CN113197912A - 异戊酰螺旋霉素类化合物及其组合物在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异戊酰螺旋霉素类化合物及其组合物在制备抗病毒药物中的应用，尤其是在制备抗肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、艾滋病毒感染药物中的应用，进一步包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备抗肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、艾滋病毒感染药物中的应用。本发明提供了现有药物的新用途，也为治疗肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、艾滋病毒感染导致的疾病提供了有效的方法，具有经济效益和社会效益。

Description

异戊酰螺旋霉素类化合物及其组合物在制备抗病毒药物中的 应用
技术领域
本发明属于抗生素领域，具体地说，涉及异戊酰螺旋霉素类化合物及其组合物在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
病毒感染(viral infection)是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。病毒只能在细胞内进行繁殖，完全依赖于机体细胞提供合成和能量，具有严格的细胞寄生性。病毒感染对人类的生命健康造成了极大的危害。
肠道病毒颗粒小，呈20面体，直径24～30nm，不含类脂体，核心有单链核糖核酸，耐乙醚和其它脂溶剂，耐酸，对各种抗生素、抗病毒药、去污剂有抵抗作用。肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和在人类肠道致细胞病变的孤儿病毒(ECHO病毒)。在上述已命名的3种肠道病毒的67个型别以后发现的肠道病毒，都按肠道病毒序数编号命名，即68、69、70、71、72型肠道病毒等。肠道病毒属病毒引起的传染病，临床表现轻者只有倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。
疱疹病毒(herpes viruses)是一类有包膜、基因组为双链DNA的病毒。目前总共发现了100多种，可以分为α、β、γ三大类(亚科)。其感染宿主广泛，主要侵害皮肤、黏膜以及神经组织，严重影响着人及其他动物的健康。
流行性感冒病毒简称流感病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来才发现的流感病毒将归为丁(D)型。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。这些疫病典型的临床症状是急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。流感病毒主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。
人类免疫缺陷病毒又称艾滋病病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒。这一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，致使宿主在被感染时得不到保护。感染人类免疫缺陷病毒并且去世的人，往往死于继发感染或者癌症。而艾滋病是人类免疫缺陷病毒感染的最后阶段。
不论是肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒，或者是艾滋病毒，都需要发展更多有效的方法来抑制病毒感染，保护人体生命健康安全。
可利霉素(Carrimycin)，又称必特螺旋霉素(Bitespiramycin)、生技霉素(Shengjimycin)是由中国医科院生物技术研究所与本申请人合作，通过转基因技术将碳霉素产生菌的4”异戊酰基转移酶基团(4”-o-acyl-transferase)克隆至螺旋霉素产生菌中，定向酰化螺旋霉素4”-OH，在4”位加入异戊酰基侧链所形成的以4”位异戊酰基螺旋霉素为主要组分的新型抗生素。
Figure BDA0002924876960000021
可利霉素是由多种螺旋霉素衍生物组成，主要活性成分异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含量不低于60％，酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，于药学上是一种可接受的药物组合物。中心结构为16元内酯环，与一分子福洛胺糖、一分子碳霉胺糖和一分子碳霉糖连接而成，其主要成分异戊酰螺旋霉素Ⅰ、II、III与螺旋霉素结构不同之处在于碳霉糖4”位上连接的基团为异戊酰基而不是羟基。化学结构，如式(1)所示，共包含十余种组分。目前可利霉素成品组成标准为异戊酰螺旋霉素Ⅲ≥30％，异戊酰螺旋霉素Ⅰ、II、III的比例总和≥60％，总酰化螺旋霉素的比例≥80％，其它未知组分的总和≤5％。
可利霉素属于16元大环内酯类抗生素，具有活性基团羧基、烷氧基、环氧基、酮基和醛基以及一对共轭的C＝C，分子量约为884～982。可利霉素易溶于酯类、丙酮、氯仿、醇类等大多数有机溶剂，微溶于石油醚，难溶于水；分子结构中含有两个二甲胺基而呈弱碱性，易溶于酸性水溶液；具有溶解度随温度的升高而降低的“负溶解度”性质。由于可利霉素主要组分异戊酰螺旋霉素4”位碳链较长，亲水性差，其水中溶解度比螺旋霉素及4”-乙酰螺旋霉素小。
初步体内外药效学试验表明，该药不仅对多数G+菌有较好抗菌活性，对部分G-菌也有一定作用，各项技术指标明显优于阿奇霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素，尤其对肺炎支原体的抗菌活性最强，对红霉素耐药菌、淋球菌、肺炎球菌、金葡菌、绿脓假单胞菌、流感杆菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、军团菌、多行杆菌和产气荚膜梭菌也有一定抗菌活性，对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性。可利霉素目前主要用于治疗革兰氏阳性菌感染性疾病，尤其是上呼吸道感染，并可能用于泌尿系统感染等。
目前已有的现有技术中都未见异戊酰螺旋霉素化合物及其组合物可以抑制流感病毒、肠道病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒的报道。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种异戊酰螺旋霉素类化合物及其组合物在制备抗病毒药物中的应用，尤其是在制备抗肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、艾滋病毒感染药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗或预防肠道病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防肠道病毒感染的药物中的应用；
优选的，所述肠道病毒包括肠道病毒68型、肠道病毒69型、肠道病毒70型、肠道病毒71型或肠道病毒72型；
优选的，所述肠道病毒为肠道病毒71型。
进一步的方案，所述治疗或预防肠道病毒感染的药物包括第一药物活性成分和第二药物活性成分，所述第一药物活性成分包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合；所述第二药物活性成分选自抗病毒药物、增强免疫力药物。
第一药物活性成分和第二药物活性成分可以为单独制剂，也可以是复配为一种制剂。
本发明的第二目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗疱疹病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用；
优选的，所述疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus，VZV)，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)，人类疱疹病毒6型(HHV-6)，人类疱疹病毒7型(HHV-7)和卡波济肉瘤相关病毒；
优选的，所述疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型。
进一步的方案，所述治疗疱疹病毒感染的药物包括第一药物活性成分和第二药物活性成分，所述第一药物活性成分包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合；所述第二药物活性成分选自抗病毒药物、增强免疫力药物。
第一药物活性成分和第二药物活性成分可以为单独制剂，也可以是复配为一种制剂。
本发明的第三目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或其组合；
优选的，所述流感病毒为甲型流感病毒；
