CN113234160A

CN113234160A - 一种抗pd-1抗体及其应用

Info

Publication number: CN113234160A
Application number: CN202110578514.5A
Authority: CN
Inventors: 张文军; 谭芳慧; 韦雪梅; 田文武; 李峰
Original assignee: Guangzhou Aisimai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Aisimai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113234160B

Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，提供了一种抗PD‑1抗体及其应用。本发明通过人PD‑1抗原免疫小鼠，构建抗体文库及筛选，获得鼠源抗人PD‑1抗体，而后经过人源化及亲和力成熟后获得高亲和力的抗PD‑1单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体能够很好地特异性与PD‑1结合，特异地解除PD‑1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。

Description

一种抗PD-1抗体及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD-1抗体以及其制备方法和肿瘤治疗上的应用。

背景技术

PD-1(Programmed Death-1，程序性细胞死亡因子1)是CD28家族的一种I型跨膜蛋白，表达在人类的T细胞、B细胞、巨噬细胞表面，向激活的T细胞提供抑制信号。全长PD-1含有288个氨基酸残基(NCBI登录号：NP_005009)。它的胞外域由氨基酸残基1-167组成，而胞质C末端尾部包含残基191-288，该尾部具有两个假设性免疫调节基序，一个是基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM；Vivier等人，1997Immunol Today 18:286-251)，一个是免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM；Chemnitz等人，2004J Immunol 173:945-954)。

PD-1具有两个已知的配体，PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，它们为B7家族的细胞表面表达的成员。当衔接配体时，PD-1将磷酸酶例如SHP-1和SHP-2招募至其细胞内酪氨酸基序，所述基序随后使被TCR或BCR信号转导激活的效应分子脱去磷酸。由此，仅当其同时与TCR或BCR衔接时，PD-1才可将抑制性信号转导入T细胞和B细胞。

作为一种重要的免疫抑制分子，表达在肿瘤细胞表面的PD-L1，与肿瘤微环境中浸润的T细胞表面PD-1结合，下调肿瘤特异性T细胞活性，或灭活T细胞，阻断免疫应答，使肿瘤细胞产生免疫逃逸，以致于机体免疫功能减弱甚至不能对肿瘤细胞进行攻击和杀伤(LENG等人，2016Oncol Rep 35(2):699-708；PALUCKA等人，2016Cell 164(6):1233-1247；HUGHES等人,2016Trends Immunol,2016,37(7):462-476)。

研究显示，耗竭的T细胞具有持续表达PD-1分子的特点，并且阻断PD-1及PD-L1的结合可以逆转T细胞的耗竭，并恢复抗原特异性T细胞在LCMV感染小鼠中的响应(Barber等人，2007Nature 439:682-687)。因此，通过抑制PD-L1与PD-1相互作用，可以提高T细胞的活性，对抗肿瘤细胞。

在各种涉及不同类型组织及器官的癌症方面，报告了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的PD-1表达及肿瘤细胞中的PD-1配体表达的增强，所述组织及器官诸如肺(Konishi等人，2004Clin Cancer Res 10:5094-5100)、肝(Shi等人，2008Int J Cancer 128:887-896；Gao等人，2009Clin Cancer Res 15:971-979)、胃(Wu等人，2006Acta Histochem 108:19-24)、肾(Thompson等人，2004Proc NatlAcad Sci 101:17174-17179；Thompson等人，2007ClinCancer Res 13:1757-1761)、乳腺(Ghebeh等人，2006Neoplasia 8:190-198)、卵巢(Hamanishi等人，2007Proc NatlAcad Sci104:3360-3365)、胰腺(Nomi等人，2007ClinCancer Res 13:2151-2157)、黑素细胞(Hino等人，2010Cancer 116:1757-1766)及食道(Ohigashi等人，2005Clin Cancer Res 11:2547-2553)。

PD-1信号传导上调不仅导致对癌生长的免疫耐受，而且导致人类中的病毒感染及扩充。流行性肝感染病毒HBV及HCV诱导肝细胞中的PD-1配体的过度表达及激活T效应细胞中的PD-1信号传导，从而引起T细胞耗竭及对病毒感染的耐受(Boni等人，2007J Virol81:4215-4225；Golden-Mason等人，2008J Immunol 180:3637-3641)。同样地，HIV感染常常藉由类似机制避开人类免疫系统。拮抗剂分子对PD-1信号传导的治疗性调控可从耐受中反转免疫细胞，并经再激活以根治癌症及慢性病毒感染(Blank等人，2005Cancer ImmunolImmunother 54:267-274；Okazaki等人，2007Int Immunol 19:813-824)。

针对PD-1的人源化IgG4(S228P)抗体派姆单抗(pembrolizumab，原来称为拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab))已显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，且已于2014年获FDA批准用于治疗黑色素瘤。针对人类PD-1的全人类IgG4(S228P)抗体纳武单抗(nivolumab)已显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，且已于2015年获FDA批准用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，在已披露的临床实验数据中显示治疗的患者在五年时继续显示长期总生存(OS)获益。

然而，目前特异性识别PD-1的抗体仍有待改进，本领域仍需要以更高亲和力结合PD-1的抗体，以为肿瘤或其他免疫疾病患者提供更为稳健有效的治疗方式。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种PD-1抗体及利用其制备的亲和力成熟文库和应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种鼠源PD-1抗体，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区包括如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27或SEQ ID No.28所示的氨基酸序列中的任意一种。

优选地，所述SEQ ID No.25所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR1，SEQ IDNo.26所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR2，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR3。

