CN113214673A - 基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料、其制备方法及应用 - Google Patents

基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，该膜染料通式结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R1为具有O端或者N端的荧光发色团染料结构；R2选自‑O‑、‑O‑O‑、‑S‑、‑NH‑、‑NHNH‑或‑ONH‑中的至少一种；R3选自
Figure DDA0003017554270000011
或
Figure DDA0003017554270000012
中的至少一种。其用于长滞留细胞膜追踪成像，和/或用于在低浓度下细胞膜的快速精准的成像，和/或用于观察细胞分裂、迁移过程，和/或用于膜标记以区分共培养细胞，和/或用于区分不同细胞的荧光信号、和/或用于细胞的标记和分群，和/或用于传代细胞的追踪。

Description

基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及光化学与生物成像领域，尤其涉及到细胞膜染色技术与应用，具体涉及到基于吡唑啉酮а-H位点可实现低浓度下快速结合型并具有超长滞留时间的一系列细胞膜染料、其制备方法与应用。
背景技术
细胞膜(又称细胞质膜)，是细胞与周围生理环境的生理屏障，主要由构成骨架的磷脂双分子层和嵌于细胞膜内部或表面的蛋白质和细胞膜表面的糖蛋白这三种主要成分构成，其在保障细胞内环境稳定的同时能够与外界环境进行物质、能量与信息的交换。细胞膜已经被证明能够参与多种生物学过程，如细胞迁移、扩散、吞噬以及内吞。此外，标定细胞膜在体外研究中同样具有意义，如观察细胞膜状态，标记细胞边界，以及区分细胞内亚细胞器。因此，实现灵敏的长期的细胞膜的细胞活体成像在体外细胞研究中具有重要的，能够在不影响细胞活性的基础上能够长期观测细胞膜状态和活性。其中，荧光成像技术由于其高灵敏性、低成本、操作便利、生物安全性高被广泛用于细胞及生物研究中的成像技术。
目前膜定位荧光染料主要基于两种机理：1最主要也是目前商业化膜染料的细胞膜定位机理，基于一端亲油一端亲水的长链烷烃染料结构，通过静电吸附作用可嵌入到磷脂双分子层结构；2基于细胞膜上特意表达的标靶蛋白设计的靶向型膜染料。目前市面上用于体外细胞膜标记的荧光染料主要为DiO，DiI等染料以及其他嵌入磷脂双分子层结构，这类染料的主要问题在于膜上滞留时间短、所需浓度高(造成该两亲性结构易在水中聚集)。在使用时该类染料过高的杂色和进入细胞内的杂色会严重干扰对膜结构的持续观察，其只能保证培养并孵育后的短期时间(不超过1h)内较为清晰的成像，显然不能满足更多的需求。而对于基于靶标的膜染料之所以使用受限，主要归因于其高成本，该类染料实现的膜定位往往需要与膜上蛋白特异识别结合，且该类染料需要靶标大分子作为载体，因此合成成本较高，同时特异性蛋白在不同细胞间表达差异性大，因此该类染料在体外应用中受限较高。能否突破其固有的限制，开发低浓度下可以使用且能实现在细胞膜上长期滞留的广泛适用性的膜染料是亟需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明突破目前存在的两种膜染料机理，能够基于保留吡唑啉酮a-H活性位点的系列染料可结合于细胞膜表面糖结构实现普适性的细胞膜长期着色(现有技术中仅能达到1h以内有效，提高到超过2天依旧有效，着色时长相当于提高了近50倍)，该类染料工作浓度低(现有技术中商业膜染料的工作浓度至少需要1000nM，该发明提高到最低10nM依旧可以清晰的识别，相当于检测限降低100倍)且背景杂色低(0.5小时时，商染膜染料DiO在细胞内杂色为该类染料的三倍以上，而2小时时其细胞内杂色为该类染料20倍以上)。该发明从根本上解决了膜染料易进入细胞内，膜上滞留时间短以及因使用浓度高和自身聚集带来的背景杂色问题。同时，该结合型长期滞留膜染料在不影响体外细胞活性的同时，可用于共培养细胞的细胞标记，能够清晰地对不同株细胞的区分，可以避免如Hoechst染料用于区分共培养细胞时的严重串色问题。
本申请的技术方案如下：
