4-CAR-T具有最优的杀伤功能；

(2)本发明的靶向CLL1CAR-T细胞与CLL1阳性肿瘤细胞共培养后分泌大量的细胞因子IFN-γ，证明了CAR-T对CLL1肿瘤细胞的特异性杀伤功效。

附图说明

图1为不同肿瘤细胞对CLL1的表达情况；

图2为靶向CLL1的嵌合抗原受体的结构示意图；

图3A为含有H27H4CAR基因的慢病毒表达载体图谱，图3B为H27H4CAR在慢病毒表达载体中的位置；

图4为不同CAR-T细胞的CAR表达阳性率；

图5为靶向CLL1的CAR-T对Raji-CLL1细胞的杀伤率；

图6为靶向CLL1的CAR-T杀伤靶细胞的IFN-γ分泌情况。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1抗CLL1抗体的来源

本实施例选择抗CLL1抗体19C1、23D7、27H4、人源化27H4(H27H4)和1075.7(专利US8536310B2)作为抗原结合结构域用于构建CAR分子，其中，19C1包括SEQ ID NO:1～2所示的可变区、23D7包括SEQ ID NO:3～4所示的可变区、27H4包括SEQ ID NO:5～6所示的可变区、H27H4包括SEQ ID NO:7～8所示的可变区、1075.7包括SEQ ID NO:11～12所示的可变区。

实施例2肿瘤细胞对CLL1的表达

本实施例采用FITC anti-human CD371(CLL1)抗体(biolegend)与靶细胞Jurkat、KG-1a、共孵育后，流式检测靶细胞对CLL1的表达。

结果如图1所示，THP-1、U937和HL-60为CLL1阳性细胞，Jurkat和KG-1a为CLL1阴性细胞。

实施例3嵌合抗原受体的设计

本实施例设计靶向CLL1的嵌合抗原受体，结构示意图见图2，包括CD8α信号肽、与CLL1抗原特异性结合的单链抗体(Anti-CLL1scFv)、CD8α铰链区(Hinge)和跨膜区(Transmembrane)、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域，具体CAR分子为：

①19C1-CAR：CD8α信号肽、Anti-CLL1scFv(19C1)、CD8αHinge+TM、4-1BB和CD3ζ；

②23D7-CAR：CD8α信号肽、Anti-CLL1scFv(23D7)、CD8αHinge+TM、4-1BB和CD3ζ；

③27H4-CAR：CD8α信号肽、Anti-CLL1scFv(27H4)、CD8αHinge+TM、4-1BB和CD3ζ；

④H27H4-CAR：IgGκ轻链信号肽、Anti-CLL1scFv(H27H4)、CD8αHinge+TM、4-1BB和CD3ζ；

⑤1075.7-CAR：CD8α信号肽、Anti-CLL1scFv(1075.7)、CD8αHinge+TM、4-1BB和CD3ζ；

其中，CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，核酸序列如SEQ ID NO:24所示，IgGκ轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，核酸序列如SEQ ID NO:26所示，CD8αHinge的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，核酸序列如SEQ ID NO:28所示，CD8αTM的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，核酸序列如SEQ ID NO:30所示，4-1BB的氨基酸序列如SEQID NO:31所示，核酸序列如SEQ ID NO:32所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，核酸序列如SEQ ID NO:34所示；

SEQ ID NO:23：

MALPVTALLLPLALLLHAARP；

SEQ ID NO:24：

atggcactgccagtgacagccctgctgctgccactggccctgctgctgcacgcagcacgccct；

SEQ ID NO:25：

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC；

SEQ ID NO:26：

atggatatgagggttcctgcacaactcctgggactcctcctgctctggctgagaggcgcaagatgt；

SEQ ID NO:27：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；

SEQ ID NO:28：

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat；

SEQ ID NO:29：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

SEQ ID NO:30：

atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc；

SEQ ID NO:31：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

SEQ ID NO:32：

aagagaggcaggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcgccccgtgcagacaacccaggaggaggacggctgcagctgtcggttcccagaggaggaggagggaggatgtgagctg；