本发明通过哺乳动物细胞表达系统，表达纯化重组人源PD-1抗原并免疫BALB/c小鼠。分离小鼠脾脏组织，制备细胞悬液并提取总RNA。经逆转录后获得cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)克隆重链及轻链可变区基因。可变区经重叠延伸PCR扩增后克隆至噬菌粒载体并转化宿主TG1细胞，获得鼠源抗人PD-1scFv噬菌体文库。然后通过噬菌体展示及筛选，获得阳性鼠源抗人PD-1抗体。鼠源抗体经人源化及亲和力成熟后获得高亲和力的抗PD-1单克隆抗体。

本发明得到的鼠源PD-1抗体分别编号为mp12、mp30、mp47、mp49、mp54、mp66、mp69、mp88、mp91、mp95、mp119和mp148，除mp49外，其重链互补决定区CDR的氨基酸序列均包括SEQID No.25和SEQ ID No.26，并包括SEQ ID No.27或SEQ ID No.28中的任意一项。

作为本发明优选的技术方案，所述鼠源PD-1抗体的重链可变区包括如SEQ IDNo.1～12中任意一种所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述鼠源PD-1抗体的轻链可变区包括SEQ ID No.13～24中任意一种所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区CDR包括如SEQID No.25～27所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29～31中任意一种所示的氨基酸序列。

优选地，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区CDR包括如SEQ ID No.25～26和SEQID No.28所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.32～34中任意一种所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供一种人源化PD-1抗体，所述人源化PD-1抗体的重链互补决定区CDR 1包括如SEQ ID No.25所示的氨基酸序列；

重链互补决定区CDR 2包括如SEQ ID No.26所示的氨基酸序列；

重链互补决定区CDR 3包括如SEQ ID No.27或SEQ ID No.28所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述人源化PD-1抗体的重链可变区包括如SEQ IDNo.35或SEQ ID No.45所述的氨基酸序列。

优选地，所述人源化PD-1抗体的重链可变区为SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，重链框架区包括如SEQ ID No.36～39所示的氨基酸序列。

优选地，所述人源化PD-1抗体的重链可变区为SEQ ID No.45所示的氨基酸序列，重链框架区包括如SEQ ID No.46～49所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述人源化PD-1抗体的轻链可变区包括如SEQ IDNo.40或SEQ ID No.50所述的氨基酸序列。

优选地，所述人源化PD-1抗体的轻链可变区为SEQ ID No.40所示的氨基酸序列，轻链框架区包括如SEQ ID No.41～44所示的氨基酸序列。

优选地，所述人源化PD-1抗体的轻链可变区为SEQ ID No.50所示的氨基酸序列，轻链框架区包括如SEQ ID No.51～54所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述人源化PD-1抗体包括单克隆抗体。

优选地，所述单克隆抗体为双价抗体或多价抗体。

第三方面，本发明还提供一种利用如第二方面所述的人源化PD-1抗体制备和筛序得到的人源化亲和力成熟PD-1抗体。

优选地，所述人源化亲和力成熟PD-1抗体的重链互补决定区包括如SEQ IDNo.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27中任意两项所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的氨基酸序列，同时，其重链互补决定区还包括如SEQ ID No.55～68中任意一项所示的氨基酸序列；

或者，所述人源化亲和力成熟PD-1抗体的重链互补决定区包括如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30或SEQ ID No.31中任意两项所示的氨基酸序列，同时，其轻链互补决定区还包括如SEQ ID No.69～91中任意一项所示的氨基酸序列；

或者，所述人源化亲和力成熟PD-1抗体的重链互补决定区的CDR 1包括如SEQ IDNo.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.28所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ IDNo.32和SEQ ID No.33所示的氨基酸序列，同时，其其轻链互补决定区还包括如SEQ IDNo.92～100中任意一项所示的氨基酸序列。

第四方面，本发明还提供了如第一方面所述的鼠源PD-1抗体、如第二方面所述的人源化PD-1抗体或如第三方面所述的人源化亲和力成熟PD-1抗体在制备预防或治疗肿瘤、感染性疾病或免疫系统疾病的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌或卵巢癌中的任意一种。

优选地，所述感染性疾病包括但不限于HIV病毒感染、肝炎病毒感染、疱疹病毒感染或流感病毒感染中的任意一种。

优选地，所述免疫系统疾病包括但不限于红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎或Wegener肉芽肿病中的任意一种。

需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：

抗体：antibody，Ab；单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs；双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb；

免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；程序性死亡细胞蛋白1：Programmed Death-1，PD-1；

重链：heavy chain，HC；轻链：light chain，LC；重链可变区：heavy chainvariable domain，VH；重链恒定区：heavy chain constant domain，CH；轻链可变区：lightchain variable domain，VL；轻链恒定区：light chain constant domain，CL；

单链可变区抗体片段(又称单链抗体)：single-chain variable fragment，scFv；互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区；抗原结合区：antigen binding fragment，Fab；铰链区：hinge region；Fc片段：fragmentcrystallizable region，Fc region；

自然杀伤细胞：natural killing cell，NK细胞；T细胞受体：T cell receptor，TCR；免疫受体酪氨酸活化基序：immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM；FACS：流式细胞术。

本发明中所述“抗体”包括全长抗体和抗体片段，涉及来自有机体的天然抗体、基因工程抗体或者通过重组技术获得的抗体。术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等。术语“抗体”还包括鼠源抗体、人源化抗体和人抗体等。

本发明中所述“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于90％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE)测定的。

本发明中所述“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的架构区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。

本发明中所述“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸或者任何可能出现在某一特定的位置非天然的氨基酸类似物。本发明中所述“氨基酸突变”是指多肽链中某一个氨基酸的添加、取代、插入和/或删除。