本申请的第一方面在于保护一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，该染料能快速结合细胞膜表面糖蛋白，能用于长滞留细胞膜追踪成像以及作为膜标记区分共培养细胞的系列染料结构，通式结构如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003017554250000021
式(Ⅰ)中
R1为具有O端或者N端的荧光发色团染料结构。
n是选自1-9的整数，表示R1和R2以不同长度的烷烃链连接。进一步优选地，在本发明较佳的实施例中，n是选自1-4的整数，表示R1和R2以C1-C4烷烃链连接。
R2选自-O-、-O-O-、-S-、-NH-、-NHNH-或-ONH-中的至少一种。进一步优选地，在本发明实施例中，R2为-NH-。
R3选自
Figure BDA0003017554250000022
中的至少一种。进一步优选地，在本发明实施例中，R3为
Figure BDA0003017554250000023
进一步优选地，R1采用合成简单(不超过3步)且具有较强的摩尔消光系数与荧光量子产率的染料结构，以达到控制成本和增强成像效果。
进一步优选地，在本发明较佳的实施例中，R1选取三种具有不同吸收与发射波段的荧光染料结构，为验证该结构的适用性，三种选取结构的极性、溶解性等性质以及分子量也不相同，分别为：
1萘酰亚胺结构
Figure BDA0003017554250000031
2氟硼二吡咯结构
Figure BDA0003017554250000032
3硫代吩噻嗪结构
Figure BDA0003017554250000033
进一步地，在本发明较佳的实施例中n为2，即R1和R2之间为C2烷烃链时，R1为如下结构：
Figure BDA0003017554250000034
进一步地，在本发明较佳的实施例中n为5，即R1和R2之间为C5烷烃链时，R1为如下结构：
Figure BDA0003017554250000035
本申请的第二方面在于保护一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，包括如下步骤：
1根据不同染料母体合成方法合成染料分子中间体
Figure BDA0003017554250000036
2结构
Figure BDA0003017554250000037
与肼基乙酸乙酯盐酸盐溶于第一有机溶剂，搅拌一定时间后加入第一弱碱，回流条件下搅拌反应一段时间，得到中间体1；
3中间体1溶于第二有机溶剂，向其中加入第一强碱，搅拌反应一段时间后得到中间体2；
4将中间体2溶于第三有机溶剂，低温搅拌下加入第一催化剂与第一缩合剂，间隔一段时间后搅拌下加入不同结构的染料中间体
Figure BDA0003017554250000041
在惰性气体保护下，继续搅拌反应得到目标的系列细胞膜结合型试剂。
进一步地，步骤2中的第一有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸酐中的一种或多种组合。
进一步地，步骤2中的第一弱碱为碳酸钠、碳酸铯、醋酸钠、醋酸钾中的一种或多种组合。
进一步地，步骤3中的第二有机溶剂为DMF、DMSO、四氢呋喃、水中的一种或者多种组合。
进一步地，步骤3中的第一强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或多种组合。
进一步地，步骤4中的第三有机溶剂为DCM、CH3CN和DMF中的一种或多种组合；
进一步地，步骤4中的第一催化剂为DMAP、DIPEA、TMP、HOBt中的一种或多种组合。
进一步地，步骤4中的第一缩合剂为DCC、EDCI、HATU、HBTU中的一种或多种组合。
进一步地，步骤2中回流搅拌时间为12-36h。步骤3中搅拌时间是2-4h。
进一步地，步骤4中加入缩合剂后搅拌时间为0.5-1h。
进一步地，步骤4中加入-NH2结构后的搅拌时间为24-48h。
进一步地，步骤3中的温度为0-5℃，步骤4中的温度为-10-0℃。
进一步地，步骤4中的惰性气体为氮气、氩气中的一种。