SEQ ID NO:33：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

SEQ ID NO:34：

agggtgaagttttctcggagcgccgatgcaccagcatatcagcagggacagaatcagctgtacaacgagctgaatctgggcaggcgcgaggagtacgacgtgctggataagcggagaggcagagatcccgagatgggaggcaagccaaggaggaagaaccctcaggagggcctgtataatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactctgagatcggcatgaagggagagcggagaaggggcaagggacacgatggcctgtatcagggcctgagcacagccaccaaggacacctacgatgcactgcacatgcaggccctgccacctagg。

实施例4靶向CLL1的嵌合抗原受体表达载体的构建

(1)根据实施例3设计的CAR分子，对CAR编码基因进行密码子优化、促进其在人源细胞中的高效表达，全基因合成CAR编码基因(广州艾基生物技术有限公司)；

(2)用EcoRI和BamHI双酶切全长CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS，于37℃水浴酶切30min后，使用1.5％琼脂糖凝胶进行DNA电泳，并使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(天根)对酶切产物进行纯化回收处理；

(3)配制表1所示的连接体系，对CAR基因片段和线性化pCDH-EF1-MCS进行22℃连接1h，将连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μL转化产物涂布氨苄抗性LB平板，于37℃培养箱倒置培养过夜，次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定；

表1

成分	添加量
		线性化pCDH-EF1-MCS载体	50ng
CAR基因	150ng
		T4DNA连接缓冲液	2μL
T4DNA连接酶(NEB)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	补齐至20μL

示例性地，构建的含有27H4CAR基因的慢病毒表达载体pBG-27H4如图3A和图3B所示。

实施例5慢病毒包装

本实施例采用四质粒系统对实施例4构建的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，具体步骤如下：

(1)将慢病毒表达载体、辅助质粒gag/pol、Rev、VSV-G构成的四质粒系统与PEI转染试剂混合后，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；

(2)将上述混合液加至铺有293T细胞的T75细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6h；

(3)6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mM丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。

实施例6 T细胞的获取与扩增

每位志愿者采集30mL全血，将外周血与生理盐水按1:1混合稀释；向离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液，缓缓加入稀释的外周血，1500rpm离心30min，轻轻吸取PBMC层移入另一离心管中；

用生理盐水多次洗涤PBMC，转入X-VIVO培养基(含50ng/mL OKT3，300IU/mL IL-2)中进行培养，PBMC分离后，用X-VIVO(含50ng/mL OKT3，300IU/mL IL-2)进行激活，2日后将培养基更换为含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；而后每两天进行一次计数，并更换新鲜的含300IU/mL的X-VIVO培养基，将细胞浓度维持在(0.5～1)×10⁶个/mL，连续观察10天。

实施例7 CAR-T细胞的制备

本实施例利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，步骤如下：

将30μg RetroNectin包被于6孔板内，置于37℃细胞培养箱保持2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，置于37℃细胞培养箱保持0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g离心2h，弃上清；加入1×10⁶个T细胞(CD3阳性>90％)，1000g离心10min，置于37℃、5％CO₂和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述步骤。

慢病毒的加入量见表2。

表2

采用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达，利用CLL1-Fc融合蛋白(Acrobiosystems公司)检测CAR表达，二抗采用FITC-Labeled anti-human Fc，未转染CAR的T细胞(T mock)作为阴性对照。

结果如图4和表3所示，19C1-CAR-T细胞的CAR表达阳性率为13.28％，23D7-CAR-T细胞的CAR表达阳性率为37.49％，27H4-CAR-T细胞的CAR表达阳性率为39.44％，H27H4-CAR-T细胞的CAR表达阳性率为33.59％，1075.7-CAR-T细胞的CAR表达阳性率为5.09％。

表3

T细胞类型

T mock

19C1

23D7

27H4

H27H4

1075.7

CAR表达阳性率

1.23％

13.28％

37.49％

39.44％

33.59％

5.09％

实施例8 CAR-T细胞的杀伤功能

本实施例采用xCELLigence实时无标记动态分析技术(Real Time CellAnalysis，RTCA)对细胞杀伤效应进行全程自动化检测。

实时无标记细胞分析仪(RTCA)基于微电子阻抗技术，在E-plate板底整合有大量微金电极，当贴壁细胞粘附到微金电极上，细胞数量、直径以及贴壁能力均会影响微金电极间的电流传导，从而引起阻抗值的改变，这一改变极为精细且灵敏，在毒负效应下，细胞直接或间接影响阻抗值。因此，xCELLigence可以监测由分子靶标引起的细胞毒性效应。