本发明中所述“EC50”即半最大效应浓度(Concentration for 50％ofmaximaleffect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的抗PD-1抗体或其抗体片段或由其组成的双特异性抗体，具有以下一项或多项性质：

(1)能够特异性结合人或猴的PD-1分子，

(2)能够阻断PD-1与PD-L1的结合，

(3)并能够产生一系列生物学效应，包括：激活T细胞，特别是能够抑制小鼠体内肿瘤生长；

本发明提供的鼠源或者人源化PD-1抗体，与人PD-1抗原和食蟹猴PD-1抗原的结合效率较高，且不与人PD-L1、LAG3、TIGIT及CTLA-4抗原的结合，抗原特异性良好；同时，所述抗体会与PD-L1抗原竞争结合PD-1抗原，对PD-1/PD-L1有阻断作用。因此，本发明所述的PD-1抗体能够通过消除、抑制PD-1活性来预防或治疗包括癌症、感染性疾病或免疫系统疾病在内的多种疾病，应用价值较高。

附图说明

图1为ELISA检测鼠源抗PD-1抗体与人PD-1抗原的结合活性结果曲线图。

图2为鼠源抗PD-1抗体与Jurkat细胞结合能力的检测结果图。

图3(A)为人源化hmp12变体与过表达PD-1抗原的Jurkat细胞的结合检测结果图。

图3(B)为人源化hmp148变体与过表达PD-1抗原的Jurkat细胞的结合检测结果图。

图4为ELISA检测人源化hmp12变体、hmp148变体与人PD-1抗原的结合活性结果曲线图。

图5为ELISA检测hmp12亲和力成熟变体、hmp148亲和力成熟变体与人PD-1抗原的结合活性结果曲线图。

图6(A)为人源化hmp12变体与过表达PD-1抗原的Jurkat细胞的结合检测结果图。

图6(B)为人源化hmp148变体与过表达PD-1抗原的Jurkat细胞的结合检测结果图。

图7为ELISA检测亲和力成熟变体与食蟹猴PD-1抗原的结合活性结果曲线图。

图8为亲和力成熟变体与人CTLA4抗原、人PD-L1抗原、人LAG3抗原、人TIGIT抗原的结合活性结果曲线图。

图9为ELISA检测亲和力成熟变体与PD-L1抗原竞争结合PD-1抗原的能力结果图。

图10为利用荧光素酶报告基因系统检测亲和力成熟变体阻断PD-1/PD-L1间作用刺激T细胞活化的结果图。

图11为利用荧光素酶报告基因系统检测抗PD-1-抗TIGIT双特异性抗体阻断PD-1/PD-L1间作用刺激T细胞活化的结果图。

图12为抗PD-1-抗TIGIT双特异性抗体在结直肠癌动物模型中的平均肿瘤体积变化曲线图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1鼠源抗-PD-1抗体的生成

本实施例表明结合人PD-1的本发明的小鼠抗体，可以从衍生自用重组人PD-1蛋白免疫小鼠获得的脾细胞经噬菌体展示技术筛选获得，并且此类结合是特异的。

(1)小鼠的免疫接种

用PD-1蛋白(PD-1:Programmed cell death protein 1，NCBI登录号：NP_005009，表达胞外区1-167位氨基酸)作为抗原，在第0、14、21、28天右侧免疫雌性5-6周的BALB/c小鼠(购自广东省实验动物中心)。于第28天从经免疫的小鼠取血清并测量其与PD-1抗原的结合，结果表明所有小鼠均显示阳性结合。从经免疫的小鼠分离脾细胞，提取RNA，逆转录得cDNA，PCR扩增全套抗体的重链和轻链可变区序列。重链和轻链可变区经重叠延伸PCR扩增得到VH-linker-VL，后克隆至噬菌粒载体并转化宿主细胞(TG1 Electrocompetent Cells：Lucigen.)，获得鼠源抗人PD-1可变区scFv噬菌体文库。将抗体片段群与噬菌体pIII蛋白融合表达，并展示于噬菌体表面，经三轮淘洗后，富集阳性克隆，测序，根据CDR区序列区分这些克隆，共得到12株CDR区序列不同的鼠源抗PD-1单克隆抗体，分别命名为mp12、mp30、mp47、mp49、mp54、mp66、mp69、mp88、mp91、mp95、mp119、mp148。

(2)鼠源抗PD-1抗体的表达、纯化

本发明涉及的所有抗体均采用HEK293F细胞瞬时转染表达。将12株鼠源抗PD-1抗体分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hFc中，提取重组质粒，共转染293F细胞。细胞培养6-7天后，将培养液通过高速离心后，上样至proteinA亲和层析柱纯化。纯化产物即为12株鼠源抗PD-1抗体。

本发明中采用的阳性对照抗体纳武单抗及另一阳性对照抗体帕博利珠单抗，序列均来源于Drugbank(https://www.drugbank.com/)，采用上述同样方法表达纯化，获得对照抗体模拟物。本发明中呈现的鼠源抗-PD-1抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列如下表1所示。