本申请的第三方面在于保护一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的应用；所述应用包括该膜染料可以用于长滞留细胞膜追踪成像，甚至达到了免洗条件下可实现1-2天高清的细胞膜荧光标记，和/或用于在低浓度下细胞膜的快速精准的成像，最低染色浓度达到了至10nM，最佳染色浓度达到了100-500nM，和/或用于观察细胞分裂、迁移过程，和/或用于膜标记以区分共培养细胞，和/或用于区分不同细胞的荧光信号、和/或用于细胞的标记和分群，和/或用于传代细胞的追踪。
本发明具有以下有益效果：本发明以a-H活性位点保留的吡唑啉酮结构为出发点，在连接系列染料分子后，可实现与细胞膜上糖结构的快速结合，实现在低浓度下快速精准的细胞膜成像。其中，带氨基的染料分子与带羧基修饰的吡唑啉酮结构可通过成熟的酰胺缩合反应即可得到所需要的产物，本发明的所设计的三例无结构共同性的染料均可以实现膜定位成像效果，因此证明其适用范围广，可根据需求波长设计响应染料，合成成本低，用途性广泛，不限于某几种特殊的细胞，目前在所使用的6种以上肿瘤和非肿瘤细胞中均展现膜定位效果。该结合型染料是通过吡唑啉酮与细胞膜上的糖蛋白和糖酯中的糖结构的醛基发生快速的缩合，该过程不需要任何催化剂与条件，只需在培养箱中培养10-30min即可成功染色，染色浓度限低，10-1000nM均可实现优异的染色效果。此外，本发明所设计染料不仅可用于一般性的细胞膜染色，更是可以利用此长滞留结合效果，用于细胞共培养的鉴别，可事先染色一种细胞，而后清洗后加入第二种细胞，通过清晰的细胞膜成像效果区分两种细胞。该共培养过程使用此类膜染料不会发生不同细胞间的染料分子交换，因而不会发生使用Hoechst染色时严重的细胞串色效果导致难以区分，实现细胞的标记和分群。因此，本发明所研究吡唑啉酮类染料可实现第三种细胞膜染色机理，结合细胞膜表面糖成分，实现快速精准的长期细胞膜成像效果并可用于体外细胞共培养技术的标记染料。
附图说明
图1本发明制备方法的合成图；
图2为实施例1的质谱图；
图3为实施例2的质谱图；
图4为实施例3的质谱图；
图5为对比例1的质谱图；
图6为对比例2的质谱图；
图7为实施例1的吸收发射光谱图；
图8为实施例2的吸收发射光谱图；
图9为实施例3的吸收发射光谱图；
图10为实施例1、2、3在Hepg2的细胞膜染色荧光成像图；
图11为实施例1、2、3的生物安全性实验；
图12为实施例3在不同细胞内的染色；
图13为实施例3与对比例1、2的吸收谱图；
图14为实施例3与对比例1、2的发射谱图；
图15为实施例3与对比例1、2的染色荧光成像图；
图16为实施例3与商染DiO细胞膜成像效果对比；
图17为染色试剂实施例3用于4T1细胞与Hepg2细胞鉴别分群；
图18为DiO用于T1细胞与Hepg2细胞鉴别分群效果图；
图19为Hoechst用于T1细胞与Hepg2细胞鉴别分群效果图；
图20为实施例3用于传代后细胞标记分群效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例或对比例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用仪器或化学、生物试剂未注明者均为可通过市售购买获得的常规产品。本发明实施例中，化学药品均来自安耐吉或阿拉丁化学试剂公司，商业化膜染料DiO、DiI、Hoechst 33342购买自上海碧云天生物技术有限公司，生物耗材胎牛血清、胰酶、DMEM购买自Giboca，所用细胞来自ATCC细胞库。
基于吡唑啉酮结构的快速结合细胞膜表面糖蛋白用于长滞留细胞膜追踪成像以及作为膜标记区分共培养细胞的系列较佳的实施例制备方法如下：
1根据不同染料母体合成方法合成染料分子中间体
Figure BDA0003017554250000061
2结构
Figure BDA0003017554250000062
与肼基乙酸乙酯盐酸盐溶于第一有机溶剂，搅拌一定时间后加入第一弱碱，回流条件下搅拌反应一段时间，得到中间体1；
3中间体1溶于第二有机溶剂，特定温度下向其中加入第一强碱，搅拌反应一段时间后得到中间体2；
4将中间体2溶于第三有机溶剂，低温搅拌下加入第一催化剂与第一缩合剂，间隔一段时间后搅拌下加入不同结构的
Figure BDA0003017554250000063
在惰性气体保护下，继续搅拌反应得到目标的系列细胞膜结合型试剂。