步骤如下：

(1)用一定体积的1×Tether Buffer稀释anti-CD40，向E-Plate View 96孔板的每孔中加入50μL稀释好的anti-CD40作为包被液，室温避光孵育3h，每组设置三个复孔；

(2)弃包被液，用200μL PBS轻轻洗孔2次，向每个孔中加入50μL含2％FBS的1640培养基，将E-Plate View 96孔板放入xCELLigence仪中(仪器预先1h放入培养箱中)，37℃平衡1h，测量背景值；

(3)采用稳定过表达CLL1的Raji细胞(Raji-CLL1)作为靶细胞，制备靶细胞悬液并测定细胞密度，向每个孔中加入50000个细胞/50μL，每个孔的终体积为100μL，室温静置孵育30min，将E-Plate View 96孔板重新放回仪器中，操作软件进行数据收集，每5min检测一次电阻抗，检测时间为2h；

(4)分别制备不同效靶比的效应细胞悬液(即CAR-T细胞)和阴性对照细胞悬液(即未转染的T细胞)，向每孔中加入50μL稀释好的效应细胞悬液或阴性对照细胞悬液，空白对照组加入50μL培养基，阳性对照组加入50μL 1×Cytolysis Solution，室温静置孵育30min，使效应细胞均匀分布在固定的靶细胞上；

(5)将E-Plate View 96孔板重新放入仪器中，操作软件进行数据收集，每5min检测一次电阻抗，检测时间为16h，实验结束后保存数据并分析。

结果如图5所示，19C1-CAR-T、23D7-CAR-T、27H4-CAR-T、H27H4-CAR-T或1075.7-CAR-T在不同的效靶比(1:1、2:1、4:1)下与Raji-CLL1共孵育16h后，均能有效杀伤Raji-CLL1细胞，效靶比越大杀伤能力越强。其中，H27H4-CAR-T具有最强的杀伤能力，27H4-CAR-T的杀伤能力与H27H4-CAR-T相似，23D7-CAR-T次之，19C1-CAR-T和1075.7-CAR-T的杀伤能力偏弱，未转染CAR的T mock不能杀伤Raji-CLL1，说明anti-CLL1CAR-T的杀伤活性依赖于CAR元件。

实施例9 CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养对IFN-γ的分泌

本实施例采用Human IFN-γELISA试剂盒(欣博盛)检测CAR-T细胞释放IFN-γ细胞因子的浓度，分析CAR-T与靶细胞共培养后对IFN-γ的分泌量，具体地，采用CLL1阳性细胞Raji-CLL1、HL60、U937作为阳性靶细胞，CLL1阴性细胞Raji作为阴性靶细胞。

将CAR-T细胞与不同的靶细胞按照效靶比为1:1共孵育16h，取上清用酶联免疫法(ELISA)检测培养液上清中IFN-γ的分泌量。检测原理采用双抗体夹心ELISA法，将抗人IFN-γ抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人IFN-γ与包被抗体结合，游离的成分被洗去；依次加入生物素化抗人IFN-γ抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，抗人IFN-γ抗体与结合在包被抗体上的人IFN-γ结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入显色底物(TMB)，在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加入终止液后变成黄色，用酶标仪在450nm波长处测OD值，IFN-γ浓度与OD450之间呈正比，通过绘制标准曲线计算样品中IFN-γ的浓度。

结果如图6所示，19C1-CAR-T、23D7-CAR-T、27H4-CAR-T、H27H4-CAR-T或1075.7-CAR-T与Raji-CLL1、HL60或U937共培养后释放大量IFN-γ，而与Raji细胞共培养后未见大量IFN-γ释放，说明靶向CLL1的CAR-T细胞的杀伤具有特异性。

综上所述，本发明的靶向CLL1CAR-T细胞在不同的效靶比下对CLL1阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，与肿瘤细胞共培养后分泌大量的细胞因子IFN-γ，在CLL1阳性肿瘤治疗领域具有应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用

<130> 20201208

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Tyr Asn Asp Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Phe

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Arg Glu Ala Arg Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Gly Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Phe Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