表1

(3)鼠源抗PD-1抗体的验证

分别采用间接ELISA方法和间接流式细胞术法验证鼠源抗PD-1抗体的结合活性。

间接ELISA法测定鼠源抗PD-1抗体与人PD-1抗原的结合活性，方法具体如下：

96孔酶标板中，每孔加入人PD-1抗原孵育(ACRO，Cat.PD-1-H5221，PBS稀释)，4℃过夜。用含3％牛奶的PBS封闭2h后，0.05％PBST洗涤。分别加入梯度稀释的鼠源抗PD-1抗体(100μL/孔，PBS稀释)，室温孵育1h。0.05％PBST洗去未结合物，每孔加入100μL二抗HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(Proteintech，Cat.SA0001-17)，室温孵育1h，0.05％PBST洗去未结合物。加入TMB显色5min，终止反应后，在酶标仪450nM处检测波长吸光度。以log(抗体浓度)为横坐标，吸光度OD₄₅₀为纵坐标，绘制剂量效应曲线。以EC₅₀代表抗体与抗原的结合活性。以PD-1抗体纳武单抗模拟物作为结合测定的阳性对照。

鼠源抗体与PD-1抗原的结合曲线如图1所示。由图可见，筛选所得12株鼠源抗PD-1抗体均能有效地与PD-1抗原结合，且其结合活性呈剂量依赖关系。其中，部分鼠源抗PD-1抗体(mp12、mp54、mp119、mp30、mp66、mp47、mp91、mp148)与PD-1抗原的结合活性，与纳武单抗模拟物与PD-1抗原的结合活性相当。12株鼠源抗PD-1抗体及阳性对照纳武单抗模拟物与人PD-1抗原的结合活性EC₅₀如下表2所示。

表2

为评估鼠源抗PD-1抗体的细胞结合特异性，本实施例采用间接流式细胞术法测定鼠源抗PD-1抗体与过表达人PD-1抗原及未经转染的Jurkat细胞的结合。具体方法如下：

收集过表达人PD-1抗原的Jurkat/PD-1细胞(Jurkat，人外周血白血病T细胞)及未经转染的Jurkat细胞，调整细胞密度。每个收集管分别加入稀释的鼠源抗PD-1抗体(用含2％FBS的PBS稀释)，冰上共同孵育1小时。用PBS洗涤后，加入PE标记的抗人IgG Fc二抗(BioLegend，Cat.409264)，冰上孵育1小时。再用PBS洗涤3次后，加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(CytoFlek,A00-1-1102)PE通道上检测荧光信号。将抗PD-1抗体纳武单抗模拟物作为结合特异性测定的阳性对照。

结果见图2，筛选所得12株鼠源抗PD-1抗体及阳性对照纳武单抗模拟物均能与过表达人PD-1抗原的Jurkat细胞结合(右侧实线)，但不结合未经PD-1转染的Jurkat细胞(左侧实线)。这些数据表明鼠源抗PD-1抗体的结合特异性。

实施例2鼠源抗体人源化及其人源化抗体的表达、纯化及验证

本实施例表明本发明中结合人PD-1的小鼠抗体，可以转化为保留PD-1结合和结合特异性的人源化IgG抗体。

通过前述实施例获得12株与PD-1结合力较强的候选鼠源抗体。其中，选择与PD-1结合力最强的鼠源抗体mp12及mp148进行后续人源化与功能验证，其重链互补决定区(HC-CDR)及轻链互补决定区(LC-CDR)如下表3所示。

表3

(1)鼠源抗体人源化

将如实施例1中所述产生的小鼠抗PD-1抗体mp12及mp148的可变区人源化，并表达为全长hIgG1/hκ抗体。方法具体如下：通过搜索IMGT结构域空位比对3D结构数据库(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi),比对鼠源抗体的骨架区(Framework，FR)与人源抗体的骨架区，根据高同源性突变相应位点的鼠源抗体序列的框架氨基酸，并与原有重链互补决定区及轻链互补决定区重新组合，获得人源化抗体序列hmp12与hmp148。

本发明呈现的人源化抗PD-1抗体hmp12与hmp148可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)序列如下表4所示：

表4

(2)人源化抗体hmp12和hmp148的构建和表达

如前述实施例方法，分别合成编码人源化hmp12和hmp148抗体重链和轻链DNA且将其克隆至表达载体pcDNA3.1中。提取重组质粒，共转染HEK293F细胞。细胞培养6-7天后，将培养上清液通过高速离心后，上样至proteinA亲和层析柱纯化。纯化产物即为人源化抗体hmp12和hmp148。

(3)人源化抗体hmp12和hmp148的验证

如前述实施例方法，采用间接流式细胞术法检测人源化抗体hmp12和hmp148抗体与过表达人PD-1抗原的及未经转染的Jurkat细胞的结合。如图3(A)和图3(B)所示，人源化抗体hmp12和hmp148抗体均能与过表达人PD-1抗原的Jurkat细胞结合(右侧实线)，但不结合未经转染的Jurkat细胞(左侧实线)。

为进一步验证人源化抗体hmp12和hmp148与人PD-1抗原的结合活性，采用前述间接ELISA方法，检测hmp12、hmp148与人PD-1抗原的结合。结果如图4所示，hmp12、hmp148与人PD-1抗原结合，但其结合活性弱于纳武单抗模拟物。

以上结果表明，鼠源抗体mp12及mp148经人源化后产生的抗体hmp12、hmp148，保留与PD-1的特异性结合，但其与人PD-1抗原的结合活性有不同程度的下降。

实施例3人源化抗体亲和力成熟

本实施例表明本发明中结合人PD-1的人源化抗体，可以转化为与PD-1特异性结合并且与PD-1结合增强的人源化IgG抗体。

将如实施例2中所述产生的人源化抗PD-1抗体hmp12及hmp148，利用噬菌体展示技术，构建抗体突变库，筛选出高亲和力抗体，并表达为全长hIgG1/hκ抗体。方法具体如下：