本发明制备方法的合成图如图1，下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
本实施例的基于吡唑啉酮结构的快速结合细胞膜表面糖蛋白用于长滞留细胞膜追踪成像以及作为膜标记区分共培养细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据已有方法合成染料母体分子：
Figure BDA0003017554250000064
(2)合成中间体1：2-(3-甲基-5-酮-4,5-二氢-1H-吡唑啉)乙酸乙酯
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000071
将肼基乙酸乙酯盐酸盐(10mmol)溶解于乙醇中，向其中加入醋酸钠(10mmol)，搅拌30min后，向其中加入乙酰乙酸乙酯(10mmol)，回流条件下，搅拌反应18h后反应结束。通过减压蒸馏除去溶剂后，使用乙酸乙酯(100mL)重新溶解并向其中加入100mL饱和食盐水，分离有机层，并继续用乙酸乙酯(100mLx2)萃取。有机液经无水Na2SO4洗涤后，减压蒸馏除去溶剂。使用硅胶层析柱对粗产物纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1(v/v)，得到白色絮状固体中间体1，产率62％。
(3)合成中间体2：2-(3-甲基-5-酮-4,5-二氢-1H-吡唑啉)乙酸
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000072
将中间体1(5mmol)与5mL水搅拌均匀，冰浴下向其中滴加LiOH(8mmol)水溶液，过夜搅拌后向该溶液中滴加HCl(10mmol)溶液中和，继续搅拌2h至反应结束。低压蒸馏除去水溶剂，该粗产物通过反相液相制备，洗脱液为纯水，得到白色块状固体中间体2，产率90％。
(4)合成基于吡唑啉酮的细胞膜染色实施例1：
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000073
将中间体2(2mmol)溶解于5mL DMF，低温搅拌下向其中加入HATU(2mmol)和TMP(3mmol)，半小时后向其中滴加溶解染料母体1(1mmol)的DMF溶液，反应4h后停止反应。通过减压蒸馏除去溶剂后，使用硅胶层析柱对粗产物纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)，得到白色固体实施例1，产率76％。ESI-MS：C21H21N4O4 +[M+H]+393.03.
本实施例制得的结合型细胞膜染料的质谱如图2所示。
实施例2
和实施例1相同，只有母体染料结构不同，中间体2的结构并未改变，其合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000081
将中间体2(2mmol)溶解于5mL DMF，低温搅拌下向其中加入HATU(2mmol)和TMP(3mmol)，半小时后向其中滴加溶解染料母体2(1mmol)的DMF溶液，反应4h后停止反应。通过减压蒸馏除去溶剂后，使用硅胶层析柱对粗产物纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝6:1(v/v)，得到红色固体实施例1，产率55％。
ESI-HRMS：C31H40 BF2N6O3 +[M+H]+593.3213.
本实施例2制得的结合型细胞膜染料的高分辨质谱如图3所示。
实施例3
和实施例1相同，只有母体染料结构不同，中间体2的结构并未改变，其合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000082
将中间体2(2mmol)溶解于5mL DMF，低温搅拌下向其中加入HATU(2mmol)和TMP(3mmol)，半小时后向其中滴加溶解染料母体3(1mmol)的DMF溶液，反应4h后停止反应。通过减压蒸馏除去溶剂后，使用硅胶层析柱对粗产物纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1(v/v)，得到蓝色固体实施例1，产率83％。ESI-HRMS：N32H39N6O2S+[M]+571.2858.
