CN113215129B - 一种耐高温复合酶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体提供了一种耐高温复合酶制剂，包括耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体。这种复合酶制剂，能够耐受85℃保温30min的特殊制粒环境，也能耐受85℃以上甚至100℃极端高温制粒条件，适用于诸如预防非洲猪瘟饲料等需要高温特殊制粒条件的饲料加工行业；此外，这种复合酶制剂还能降解饲料中植酸，提高饲料中可利用无机磷含量，减少粪便中磷排放量，提高饲料中碳水化合物的分解，提高还原糖含量，抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、广链球菌等有害菌。

Description

一种耐高温复合酶制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种耐高温复合酶制剂及其制备方法和应用。

背景技术

酶是一种具有催化反应能力的特殊蛋白质，是促进生物化学反应的高效物质，酶制剂是一类从动物、植物和微生物中提取的具有生物催化能力的蛋白质。饲用酶制剂是一种以酶为主要功能因子并通过特定生产工艺加工而成的饲料添加剂，饲用酶制剂可促进消化吸收，减少对环境的污染；降低食糜黏度，提高饲料的消化率；提高可消化养分的比例，改善饲料利用效率；消除饲料中抗营养因子；改善肠道菌群状态，提高动物健康水平。

为有效预防非洲猪瘟，提出了很多防疫措施，增加饲料制粒过程中的温度或时间就是其一，预防非洲猪瘟饲料加工制粒中温度较多选用85℃，也有少部分采用85℃以上温度，能够在此环境中存活，需具备极高的耐温性，绝大多数不耐高温的酶制剂在制粒过程中的高温瞬间就会不可逆的失活，降低饲料的吸收转化率，影响饲料本身的饲用营养价值。为此，本发明提供了一种能够耐受长时间高温处理的复合酶制剂，不仅能够适用于预防非洲猪瘟饲料的特殊制粒条件，还能抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、广链球菌等有害菌，降低饲料成本。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中酶制剂不能耐受长时间高温处理的问题。

为此，本发明提供了一种耐高温复合酶制剂，包括：耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体；其中所述耐高温植酸酶、所述耐高温木聚糖酶、所述耐高温淀粉酶和所述耐高温葡萄糖氧化酶均能耐85-100℃高温制粒，且所述耐高温复合酶制剂在85℃处理30min后能保留65％以上的酶活性，在100℃处理5min后能保留40％以上的酶活性。

具体的，上述耐高温复合酶制剂中所述耐高温植酸酶的质量分数为10％-30％、所述耐高温木聚糖酶的质量分数为10％-30％、所述耐高温淀粉酶的质量分数为 10％-30％、所述耐高温葡萄糖氧化酶的质量分数为10％-30％、所述载体的质量分数为0％-30％。

具体的，上述耐高温植酸酶的酶活为10000U/g、耐高温木聚糖酶的酶活为20000U/g、耐高温淀粉酶的酶活为1000U/g、耐高温葡萄糖氧化酶的酶活为1000U/g。

具体的，上述耐高温复合酶制剂能抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和广链球菌。

具体的，上述载体选自淀粉、麦麸、米糠、石粉中的一种或两种以上。

本发明提供的这种耐高温复合酶制剂可应用于需要进行高温制粒的饲料加工行业，所述耐高温复合酶制剂在饲料中的添加量为0.1-0.4‰，优选为0.2‰。

本发明还提供了一种耐高温复合酶制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过高温水浴法检测多种植酸酶、多种木聚糖酶、多种淀粉酶和多种葡萄糖氧化酶的单酶制剂的耐温存留率；

(2)选择高留存率组对应的初始单酶制剂或其经水浴加热后得到的单酶制剂作为复合酶制剂组分中的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶和耐高温葡萄糖氧化酶；

(3)将步骤(2)中得到的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体按比例混合均匀后，即得到复合酶制剂。

具体的，上述水浴法采用的水浴温度为85-100℃，水浴时间为5-30min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明提供的这种耐高温复合酶制剂，能够耐受85℃保温30min的特殊制粒环境，也能耐受85℃以上甚至100℃的极端高温制粒条件，适用于诸如预防非洲猪瘟饲料等需要高温特殊制粒条件的饲料加工行业。