(1)亲和力成熟抗体的生成

为了生成人源化抗体重链互补决定区HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR3和轻链互补决定区LC-CDR 1、LC-CDR 2、LC-CDR3中随机化的亲和力成熟文库，将编码HC-CDR 1、HC-CDR2、HC-CDR3及编码LC-CDR 1、LC-CDR 2、LC-CDR3中的氨基酸三联密码子随机化。分别合成HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR3、LC-CDR 1、LC-CDR 2、LC-CDR3的三联密码子上下游随机引物。

使用人源化抗体(VH-linker-VL)形式作为模板，使用抗体上游引物及下游随机引物扩增第一片段(片段1)。使用相同模板，使用单链抗体下游引物及上游随机引物扩增第二片段(片段2)。片段1的3'端与片段2的5'端具有交叠区。交叠延伸PCR生成具有随机化CDR的第三片段(片段3)。然后，将所得的片段3克隆至噬菌粒载体经电转化大肠杆菌感受态细胞(TG1 Electrocompetent Cells：Lucigen.)，并均匀涂布平板。37℃过夜培养后收集菌体，所得菌体为人源化抗体的亲和力成熟文库。

针对人源化抗体hmp12共构建6个文库，分别为：hmp12-HC-CDR 1文库、hmp12-HC-CDR2文库、hmp12-HC-CDR 3文库、hmp12-LC-CDR 1文库、hmp12-LC-CDR 2文库、hmp12-LC-CDR 3文库；

针对人源化抗体hmp148共构建6个文库，分别为：hmp148-HC-CDR 1文库、hmp148-HC-CDR 2文库、hmp148-HC-CDR 3文库、hmp148-LC-CDR 1文库、hmp148-LC-CDR2文库、hmp148-LC-CDR 3文库。

(2)亲和力成熟文库的筛淘

通过噬菌体展示技术来实施亲和力成熟的人源化抗体的生成，人源化抗体hmp12共获得37个亲和力成熟变体，人源化抗体hmp148共获得9个亲和力成熟变体。

其中，37个hmp12人源化抗体亲和力成熟变体中重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别被指定为SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39；轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别被指定为SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQID No.43、SEQ ID No.44。各个变体的HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR 3、LC-CDR 1、LC-CDR 2、LC-CDR 3区序列如表5：

表5

此外，9个hmp148人源化抗体亲和力成熟变体中重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别被指定为SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49；轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别被指定为SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQID No.53、SEQ ID No.54。各个变体的HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR 3、LC-CDR 1、LC-CDR 2、LC-CDR 3区序列如表6：

表6

实施例4亲和力成熟各变体表达、纯化及验证

如前述实施例方法表达、纯化各亲和力成熟变体。采用下述方法验证各亲和力成熟变体的活性。

(1)亲和力成熟各变体与人PD-1抗原的结合活性

如前述实施例方法，采用间接ELISA法检测hmp12和hmp148亲和力成熟各变体与人PD-1抗原的结合活性。

检测结果如表7、表8所示，hmp12及hmp148亲和力成熟各变体与人PD-1抗原的结合活性EC₅₀(μg/mL)均有提高，部分变体与人PD-1抗原的结合活性与纳武单抗模拟物相当。各亲和力成熟变体与人PD-1抗原的结合曲线如图5所示。

表7

表8

(2)亲和力成熟各变体的结合特异性

上述亲和力成熟变体均能与人PD-1抗原结合，选择24株亲和力较强的hmp12亲和力成熟变体及9株hmp148亲和力成熟变体，如前述实施例方法，采用间接流式细胞术法检测其与过表达人PD-1抗原的Jurkat细胞结合及未经转染PD-1的Jurkat细胞的结合。

结果见图6(A)和图6(B)，所有测试的亲和力成熟变体抗体仍保持与Jurkat/PD-1细胞上的PD-1抗原结合(右侧实线)，但不结合未经转染PD-1的Jurkat细胞(左侧实线)。这些数据表明亲和力成熟各变体的结合特异性。

(3)亲和力成熟各变体针对猴PD-1的交叉反应性

通过前述实施例，选择与人PD-1抗原结合活性最强的10株亲和力成熟变体(hmp12-4F3、hmp12-1E3、hmp12-2A2、hmp12-5G6、hmp12-5H8、hmp12-5A4、hmp12-5C5及hmp148-2G1、hmp148-2G5、hmp148-1C3)，采用间接ELISA法检测其与猴PD-1抗原的结合能力。

方法具体如下：将食蟹猴PD-1抗原(ACRO，Cat.PD-1-C5223，1μg/mL，100μL/孔)加入酶标板中，4℃包被过夜。次日，0.05％PBST洗涤后，室温封闭2h。再次用0.05％PBST洗涤后，加入梯度稀释的抗PD-1抗体(PBS稀释)，室温孵育1h。0.05％PBST洗涤未结合物，后加入HRP标记的羊抗人IgG(H+L)二抗(Proteintech，Cat.SA0001-17)，室温孵育1h。0.05％PBST洗涤后，加入TMB显色液，室温避光孵育5min，用H₂SO₄终止反应，在酶标仪450nM处检测吸光度。以log(抗体浓度)为横坐标，吸光度OD₄₅₀为纵坐标，绘制剂量效应曲线。

结果见图7，上述10株亲和力成熟变体与食蟹猴PD-1抗原都有较好的结合活性。

(4)亲和力成熟各变体的特异性检测

前述10株亲和力成熟变体与人PD-1抗原及食蟹猴PD-1抗原都有较好的结合活性。本实施例采用间接ELISA法检测10株亲和力成熟变体与VISTA、PD-L1、LAG3、TIGIT及CTLA-4抗原的结合活性。VISTA、LAG3、TIGIT及CTLA-4，与PD-1同为T细胞免疫检查点，PD-L1为PD-1的配体。方法具体如下：