本实施例3制得的结合型细胞膜染料的高分辨质谱如图4所示。
进一步地，本发明中以实施例3染料结构设计对比例用于验证吡唑啉酮а-H位点独特细胞膜结合能力，结构如(Ⅱ)所示：
Figure BDA0003017554250000083
Figure BDA0003017554250000091
式(Ⅱ)中，
R’为
Figure BDA0003017554250000092
其中对比例1为：
Figure BDA0003017554250000093
对比例2为：
Figure BDA0003017554250000094
下面结合对比例做进一步说明。
对比例1
合成端位结构为氨基结构的对比例1，为证明无吡唑啉酮结构时单独的硫代吩噻嗪结构的染料是否具有细胞膜结合功能，其合成路线如下：
(1)合成2-氨基-5-二乙氨基-苯磺酸：
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000095
将对二乙氨基苯胺(6mmol)与硫酸铝(6mmol)溶于10mL水中，搅拌下向其中加入氯化锌(6mmol)与硫代硫酸钠(12mmol)，冰浴保护，向混合液中加入重铬酸钾(2mmol)，搅拌2h后见沉淀，过滤该反应液，取滤饼，并将其于100mL甲醇中加热回流10min，趁热过滤，得灰白色固体，可直接用于吩噻嗪染料的合成。
(2)合成N-萘基-1,6-己二胺：
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000101
40mL乙二醇单甲醚溶解1-溴奈(20mmol)与1,6-己二胺(20mmol)，搅拌下加入碳酸铯(10mmol)与碘化亚铜(1mmol)，120℃加热回流下，该反应24h后结束。减压蒸馏除去溶剂后，使用硅胶层析柱对粗产物进行提纯，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)，得到淡黄色油状液体产物N-萘基-1,6-己二胺，产率68％。
(3)合成(Z)-6-氨基-N-(9-(二乙氨基)-5H-苯并[a]吩噻嗪-5-亚烷基)己-1-铵
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000102
N-萘基-1,6-己二胺(3mmol)与2-氨基-5-二乙氨基-苯磺酸(3.5mmol)溶解于10mLDMSO中，向反应液中加入重铬酸钾(3.3mmol)，搅拌反应1h后，将该反应液转移至150mL甲醇中，向其中加入2M盐酸(10mL)酸化反应液至蓝色，反应结束。减压蒸馏除去甲醇后，加入20m水和二氯甲烷(100mLx3)分液萃取，使用无水Na2SO4干燥后减压蒸馏除去有机溶剂，使用硅胶层析柱提纯产物，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)，得到蓝色固体的对比例1，产率46％。ESI-HRMS：C26H33N4S+[M]+422.2424.
对比例1的高分辨质谱图如图5所示。
对比例2
合成端位结构为吡唑啉酮a-H封端的对比例2，为证明吡唑啉酮与细胞膜结合位点，封上该位点的染料分子是否具有细胞膜结合功能，其合成路线如下：
(1)中间体2-氨基-5-二乙氨基-苯磺酸的合成与对比例1一致
(2)合成N-(6-溴己基)萘-1-胺
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000103
溶解1-萘胺(10mmol)于20mL乙腈溶剂中,向其中加入1,6-二溴己烷(30mmol)与无水K2CO3(30mmol)。加热回流下搅拌6h，结束反应。减压蒸馏除去乙腈后，向其中加入二氯甲烷溶解，加入100mL水，使用二氯甲烷(100mLx3)进行分液萃取。无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏除去溶剂，使用硅胶层析柱提纯产品，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1(v/v)，得到无色油状液体N-(6-溴己基)萘-1-胺，产率86％。
(3)合成5-甲基-4-(6-(萘-1-基氨基)己基)-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000111
DMF中溶解N-(6-溴己基)萘-1-胺(5mmol)与3-甲基-2-吡唑啉-5-酮(10mmol)，搅拌下加入无水K2CO3，90℃加热下反应4h，反应结束后减压蒸馏除去有机溶剂，通过硅胶层析柱纯化产品，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50:1(v/v)，得到白色固体产品5-甲基-4-(6-(萘-1-基氨基)己基)-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮，产率36％。
(4)合成5-甲基-4-(6-(萘-1-基氨基)己基)-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮
合成路线如下：
Figure BDA0003017554250000112
5-甲基-4-(6-(萘-1-基氨基)己基)-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮(3mmol)与2-氨基-5-二乙氨基-苯磺酸(3.5mmol)溶解于10mL DMSO中，向反应液中加入重铬酸钾(3.3mmol)，搅拌反应1h后，将该反应液转移至150mL甲醇中，向其中加入2M盐酸(10mL)酸化反应液至蓝色，反应结束。减压蒸馏除去甲醇后，加入20m水和二氯甲烷(100mLx3)分液萃取，使用无水Na2SO4干燥后减压蒸馏除去有机溶剂，使用硅胶层析柱提纯产物，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)，得到蓝色固体的对比例2，产率37％。
ESI-MS:C30H36N5OS+[M]+514.04.