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<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

His Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Trp Asp Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

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Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

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Lys

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Trp Asp Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

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Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

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Lys

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

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Lys

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

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Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

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65 70 75 80

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Lys

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

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50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105

<210> 13

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

100 105 110

Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile

165 170 175

Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu

180 185 190

Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

195 200 205

Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Gly Gly Thr Tyr Asn Asp Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 14

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro

50 55 60

Gly Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

100 105 110

Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met

165 170 175

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

180 185 190

Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Ser

195 200 205

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

225 230 235 240

Glu Ala Arg Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

275 280 285

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

290 295 300

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

305 310 315 320

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

340 345 350

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

355 360 365

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

370 375 380

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

405 410 415

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg

<210> 15

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln

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Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr

65 70 75 80

Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr

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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

145 150 155 160

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Ser Phe Thr Gly Tyr His Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys

180 185 190

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser

195 200 205

His Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Trp Asp Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr

245 250 255

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr

260 265 270

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

275 280 285

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

305 310 315 320

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

325 330 335

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

340 345 350

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

355 360 365

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

370 375 380

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

385 390 395 400

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

405 410 415

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

420 425 430

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

435 440 445

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

450 455 460

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

465 470 475 480

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 16

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser

65 70 75 80

Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

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Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

145 150 155 160

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ala

195 200 205

Ser His Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr

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Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

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Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

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290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

305 310 315 320

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

325 330 335

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

340 345 350

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

355 360 365

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

370 375 380

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

385 390 395 400

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

405 410 415

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 17

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser

35 40 45

Asn Val Ile Ser Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala

50 55 60

Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala Tyr

165 170 175

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met

180 185 190

Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

195 200 205

Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

210 215 220

Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

305 310 315 320

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 18

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atggccctcc cagtcacagc tctgctgctc ccactcgccc tgctgctgca cgccgcacgg 60

cctcagatcg tcctcaccca gtctccagcc atcatgagcg cctctccagg cgagaaggtg 120

acaatgactt gttccgcaag cagctcagtt agttacatgt attggtacca gcagaaacca 180

ggctcttctc caaggctcct gatcttcgac acttctaacc tggcatccgg agtcccagtg 240

cggttcagcg gcagcggcag tggaacatct tatagcctga ctattagccg gatggaggca 300

gaagatgcag ctacctacta ctgtcaacag tggtctagtt atccactcac ttttggtgca 360

gggaccaagc tggagctcaa aggtggagga ggatctggcg gcggagggag tggaggaggc 420

ggctcacagg tccaactgca gcaatctggt gcagaactga tgaagcctgg agcaagcgtt 480

aaaatctctt gcaaagcaac aggatacacc ttttcttcct actggataga gtgggtgaaa 540

caaagaccag gacacggact ggaatggata ggagagatct ttcctggcag cggctcaatc 600

aagtataacg agaagttcaa agggaaagcc accttcacag ccgatacctc ttctaataca 660

gcctatatgc agctgtcatc cctgaccagc gaagattctg ctgttcacta ctgtgcacgc 720

ggaggaacat acaatgacta ctctctgttt gactattggg gacagggcac cacactgact 780

gtgagttcta ctacgacccc tgcaccgcgg ccgcctactc ctgcacctac aatcgcaagt 840

cagccactga gtctcagacc cgaagcatgc cgccctgctg caggcggagc tgtccataca 900

cgcggactgg actttgcatg cgatatatac atctgggcac cactggccgg cacttgcggc 960

gtgctgctcc tgtccctcgt gattaccctg tactgcaaac gcggcaggaa gaagctcctg 1020

tatatcttta aacagccctt catgaggcca gtgcagacca ctcaagagga agacggttgt 1080

agctgccggt ttcccgagga agaagaggga ggctgcgagc tccgcgtgaa gttctcccgc 1140

tcagccgatg cacccgccta tcagcaaggg cagaaccagc tgtacaatga gctcaacctg 1200

ggaagaaggg aggaatatga cgttctggat aaacggcgcg gtcgcgatcc cgaaatgggt 1260

gggaagcctc gcaggaagaa tcctcaggaa gggctctaca atgagctgca gaaagacaaa 1320

atggcagagg cctattctga aatcggcatg aagggcgagc gccgcagagg caaaggacac 1380

gacggcctgt accagggcct gtctacagcc accaaggaca cctatgacgc tctccacatg 1440

caagccctgc caccaaggtg a 1461

<210> 19

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggctctcc ctgttactgc actcctgctc ccactggcac tgctgctgca tgccgctcgg 60