96孔酶标板中分别包被稀释的人VISTA、PD-L1、LAG3、TIGIT及CTLA-4抗原，加入梯度稀释的抗PD-1抗体，按常规间接ELISA方法进行操作，将偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG多克隆抗体用作二抗。在酶标仪450nM处检测吸光度。以log(抗体浓度)为横坐标，吸光度OD₄₅₀为纵坐标，绘制剂量效应曲线。

结果见图8，10株亲和力成熟变体均不与人PD-L1、VISTA、LAG3、TIGIT及CTLA-4抗原结合。

(5)亲和力成熟各变体阻断人PD-L1(hPD-L1)与人PD-1(hPD-1)结合的测试

通过前述实施例获得10株特异性结合PD-1抗原且有较高亲和力的抗PD-1抗体。本实施例采用竞争ELISA方法，检测上述抗PD-1抗体与PD-L1抗原竞争结合PD-1抗原的能力。

方法具体如下：

96孔酶标板中包被人PD-1抗原(ACRO，Cat.PD-1-H5221，1μg/mL，100μL/孔)，4℃孵育过夜。次日，用含3％牛奶的-PBS室温封闭2h，0.05％PBST洗涤。同时，配制抗PD-1抗体与PD-L1抗原的混合物：将梯度稀释的抗PD-1抗体，与PD-L1-Mouse IgG1 Fc Tag抗原(ACRO，Cat.PD-1-H52A3，1μg/mL)按体积比1:1混匀，室温放置30min。96孔板中，每孔加入抗PD-1抗体与PD-L1抗原的混合物，室温孵育2h。0.05％PBST洗涤后，加入二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(Proteinteh，Cat.SA00001-1)，室温孵育1h。0.05％PBST洗涤后，加入TMB显色液，室温避光孵育，用H₂SO₄终止反应，在酶标仪450nM处检测吸光度。分析数据，以log(抗体浓度)为横坐标，OD₄₅₀为纵坐标，绘制剂量效应曲线。

结果如图9所示，上述10株抗PD-1抗体均能与PD-L1抗原竞争结合PD-1抗原，说明其能有效阻断PD-L1与PD-1的结合。

(6)亲和力成熟各变体阻断PD-1/PD-L1间作用刺激T细胞活化

通过前述实施例获得的10株抗PD-1抗体均能特异性结合PD-1抗原，且有较高亲和力，并能阻断PD-L1与PD-1结合。为进一步验证其生物学活性，本实施例采用Jurkat/hPD-1NAFT-Luciferase与CHO-K1/hPD-L1组成的荧光素酶报告基因系统，测定上述10株抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1间作用刺激T细胞活化的能力。检测原理描述为：在Jurkat/hPD-1NFAT-Luciferase细胞系中，荧光素酶基因受NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)转录因子调控，作为效应细胞。过表达人PD-L1的细胞CHO-K1/hPD-L1作为靶细胞。当只有Jurkat/hPD-1NFAT-Luciferase细胞与CHO-K1/hPD-L1细胞共培养时，Jurkat/hPD-1NFAT-Luciferase上的PD-1与CHO-K1/hPD-L1细胞上的PD-L1结合，TCR信号通路及NAFT介导的荧光素酶表达通路受到抑制，荧光素酶不表达。而当加入抗PD-1抗体时，抗PD-1抗体可以与Jurkat/hPD-1NFAT-Luciferase上的PD-1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，激活TCR和NAFT介导的荧光素酶表达通路，促使荧光素酶表达，从而可以通过检测细胞中的荧光素酶表达量来判断Jurkat T细胞激活程度的强弱。

方法具体如下：在96孔细胞培养板中依次加入Jurkat/hPD-1NAFT-Luciferase细胞(和CHO-K1/hPD-L1细胞。上述细胞培养板中加入稀释后的PD-1抗体，37℃静置培养5-6h后，加入荧光素酶检测试剂(Promega，ONE-Glo Luciferase)，使用多功能酶标仪测定化学发光值(Luminescence)。

如图10，结果显示hmp12-4F3、hmp12-5H8、hmp12-1E3、hmp12-2A2、hmp12-5G6、hmp12-5A4、hmp12-5C5及hmp148-1C3、hmp148-2G1、hmp148-2G5抗体组化学发光值较高，说明其均能有效阻断PD-1/PD-L1间作用，刺激T细胞活化，促进荧光素酶表达。而同型对照抗体IgG不能阻断PD-1/PD-L1间作用，荧光素酶不表达，检测所得化学发光值低。

实施例5制备PD-1双特异性抗体并验证其抗肿瘤活性

为验证前述获得的抗PD-1抗体其有益效果，本发明人创造性的将前述其中一种抗PD-1抗体与本发明人前期筛选获得的抗TIGIT抗体，利用基因工程技术手段，基于本发明人已获得的专利(WO2017034770A1)所述技术，构建抗TIGIT/抗PD-1双特异性抗体。

(1)体外检测抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的生物学活性

本实施例采用由表达TIGIT、PD-1和荧光素酶的Jurkat效应细胞(Jurkat/PD-1/TIGIT-Luciferase)，表达CD155、PD-L1和TCR活化剂的CHO-K1人工抗原呈递细胞(aAPC)(CHO-K1/PD-L1/CD155)组成的荧光素酶报告基因系统，测定抗TIGIT/PD-1双特异性抗体的体外生物学活性。该系统中，将Jurkat/PD-1/TIGIT-luc与CHO-K1/PD-L1/CD155共培养时，Jurkat效应细胞含有由启动子驱动的荧光素酶报告基因，在不存在阻断性抗TIGIT抗体的情况下，CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1结合导致T细胞共抑制且无启动子活性；加入抗TIGIT/抗PD-1双特异性抗体后，PD-L1/PD-1相互作用被阻断，减轻一种共抑制信号，而CD155-TIGIT相互作用被中断，发出共刺激信号并驱动荧光素酶产生。