(2)本发明提供的这种耐高温复合酶制剂能降解饲料中植酸，提高饲料中可利用无机磷含量，减少粪便中磷排放量；可提高饲料中碳水化合物的分解，提高还原糖含量；能够抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、广链球菌等有害菌，对于嗜水气单孢菌，抑菌效果大概相当于0.3-0.75ug环丙沙星的抑菌效果；对于沙门氏菌，抑菌效果大概相当于1.5-3ug环丙沙星的抑菌效果；对于金黄色葡萄球菌，抑菌效果大概相当于0.75-1.5ug环丙沙星的抑菌效果；对于大肠杆菌，抑菌效果比0.3ug 环丙沙星的抑菌效果差；对于广链球菌，抑菌效果大概相当于1.5-3ug环丙沙星的抑菌效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

本发明提供了一种耐高温复合酶制剂，包括耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体；所述耐高温植酸酶的质量分数为 10％-30％、所述耐高温木聚糖酶的质量分数为10％-30％、所述耐高温淀粉酶的质量分数为10％-30％、所述耐高温葡萄糖氧化酶的质量分数为10％-30％、所述载体的质量分数为0％-30％；其中所述耐高温植酸酶的酶活为10000U/g、耐高温木聚糖酶的酶活为20000U/g、耐高温淀粉酶的酶活为1000U/g、耐高温葡萄糖氧化酶的酶活为 1000U/g，所述载体选自淀粉、麦麸、米糠、石粉中的一种或两种以上；所述耐高温复合酶制剂能耐85-100℃高温制粒，在85℃处理30min后能保留65％以上的酶活性，在100℃处理5min后能保留40％以上的酶活性，且能抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和广链球菌。

下面通过具体实施例对本发明的这种耐高温复合酶制剂的效果进行研究。

实施例1：

本实施例提供了一种耐高温复合酶制剂的制备方法，包括以下步骤：

1筛选耐高温单酶制剂

1.1称取多种不同来源的植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶和葡萄糖氧化酶的工业化单酶制剂，使用对应缓冲液制备初始酶溶液，按照酶制剂标准检测各自的初始酶活，记为U₁；

初始酶溶液制备方法如下：称取酶制剂1.0g于锥形瓶中(精确至0.0002g)，使用100mL对应缓冲液进行提取30min，静止10min，上清为初始酶溶液；

1.2水浴高温处理

取1.1中的初始酶溶液，使用对应缓冲液进行稀释，将酶浓度控制为20U/mL，为待处理酶稀释液。取5mL待处理酶稀释液于10mL玻璃试管(φ15×100mm，保持试管一致性)中作为一个实验组，每种酶均设置五个实验组，按照85℃5min、 90℃5min、95℃5min、100℃5min、85℃30min的实验条件分别放入水浴锅中进行水浴，水浴锅只留一个开孔位φ60mm，水位加至边沿下2cm处，精确计时结束后，立即取出放入冰水浴中，冷却至室温，按照酶制剂活性测定标准检测热处理后各组的酶活，记为U₂。

1.3水浴法耐温存留率

按照公式K＝(U₁/U₂)×100％计算各组酶制剂水浴后的耐温存留率，选择在各水浴温度和水浴时间处理下均有较高留存率的实验组对应的初始单酶制剂或其经过水浴加热后得到的单酶制剂作为本发明的复合酶制剂组分中的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶和耐高温葡萄糖氧化酶，高留存率实验组的留存率结果如表1所示，筛选到的四种酶制剂，耐温性均极好，能够适用于高温、高湿的制粒环境。

表1筛选到的四种酶制剂的耐温留存率

2耐高温复合酶制剂中各单酶占比及酶活确定

将1中得到的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和选自淀粉、麦麸、米糠、石粉中的一种或两种的载体按比例混合，得到本发明的复合酶制剂，其中耐高温植酸酶的质量分数为10％-30％、耐高温木聚糖酶的质量分数为10％-30％、耐高温淀粉酶的质量分数为10％-30％、耐高温葡萄糖氧化酶的质量分数为10％-30％、载体的质量分数为0％-30％，达到复合酶中所述耐高温植酸酶的酶活为10000U/g、所述耐高温木聚糖酶的酶活为20000U/g、所述耐高温淀粉酶的酶活为1000U/g、所述耐高温葡萄糖氧化酶的酶活为1000U/g。

实施例2：

本实施例对耐高温单酶制剂的作用效果和耐高温复合酶制剂的作用效果进行了评估，使用实施例1中高留存率的实验组对应的初始单酶制剂作为耐高温单酶制剂。

1单酶作用效果评估

1.1植酸及碳水化合物酶解

将10000U/g的耐高温植酸酶分别以0.05‰、0.1‰、0.2‰和0.4‰的添加量加入到装有5.0g饲料的三角瓶中，加入100mL pH 6.5的乙酸缓冲液，将三角瓶用干净的塑料膜封口后置于水浴摇床，振幅为120rpm/min、水浴温度为28℃，水浴时间6 h，酶解完后过滤，检测滤液中无机磷，结果如表2所示。