对比例2的高分辨质谱图如图6所示。
实施例与对比例的吸收与发射光谱
制备细胞膜结合型染色试剂实施例1、2、3以及对比例1、2的3mM起始母液，测试这些样品在甲醇溶剂中浓度为10μM时候的吸收与发射光谱。三个实施例选取不同染料母体，跨越不同染色波长，如图7所示，实施例1的最大吸收为325nm，最大发射为380nm。如图8所示，实施例2的最大吸收在500nm，最大发射则为515nm处。如图9所示，实施例3的最大吸收在660nm，最大发射在700nm。作为对比，对比例1、2的吸收与发射谱图与实施例3无明显差异，如图13和14所示，因为其染料母体结构处没有变动，不会显著影响其吸收与发射。
实施例的细胞膜成像效果
将不同细胞培养于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中贴壁培养，培养基为10％的血清、1％双抗的DMEM高糖。将细胞消化并种养在35mm的培养皿中，经12h生长细胞贴壁完成，加入细胞膜染色试剂实施例或不具细胞膜染色能力的对比例至浓度为100nM，半小时培养后，使用PBS洗涤后于共聚焦荧光显微镜下成像。如图10所示，为三个实施例在Hepg2细胞的细胞膜成像效果图,结果显示三例实施例对细胞膜具有良好的定位效果，证明该吡唑啉酮结构修饰于不同的荧光染料结构时可以实现细胞膜的特异性染色。图12为实施例3在不同细胞中的细胞膜成像效果图，选用多种肿瘤或非肿瘤细胞于体外培养，选用实施例3对其进行染色并洗涤，实验结果表明实施例3能对所有选择的细胞进行无差别细胞膜染色，证明该染料能够通过细胞膜表面的糖蛋白与吡唑啉酮结合的方式实现无特异性的细胞膜染色。
MTT生物安全性实验
将细胞培养于96孔板，经过12h培养后达到约70％密度，向每孔细胞中加入不同浓度梯度的三例实施例药物，浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04μM。经过另12h孵育，倒出96孔板中的含药物的培养基，并向其中加入含MTT培养液，4h后吸出液体并加入DMSO，使用酶标仪测试其吸光度，用于表征分子对细胞杀伤力。如图11为三个实施例对Hepg2细胞进行生物毒性测试，结果表明该三种分子分别不同浓度培养下对细胞具有较好的生物安全性，证明该类染色结合的方式不会对体外细胞的生命活性造成影响。
对比例成像效果验证结合位点
图15为实施例3与对比例的细胞内染色位置对比，结果显示只有实施例3表现为细胞膜定位，而对于对比例1,2而言，直接的氨基端或封闭a-H的吡唑啉酮结构的两种吩噻嗪染料都不具有细胞膜定位功能，证明本发明设计的细胞膜染料实现细胞膜定位的位点为吡唑啉酮结构的a-H位点。图16为实施例3与商业染料DiO细胞膜长期染色效果对比，通过对比分析，说明该类糖蛋白结合类的细胞膜染料能够实现长期细胞膜滞留成像及追踪能力，商业染料往往只能保持在半小时内的膜成像特异性，本发明设计的染料至少为24小时(仅用该类染料染色细胞可保持2-3天后依旧成功着色，并且无细胞内杂色)。
细胞鉴别分群实验
首先于35mm培养皿中培养Hepg2细胞至密度约20％后，使用实施例2或者3制备的染料对其进行染色处理，半小时后洗涤并更换培养基。同时将需要共同培养的4T1细胞直接种植到该培养皿中，12小时后通过激光共聚焦显微镜观察细胞的区分情况。如图17所示，Hepg2细胞展示明显的细胞膜染色轮廓，而4T1细胞则几乎没有荧光出现在细胞内或细胞膜上，通过细胞膜上的荧光信号可直接鉴别共培养过程中的标记细胞，因此可用于细胞共培养的区分。相比而言，一般的膜染料如DiO在应用于细胞分群时染料在细胞间流动，如图18所示，不同细胞都展示了荧光信号，无法进行区分。以前所使用的方法中，如Hoechst也被用于细胞共培养中的标记，但其分辨效果不明显，如图19所示，该核染料也会进入其他细胞中导致差异性非常小，难以区分。此外，除了该种标记方式，对标记染色并传代1代或者2代后，该染料依旧可以实现对共培养细胞的区分，如图20所示，Hepg2细胞标记并经传代1次(约24小时)和2次(约48小时)后，依然能与后培养的4T1细胞进行显著的区分，实现细胞的标记与分群功能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (17)

1.一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，该染料的通式结构如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003017554240000011
式(Ⅰ)中
R1为具有O端或者N端的荧光发色团染料结构；
R2选自-O-、-O-O-、-S-、-NH-、-NHNH-或-ONH-中的至少一种；
R1和R2分别以不同长度的烷烃链连接；
n是选自1-9的整数；
R3选自
Figure FDA0003017554240000012