在96孔细胞培养板中依次加入Jurkat/hPD-1NAFT-Luciferase细胞(5×10⁴细胞/孔)和CHO-K1/hPD-L1细胞(20×10⁴细胞/孔)。再将抗TIGIT/抗PD-1双特异性抗体依次梯度稀释，加入到上述细胞培养板中，37℃静置培养5-6h后，加入ONE-Glo Luciferase检测试剂，使用多功能酶标仪测定化学发光值(Luminescence)。

结果如图11所示，抗TIGIT/抗PD-1双特异性抗体通过阻断CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1的相互作用来激活T细胞表达荧光素酶，并具有较强的功能活性。

(2)基于人源化hPD-1/hTIGIT小鼠MC38结直肠癌动物模型的抗PD-1-抗TIGIT双特异抗体药效实验

本实施例初步检测了抗TIGIT/抗PD-1双特异抗体在人源化hPD-1/hTIGIT小鼠异种移植小鼠结直肠癌MC38肿瘤模型上的抗肿瘤活性。

实验材料选用基于C57BL/6背景的雌性hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠，实验动物购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。小鼠适应环境一周后，每只小鼠于右侧背部皮下接种5×10⁵个小鼠结直肠癌MC38细胞。待肿瘤体积长至约75mm³时，按6只小鼠每组进行随机分组，分别设定为阴性对照组和给药组。分组当天给药，设为D0。阴性对照组和给药组分别给予生理盐水和抗TIGIT/抗PD-1双特异抗体治疗，每周给药2次，连续给药2周，给药方式为静脉注射，抗PD-1-抗TIGIT双特异抗体的剂量为5mg/kg。自给药之日起，每周测量2次肿瘤体积，测量其长径a，短径b。给药结束观察至D21，终止实验。

肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm³)＝(a x b²)/2；肿瘤体积抑制率(TGI_TV)：TGI_TV(％)＝[1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100％；(T_i：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，T₀：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；V_i：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V₀：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。

在实验终点(即分组给药第21天)，hPD-1/hTIGIT双人源化小鼠肿瘤体积如下表9所示，肿瘤体积变化曲线如图12所示，结果显示抗TIGIT/抗PD-1双特异抗体在测试剂量显著抑制肿瘤体积增长，与生理盐水对照组相比，具有统计学差异(t-test分析，p<0.05)。

表9

综上所述，本发明提供的抗PD-1单克隆抗体及人源化抗PD-1单克隆抗体、人源化抗PD-1单克隆抗体亲和力成熟变体，抗TIGIT/抗PD-1双特异抗体能够有效阻断PD-1与PD-L1的结合，特异性解除PD-1对机体的免疫抑制作用，激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司

<120> 一种抗PD-1抗体及其应用

<130> 20210524

<160> 100

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Glu Val Asn Val Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Glu Val Met Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Glu Val Leu Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Ser Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Asp Val Asn Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 11

Glu Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Glu Val Lys Val Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 13

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Asp Ile Val Ile Met Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu Arg

100 105

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 15

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

100 105

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 17

Asp Ile Val Leu Met Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Arg Glu Arg Lys Arg

100 105

<210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

100 105

<210> 19

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 19

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 20

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 21

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 21

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 23

Asp Ile Val Met Met Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Asp Ile Val Met Met Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 25