ccacaaatag ttctgactca gagtcctgcc attatgtcag cctctcctgg agagaaggtc 120

acaatgactt gctctgcctc tagtagtgtg tcttacatat actggtacca gcagaagcct 180

ggttcttctc ccggactgct gatctatgac acatccaatc tggcttcagg cgttcccgtc 240

agattcagcg ggtctggatc tggcacaagc tattctctga ccatctcaag aatggaggct 300

gaagatgctg ctacttatta ttgccaacag tggtcttcct ttccaccaac cttcggtgca 360

ggtaccaagc tcgaactcaa aggtggagga ggaagcggag gaggcggtag tggtggaggt 420

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aaactgtctt gcaaggctag cggatacact ttcacccgct attggatgca ctgggttaag 540

cagcggccag gacacggact ggagtggatt ggctatatct acccaggcag cgggacaagt 600

aactacgatg agaaattcaa gagtaaggct actctgactg tcgatacaag ttcctcaacc 660

gcttacatgc agctctcttc actcaccagc gaagacagtg ctgtttatta ctgcaccagg 720

gaagctcggt acaccatgga ttattggggt caaggaactt ctgtgacagt gtcaagcact 780

acgacccctg caccgcggcc gcctactcct gcacctacaa tcgcaagtca gccactgagt 840

ctcagacccg aagcatgccg ccctgctgca ggcggagctg tccatacacg cggactggac 900

tttgcatgcg atatatacat ctgggcacca ctggccggca cttgcggcgt gctgctcctg 960

tccctcgtga ttaccctgta ctgcaaacgc ggcaggaaga agctcctgta tatctttaaa 1020

cagcccttca tgaggccagt gcagaccact caagaggaag acggttgtag ctgccggttt 1080

cccgaggaag aagagggagg ctgcgagctc cgcgtgaagt tctcccgctc agccgatgca 1140

cccgcctatc agcaagggca gaaccagctg tacaatgagc tcaacctggg aagaagggag 1200

gaatatgacg ttctggataa acggcgcggt cgcgatcccg aaatgggtgg gaagcctcgc 1260

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ccaaggtga 1449

<210> 20

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atggctctgc ctgttactgc actgctgctc cctctggctc tcctcctgca tgctgctcgg 60