将50000U/g的耐高温木聚糖酶分别以0.05‰、0.1‰、0.2‰和0.4‰的添加量加入到装有5.0g饲料的三角瓶中，加入100mL pH 6.5的乙酸缓冲液，将三角瓶用干净的塑料膜封口后置于水浴摇床，振幅为120rpm/min、水浴温度为28℃，水浴时间 6h，酶解完后过滤，检测滤液中还原糖，结果如表2所示。

将2000U/g的耐高温淀粉酶分别以0.05‰、0.1‰、0.2‰和0.4‰的添加量加入到装有5.0g饲料的三角瓶中，加入100mL pH 6.5的乙酸缓冲液，将三角瓶用干净的塑料膜封口后置于水浴摇床，振幅为120rpm/min、水浴温度为28℃，水浴时间6 h，酶解完后过滤，检测还原糖，结果如表2所示。

表2不同添加量下单酶的酶解效果

1.2抑菌试验

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、广链球菌、嗜水气单孢菌分别接种于50mL的LB培养基中，置于37℃培养箱培养16h后，用LB培养基稀释，使其在 600nm下的吸光值为0.30-0.36，将稀释后的菌悬液按0.1％添加至46℃±1℃的NA 培养基中，充分混匀后，用无菌移液管吸取20mL至无菌培养皿内，待其凝固后即为检测平板。

将2000U/g的耐高温葡萄糖氧化酶分别以0.05‰、0.1‰、0.2‰和0.4‰的添加量加入到饲料中混匀，作为四组实验组，每组称取1g混匀后的饲料，加入99mL灭菌的磷酸缓冲液，于摇床提取30min，再用磷酸缓冲液稀释后与等体积的0.1g/mL葡萄糖溶液混合，作为试样备用。

在检测平板上用镊子分区域放置牛津杯，取300uL上述四组试样，分别加入不同牛津杯中，同时以环丙沙星作为阳性对照，磷酸缓冲液作为阴性对照，无菌水和生理盐水作为空白对照，加盖陶瓦盖，置于37℃恒温培养箱培养18-24h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，实验结果如表3和表4所示。

表3不同添加量下耐高温葡萄糖氧化酶的抑菌圈直径

表4对照组的抑菌圈直径

根据表2-4可知，四种单一酶制剂的添加量越高，酶解和抑菌效果越好。各单酶添加量由0.05‰增加到0.1‰及0.2‰时，酶解效果和抑菌圈直径增量明显，但从0.2‰再增加至0.4‰时，虽有增量但没有前期明显，考虑添加成本及多种酶的协同增效，复合酶制剂的添加量以0.2‰为基础进行添加量的优化。

2耐高温复合酶制剂作用效果评估

制备耐高温复合酶制剂，其包括：酶活为10000U/g的耐高温植酸酶、酶活为20000U/g的耐高温木聚糖酶、酶活为1000U/g的耐高温淀粉酶的、酶活为1000U/g 的耐高温葡萄糖氧化酶；分别以0.1‰、0.2‰、0.3‰和0.4‰的添加量将复合酶制剂加入到肉鸡饲料中，作为四组试样，采用与单酶制剂相同的方法评估复合酶制剂的作用效果，结果如表5和表6所示。

表5饲料中不同添加量的耐高温复合酶制剂的酶解效果

表6不同添加量的耐高温复合酶制剂的抑菌圈直径

表5和表6反应了耐高温复合酶在不同添加量下的磷释放率、还原糖增量、抑菌效果，从评估指标结果看，随添加量的增加各评估指标值呈上升趋势，添加量从 0.1‰提升至0.2‰，各指标均大幅提升，但从0.2‰再往上提升，指标值增加不明显，与单因素结果对应。对比表2和表5，复合酶各单酶在磷释放率及还原糖增量上具有协调增效作用，相同添加量比较，复合酶磷释放率提高8.2％-9.19％，玉米豆粕还原糖增量提高0.45-0.7mg/g。对比表3和表6中试验结果，本申请这种采用四种单酶混合得到的复合酶制剂在抑菌作用上较单独使用耐高温葡萄糖氧化酶而言，抑菌圈直径变大，具有更好的抑菌效果，表明植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶对葡萄糖氧化酶的抑菌存在协同增效作用。并且复合酶制剂对于嗜水气单孢菌的抑菌效果大概相当于 0.3-0.75ug环丙沙星的抑菌效果；对于沙门氏菌的抑菌效果大概相当于1.5-3ug环丙沙星的抑菌效果；对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果大概相当于0.75-1.5ug环丙沙星的抑菌效果；对于大肠杆菌的抑菌效果比0.3ug环丙沙星的抑菌效果差；对于广链球菌，抑菌效果大概相当于1.5-3ug环丙沙星的抑菌效果。