中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，所述n是选自1-4的整数，R1和R2分别以C1-C4烷烃链连接。
3.根据权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，所述R1采用具有较强的摩尔消光系数与荧光量子产率的染料结构。
4.根据权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，所述R1选自下述结构中的一种：
Figure FDA0003017554240000013
5.根据权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，所述n为2，即R1和R2之间为C2烷烃链时，R1选自如下结构：
Figure FDA0003017554240000021
6.根据权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，其特征在于，所述n为5，R1和R2之间为C5烷烃链时，R1为如下结构：
Figure FDA0003017554240000022
7.如权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据不同染料母体合成方法合成染料分子中间体
Figure FDA0003017554240000023
(2)结构
Figure FDA0003017554240000024
与肼基乙酸乙酯盐酸盐溶于第一有机溶剂，搅拌一定时间后加入第一弱碱，回流条件下搅拌反应一段时间，得到中间体1；
(3)中间体1溶于第二有机溶剂，向其中加入第一强碱，搅拌反应一段时间后得到中间体2；
(4)将中间体2溶于第三有机溶剂，低温搅拌下加入第一催化剂与第一缩合剂，间隔一段时间后搅拌下加入不同结构的染料中间体
Figure FDA0003017554240000025
在惰性气体保护下，继续搅拌反应得到目标的系列细胞膜结合型试剂。
8.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的第一有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸酐中的一种或多种组合。
9.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的第一弱碱选自碳酸钠、碳酸铯、醋酸钠、醋酸钾中的一种或多种组合。
10.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的第二有机溶剂选自DMF、DMSO、四氢呋喃、水中的一种或者多种组合。
11.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的第一强碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或多种组合。
12.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的第三有机溶剂选自DCM、CH3CN和DMF中的一种或多种组合。
13.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中第一催化剂选自DMAP、DIPEA、TMP、HOBt中的一种或多种组合。
14.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的第一缩合剂为DCC、EDCI、HATU、HBTU中的一种或多种组合。
15.根据权利要求7所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中回流搅拌时间为12-36h；步骤(3)中搅拌时间是2-4h；步骤(4)中加入缩合剂后搅拌时间为0.5-1h，以及加入-NH2结构后的搅拌时间为24-48h；步骤(3)中的温度为0-5℃，步骤(4)中的温度为-10-0℃。
16.如权利要求1所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的应用。
17.根据权利要求18所述的基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料的应用，其特征在于：所述应用包括该膜染料用于长滞留细胞膜追踪成像，和/或用于在低浓度下细胞膜的快速精准的成像，和/或用于观察细胞分裂、迁移过程，和/或用于膜标记以区分共培养细胞，和/或用于区分不同细胞的荧光信号、和/或用于细胞的标记和分群，和/或用于传代细胞的追踪。
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