cctgatatag tgatgtccca aagcccatcc agcctggccg tgtccgtcgg cgaaaaggtg 120

actatgagtt gcaaatccag ccaaagcctg ctgtacagtg acaaccaaaa gaactacctg 180

gcatggtacc agcagaagcc tggacagtca ccaaagctcc tcatctactg ggctagcaca 240

agggagagcg gcgtcccaga caggtttact ggcagcggga gtggcaccga tttcaccctg 300

acaataagct ctgtcaaggc cgaagacctc gctgtgtact attgtcagca gtattatacc 360

tatccctata ctttcggtgg agggaccaaa ctcgagatta aaggaggtgg cggctctgga 420

ggtggaggtt ccggcggtgg cggtagtgaa gtgcagctgc agcagagcgg gcctgaactc 480

gtgaaacctg gtgcctccgt taaaatctcc tgcaaggcca gcggctactc attcacaggg 540

tatcacatgc attgggtgaa gcagagccac gtcaaatcac tggaatggat cggcaggatt 600

aatccataca atggcgctgc ttcacataac cagaagttca aggacaaagc caccctgact 660

gtcgataagt catcaagtac agcatacatg gagctgcatt ccctgactag cgaggacagc 720

gctgtttact actgcgcacg cggctgggac tacgacggtg gctattacgc catggactac 780

tggggacaag gcaccagcgt cacagtttca agtactacga cccctgcacc gcggccgcct 840

actcctgcac ctacaatcgc aagtcagcca ctgagtctca gacccgaagc atgccgccct 900

gctgcaggcg gagctgtcca tacacgcgga ctggactttg catgcgatat atacatctgg 960

gcaccactgg ccggcacttg cggcgtgctg ctcctgtccc tcgtgattac cctgtactgc 1020

aaacgcggca ggaagaagct cctgtatatc tttaaacagc ccttcatgag gccagtgcag 1080

accactcaag aggaagacgg ttgtagctgc cggtttcccg aggaagaaga gggaggctgc 1140

gagctccgcg tgaagttctc ccgctcagcc gatgcacccg cctatcagca agggcagaac 1200

cagctgtaca atgagctcaa cctgggaaga agggaggaat atgacgttct ggataaacgg 1260

cgcggtcgcg atcccgaaat gggtgggaag cctcgcagga agaatcctca ggaagggctc 1320

tacaatgagc tgcagaaaga caaaatggca gaggcctatt ctgaaatcgg catgaagggc 1380

gagcgccgca gaggcaaagg acacgacggc ctgtaccagg gcctgtctac agccaccaag 1440

gacacctatg acgctctcca catgcaagcc ctgccaccaa ggtga 1485

<210> 21

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atggatatga gggttcctgc acaactcctg ggactcctcc tgctctggct gagaggcgca 60

agatgtgata tccagatgac ccagtctcct agtagcctgt ctgcctccgt cggcgatcgg 120

gtgaccatta cttgcaaatc ctcacagagc ctcctctact ccgataatca gaagaactac 180

ctcgcctggt atcaacagaa accagggaag gcacctaagc tgctgatcta ctgggctagt 240

acccgcgaat ccggcgtccc tagcaggttc tctggcagcg ggagcgggac agatttcacc 300

ctcactatct cctccctgca gcctgaagac ttcgcaactt actactgtca gcagtattat 360

acttacccat acactttcgg acagggaaca aaactggaaa ttaaaggtgg aggtggatct 420

ggtggcggtg gcagtggcgg aggcgggtct gaagtccaac tggtgcagag cggtgcagag 480

gtgaagaagc ctggagcatc agtgaaggtg tcttgcaaag ccagtggcta cacattcact 540

ggatatcata tgcattgggt taggcaggca cccggccagc ggctggagtg gatgggaaga 600

atcaaccctt ataatggcgc tgcctctcac aatcaaaagt ttaaggatcg ggtcactatc 660

actcgggaca cttccgcaag caccgcctat atggagctga gcagcctgcg gagtgaagac 720

acagcagtct actactgtgc tcgcggatgg gactatgacg gcggttatta tgccatggat 780

tactggggac agggcacact ggtcaccgtg agcagcacta cgacccctgc accgcggccg 840

cctactcctg cacctacaat cgcaagtcag ccactgagtc tcagacccga agcatgccgc 900

cctgctgcag gcggagctgt ccatacacgc ggactggact ttgcatgcga tatatacatc 960

tgggcaccac tggccggcac ttgcggcgtg ctgctcctgt ccctcgtgat taccctgtac 1020

tgcaaacgcg gcaggaagaa gctcctgtat atctttaaac agcccttcat gaggccagtg 1080

cagaccactc aagaggaaga cggttgtagc tgccggtttc ccgaggaaga agagggaggc 1140

tgcgagctcc gcgtgaagtt ctcccgctca gccgatgcac ccgcctatca gcaagggcag 1200

aaccagctgt acaatgagct caacctggga agaagggagg aatatgacgt tctggataaa 1260

cggcgcggtc gcgatcccga aatgggtggg aagcctcgca ggaagaatcc tcaggaaggg 1320

ctctacaatg agctgcagaa agacaaaatg gcagaggcct attctgaaat cggcatgaag 1380

ggcgagcgcc gcagaggcaa aggacacgac ggcctgtacc agggcctgtc tacagccacc 1440

aaggacacct atgacgctct ccacatgcaa gccctgccac caaggtga 1488

<210> 22

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atggctctgc ctgttactgc actcctcctc ccactggcac tcctcctgca tgcagccagg 60