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 26

Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 27

Ala Ser Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 28

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 29

Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr

1 5

<210> 30

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 30

Arg Thr Ser

1

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 31

Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 32

Gln Ser Ile Ser Asn Asn

1 5

<210> 33

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 33

Tyr Ala Ser

1

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 34

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr

1 5

<210> 35

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 37

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 38

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 38

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 39

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 42

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 43

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 43

Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 44

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 45

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 47

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 48

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 48

Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 49

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 52

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Lys

<210> 53

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 53

Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 54

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 55

Ile Ser Gly Gly Ala Arg Tyr Gln

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 56

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Leu

1 5

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 57

Ile Ser Gly Gly Met Arg Tyr Val

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 58

Ile Ser Gly Gly Ala Arg Trp Ser

1 5

<210> 59

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 59

Ile Ser Gly Gly Ala Arg Tyr Lys

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 60

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Gln

1 5

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 61

Ile Ser Gly Gly Ala Arg Tyr Ala

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 62

Ile Ser Gly Gly Gly Ser His Phe

1 5

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 63

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Ser

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 64

Ile Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Glu

1 5

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 65

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Trp Leu

1 5

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 66

Ile Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln

1 5

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 67

Ala Ser Pro Tyr Ala Ser Tyr Val Glu Ile

1 5 10

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 68

Ala Ser Pro Tyr Ala Thr Leu Ile Asp Val

1 5 10

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 69

Ser Ser Ile Ser Cys Gly Phe

1 5

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 70

Ser Ser Ile Ser Gln Trp Trp

1 5

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 71

Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Leu

1 5

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 72

Ser Ser Ile Ser Ser His Tyr

1 5

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 73

Ser Ser Ile Ser Tyr Arg Leu

1 5

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 74

Ser Ser Ile Ser His His Trp

1 5

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 75

Ser Ser Ile Ser Gly Pro Trp

1 5

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 76

Ser Ser Ile Ser Tyr Met Leu

1 5

<210> 77

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 77

Ser Ser Ile Ser Tyr Gly Leu

1 5

<210> 78

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 78

Ser Ser Ile Ser His Gly Leu

1 5

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 79

Ser Ser Ile Ser Asp Leu Trp

1 5

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 80

Ser Ser Ile Ser Tyr Gln Leu

1 5

<210> 81

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 81

Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Leu

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 82

Gln Gln Gly Ser Ser Met Asp Phe Ser

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 83

Gln Gln Gly Ser Met Gln Leu Phe Ser

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 84

Gln Gln Gly Ser Ser Ile Tyr Thr Gly

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 85

Gln Gln Gly Ser Ser Gln Thr Phe Thr

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 86

Gln Gln Gly Ser Ser Gln Ser Phe Ser

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 87

Gln Gln Gly Ser Thr Gln Phe Tyr Gly

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 88

Gln Gln Gly Ser Asp Gln Lys Tyr Ser

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 89

Gln Gln Gly Ser Ser Gln Ala Tyr Ser

1 5

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 90

Gln Gln Gly Ser Gln Gln Ala Leu Ser

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 91

Gln Gln Gly Ser Ala Gln Gly Tyr Ser

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 92

Gln Gln Ser Gln Val Phe Phe Tyr Asn

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 93

Gln Gln Ser Leu Tyr Leu Tyr Met Thr

1 5

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 94

Gln Gln Ser Tyr Trp Ile Trp Thr Ser

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 95

Gln Gln Ser Leu Val Ile Trp Tyr Ser

1 5

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 96

Gln Gln Ser Met Phe Ile Glu Tyr Thr

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 97

Gln Gln Ser Glu Trp Ile Arg Thr Ser

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 98

Gln Gln Ser Ala Leu Tyr Leu Val Cys

1 5

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 99

Gln Gln Ser Tyr Phe Phe Ser Tyr Thr

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 100

Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Phe Tyr Ser

1 5

Claims

1.一种鼠源PD-1抗体，其特征在于，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区包括如SEQID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27或SEQ ID No.28所示的氨基酸序列中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的鼠源PD-1抗体，所述SEQ ID No.25所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR1，SEQ ID No.26所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR2，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的氨基酸序列为重链互补决定区CDR3；

优选地，所述鼠源PD-1抗体的重链可变区包括SEQ ID No.1～12中任意一种所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的鼠源PD-1抗体，其特征在于，所述鼠源PD-1抗体的轻链可变区包括SEQ ID No.13～24中任意一种所示的氨基酸序列；

优选地，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区CDR包括如SEQ ID No.25～27所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29～31中任意一种所示的氨基酸序列；

优选地，所述鼠源PD-1抗体的重链互补决定区CDR包括如SEQ ID No.25～26和SEQ IDNo.28所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.32～34中任意一种所示的氨基酸序列。

4.一种人源化PD-1抗体，其特征在于，所述人源化PD-1抗体的重链互补决定区CDR1包括如SEQ ID No.25所示的氨基酸序列；

重链互补决定区CDR 2包括如SEQ ID No.26所示的氨基酸序列；

5.根据权利要求4所述的人源化PD-1抗体，其特征在于，所述人源化PD-1抗体的重链可变区包括如SEQ ID No.35或SEQ ID No.45所述的氨基酸序列；

优选地，所述人源化PD-1抗体的重链可变区为SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，重链框架区包括如SEQ ID No.36～39所示的氨基酸序列；

6.根据权利要求4或5所述的人源化PD-1抗体，其特征在于，所述人源化PD-1抗体的轻链可变区包括如SEQ ID No.40或SEQ ID No.50所述的氨基酸序列；

优选地，所述人源化PD-1抗体的轻链可变区为SEQ ID No.40所示的氨基酸序列，轻链框架区包括如SEQ ID No.41～44所示的氨基酸序列；

7.根据权利要求4～6任一项所述的人源化PD-1抗体，其特征在于，所述人源化PD-1抗体包括单克隆抗体；

优选地，所述单克隆抗体为双价抗体或多价抗体。

8.一种利用如权利要求4～7任一项所述的人源化PD-1抗体获得的人源化亲和力成熟PD-1抗体。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述的人源化亲和力成熟PD-1抗体中包含的重链互补决定区包括如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27中任意两项所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的氨基酸序列，同时，其重链互补决定区还包括如SEQ ID No.55～68中任意一项所示的氨基酸序列；

或者，所述人源化亲和力成熟PD-1抗体包含的重链互补决定区包括如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30或SEQ ID No.31中任意两项所示的氨基酸序列，同时，其轻链互补决定区还包括如SEQ ID No.69～91中任意一项所示的氨基酸序列；

或者，所述人源化亲和力成熟PD-1抗体包含的重链互补决定区的CDR 1包括如SEQ IDNo.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.28所示的氨基酸序列，轻链互补决定区包括如SEQ IDNo.32和SEQ ID No.33所示的氨基酸序列，同时，其轻链互补决定区还包括如SEQ ID No.92～100中任意一项所示的氨基酸序列。

10.如权利要求1～3任一项所述的鼠源PD-1抗体、如权利要求4～7任一项所述的人源化PD-1抗体或如权利要求8或9所述的人源化亲和力成熟PD-1抗体在制备预防或治疗肿瘤、感染性疾病或免疫系统疾病的药物中的应用；

优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌或卵巢癌中的任意一种；

优选地，所述感染性疾病包括HIV病毒感染、肝炎病毒感染、疱疹病毒感染或流感病毒感染中的任意一种；

优选地，所述免疫系统疾病包括红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎或Wegener肉芽肿病中的任意一种。