综上可知本发明提供的这种复合酶制剂在饲料中的添加量可以为0.1-0.4‰，考虑添加成本及多种酶的协同增效作用，添加量优选为0.2‰。

实施例3：

制备耐高温复合酶制剂，其包括：酶活为10000U/g的耐高温植酸酶、酶活为20000U/g的耐高温木聚糖酶、酶活为1000U/g的耐高温淀粉酶的、酶活为1000U/g 的耐高温葡萄糖氧化酶；将复合酶制剂以0.2‰的添加量加入到肉鸡饲料中，在85℃下制粒30min，采用与实施例2相同的方法评估制粒成品的作用效果，实验结果如表 7所示。

实施例4：

选用与实施例3相同的方法，区别在于饲料在100℃下制粒5min；实验结果如表7所示。

比较例1：

使用与实施例3相同的肉鸡饲料，不添加耐高温复合酶制剂，在85℃下制粒30min，采用与实施例相同的方法评估制粒成品的作用效果，实验结果如表7所示。

表7高温制粒后饲料的作用效果

对比表7和表1可知，本发明提供的这种耐高温复合酶制剂在经过85℃30min 的长时间高温制粒后，植酸酶和木聚糖酶耐温存留率均高于70％，性能优良，并且与表1结果对应，说明该评估方式可体现实际制粒的结果，且该方法简单、成本低。且依旧能促进饲料中磷的释放，增加饲料还原糖含量，适用于需要进行高温制粒的饲料加工行业，与表2中同等添加量下的单酶相比，酶解效果也有显著提升。

综上所述，本发明提供的这种耐高温复合酶制剂，能够耐受85℃保温30min的特殊制粒环境，也能耐受85℃以上甚至100℃极端高温制粒条件，适用于诸如预防非洲猪瘟饲料等需要高温特殊制粒条件的饲料加工行业；能降解饲料中植酸，提高饲料中可利用无机磷含量，减少粪便中磷排放量；可提高饲料中碳水化合物的分解，提高还原糖含量；能够抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、广链球菌等有害菌。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种耐高温复合酶制剂，其特征在于：由耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体组成；其中所述耐高温植酸酶、所述耐高温木聚糖酶、所述耐高温淀粉酶和所述耐高温葡萄糖氧化酶均能耐85-100℃高温制粒，且所述耐高温复合酶制剂在85℃处理30min后能保留65%以上的酶活性，100℃处理5min后能保留40%以上的酶活；所述耐高温植酸酶的质量分数为10%-30%、所述耐高温木聚糖酶的质量分数为10%-30%、所述耐高温淀粉酶的质量分数为10%-30%、所述耐高温葡萄糖氧化酶的质量分数为10%-30%、所述载体的质量分数为0%-30%；所述耐高温植酸酶的酶活为10000 U/g、所述耐高温木聚糖酶的酶活为20000 U/g、所述耐高温淀粉酶的酶活为1000 U/g、所述耐高温葡萄糖氧化酶的酶活为1000 U/g；所述复合酶制剂在饲料中的添加量为0.1-0.4‰。

2.如权利要求1所述的耐高温复合酶制剂，其特征在于：所述复合酶制剂能抑制嗜水气单孢菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和广链球菌。

3.如权利要求1所述的耐高温复合酶制剂，其特征在于：所述载体选自淀粉、麦麸、米糠、石粉中的一种或两种以上。

4.如权利要求1所述的耐高温复合酶制剂，其特征在于：所述复合酶制剂在饲料中的添加量为0.2‰。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的耐高温复合酶制剂在需要高温制粒的饲料加工中的应用。

6.如权利要求1-4中任意一项所述的耐高温复合酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过高温水浴法检测多种不同的植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶和多种葡萄糖氧化酶的单酶制剂的耐温存留率；

（2）选择高留存率组对应的初始单酶制剂或其经过水浴加热后得到的单酶制剂作为复合酶制剂组分中的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶和耐高温葡萄糖氧化酶；

（3）将步骤（2）中得到的耐高温植酸酶、耐高温木聚糖酶、耐高温淀粉酶、耐高温葡萄糖氧化酶和载体按比例混合均匀后，即得到耐高温复合酶制剂。

7.如权利要求6所述的耐高温复合酶制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中水浴法采用的水浴温度为85-100℃，水浴时间为5-30min。