cccgagaatg tgctgacaca gtctccagcc atcatgagcg cctctcccgg tgaaaaggtt 120

actatgacct gtcgggcaag ttcaaatgtg atctcctctt atgtgcactg gtaccagcag 180

cgctcaggtg caagcccaaa gctgtggatc tattccactt ctaacctggc ctccggtgtc 240

ccagcccgct tttctggaag cgggtcaggc acctcatact ccctcaccat atcaagtgtg 300

gaagctgagg atgcagctac ttactactgc caacagtact ctggttaccc actgaccttc 360

ggagccggga caaagctgga actgggagga ggcgggtccg gcggtggagg gtccggaggt 420

ggcgggtccg atatccagct gcaagagtca ggcccaggcc tggtcaaacc ttcccaaagc 480

ctgagtctca cctgttccgt gacaggttat tccattacta gcgcatatta ctggaactgg 540

ataagacaat tcccaggaaa caaactcgag tggatgggct acatctcata cgacgggcgg 600

aacaactata acccatccct gaagaatcgg atttccatca ctagagacac atccaagaac 660

cagttctttc tcaagctgaa tagcgtgaca actgaggata cagcaaccta ctattgcgcc 720

aaggaaggag actatgatgt tggcaactat tatgcaatgg actattgggg acagggcaca 780

tcagtgaccg tgagcagcac tacgacccct gcaccgcggc cgcctactcc tgcacctaca 840

atcgcaagtc agccactgag tctcagaccc gaagcatgcc gccctgctgc aggcggagct 900

gtccatacac gcggactgga ctttgcatgc gatatataca tctgggcacc actggccggc 960

acttgcggcg tgctgctcct gtccctcgtg attaccctgt actgcaaacg cggcaggaag 1020

aagctcctgt atatctttaa acagcccttc atgaggccag tgcagaccac tcaagaggaa 1080

gacggttgta gctgccggtt tcccgaggaa gaagagggag gctgcgagct ccgcgtgaag 1140

ttctcccgct cagccgatgc acccgcctat cagcaagggc agaaccagct gtacaatgag 1200

ctcaacctgg gaagaaggga ggaatatgac gttctggata aacggcgcgg tcgcgatccc 1260

gaaatgggtg ggaagcctcg caggaagaat cctcaggaag ggctctacaa tgagctgcag 1320

aaagacaaaa tggcagaggc ctattctgaa atcggcatga agggcgagcg ccgcagaggc 1380

aaaggacacg acggcctgta ccagggcctg tctacagcca ccaaggacac ctatgacgct 1440

ctccacatgc aagccctgcc accaaggtga 1470

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 24

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atggcactgc cagtgacagc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

cct 63

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys

20

<210> 26

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atggatatga gggttcctgc acaactcctg ggactcctcc tgctctggct gagaggcgca 60

agatgt 66

<210> 27

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 28

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 29

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 30

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 31

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 32

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aagagaggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60

acaacccagg aggaggacgg ctgcagctgt cggttcccag aggaggagga gggaggatgt 120

gagctg 126

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 34

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

agggtgaagt tttctcggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120

agagatcccg agatgggagg caagccaagg aggaagaacc ctcaggaggg cctgtataat 180

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tactctgaga tcggcatgaa gggagagcgg 240

agaaggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctga gcacagccac caaggacacc 300

tacgatgcac tgcacatgca ggccctgcca cctagg 336

Claims

1.靶向CLL1嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗CLL1抗体。

2.根据权利要求1所述的靶向CLL1嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8～10之一所示的氨基酸序列；

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的靶向CLL1嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区包括CD8α铰链区；

优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区和/或CD28跨膜区；

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ；

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、DAP10或OX40中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体还包括信号肽；

优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽和/或IgGκ轻链信号肽。

4.根据权利要求1-3任一项所述的靶向CLL1嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括信号肽、抗CLL1抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；

优选地，所述靶向CLL1嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1-4任一项所述的靶向CLL1嵌合抗原受体的编码基因；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:18所示的核酸序列；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:19所示的核酸序列；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:20所示的核酸序列；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:21所示的核酸序列；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:22所示的核酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子；

优选地，所述表达载体为含有权利要求5所述的核酸分子的病毒载体或非病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种；

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

8.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求1-4任一项所述的靶向CLL1嵌合抗原受体；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子；

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒；

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种；

优选地，所述T细胞包括αβΤ细胞和/或γδΤ细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞；

10.权利要求1-4任一项所述的靶向CLL1嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒、权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述恶性肿瘤包括急性髓系白血病。