更优选的，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、甲型H3N2流感病毒。
进一步的方案，所述治疗或预防流感病毒感染的药物包括第一药物活性成分和第二药物活性成分，所述第一药物活性成分包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合；所述第二药物活性成分选自抗病毒药物、增强免疫力药物。
第一药物活性成分和第二药物活性成分可以为单独制剂，也可以是复配为一种制剂。
本发明的第四目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。
进一步的方案，所述艾滋病病毒包括艾滋病病毒HIV-1型、艾滋病病毒HIV-2型。
优选的，包括艾滋病病毒HIV-1IIIB。
进一步的方案，所述治疗艾滋病病毒感染的药物包括第一药物活性成分和第二药物活性成分，所述第一药物活性成分包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合；所述第二药物活性成分选自抗病毒药物、增强免疫力药物。
第一药物活性成分和第二药物活性成分可以为单独制剂，也可以是复配为一种制剂。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明提供了异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备抗肠道病毒、疱疹病毒、流感病毒、艾滋病毒感染药物中的应用，发现了现有药物的新用途，也为治疗以上病毒感染导致的疾病提供了有效的方法，具有经济效益和社会效益。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1可利霉素抗肠道病毒71型(EV71)
测试原理：以Vero(非洲绿猴肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起Vero细胞病变程度。
测试材料和方法：
1、病毒株：肠道病毒71型H07株(EV71)，由ATCC提供。
2、样品处理：样品(可利霉素)临用前DMSO配成母液，检测时用RPMI 1640培养液稀释成一定浓度后再作3倍稀释，共8个稀释度。
3、阳性对照药：利巴韦林(RBV)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)，以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：将Vero细胞接种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，24小时后每孔感染肠道病毒71型10-5，吸附2小时，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％CO2，37℃培养箱培养。待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度(TC50)和对病毒的半数抑制浓度(IC50)。测试结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002924876960000061
注：
(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，可利霉素对肠道病毒71型(EV71)有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
实施例2可利霉素抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)
测试原理：以Vero(非洲绿猴肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制单纯疱疹病毒1型引起Vero细胞病变程度。
测试材料和方法：
1、病毒株：HSV-1F株(VR733)，由ATCC提供。
2、样品处理：样品临用前DMSO配成母液，检测时用RPMI 1640培养液稀释成一定浓度后再作3倍稀释，共8个稀释度。
3、阳性对照药：无环鸟苷(ACV)，由湖北科益制药厂生产，以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：Vero细胞种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，24小时后每孔加入疱疹病毒1型10-4，吸附2小时，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对单纯疱疹病毒1型的半数抑制浓度(IC50)。
测试结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002924876960000071
注：
(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，可利霉素对单纯疱疹病毒1型有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
实施例3可利霉素抗甲型H1N1流感病毒
测试原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。
测试材料和方法：
1、病毒株：流感病毒A/FM/1/47(H1N1)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2018.3)，-80℃保存。
2、样品处理：样品临用前DMSO配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
3、阳性对照药：利巴韦林(RBV)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。磷酸奥司他韦，上海罗氏制药有限公司分装(批号SH0071)。分别以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，置5％CO2，37℃培养。24小时后每孔感染流感病毒1/2 10-5，吸附2小时，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％CO2，37℃培养。待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度(TC50)和对病毒的半数抑制浓度(IC50)。
测试结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002924876960000081
注：(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，所检测的样品，可利霉素对流感病毒A/FM/1/47有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
实施例4可利霉素抗甲型H5N1流感病毒
测试原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。
测试材料和方法：
1、病毒株：禽流感病毒A/Duck/Jiangsu/Sheyang/2004(H5N1)病毒株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离鉴定并保存，上述试验均在扬州大学动物生物安全三级实验室完成。
2、样品处理：样品临用前DMSO配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
3、阳性对照药：利巴韦林注射液(国药准字H19993157)，江苏涟水制药有限公司(批号19022581)。磷酸奥司他韦，上海蓝木化工有限公司(批号S2597)。分别以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，置5％CO2，37℃培养。24小时后每孔感染100TCID50流感病毒，吸附1小时后弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％CO2，37℃培养。待病毒对照组病变程度(CPE)达3+以上时采用血凝试验检测每孔的病毒滴度。按Reed-Muench计算50％抑制病毒复制的浓度(IC50)和治疗指数(SI)，SI＝TC50/IC50。血凝试验方法与判定标准参照WHO流感病毒诊断标准进行。
测试结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002924876960000091
注：
(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，所检测的样品，可利霉素对禽流感病毒A/Duck/Jiangsu/Sheyang/2004(H5N1)有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
实施例5可利霉素抗甲型H7N9流感病毒
测试原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。
测试材料和方法：
1、病毒株：禽流感病毒A/Duck/Jiangsu/Sheyang/2004(H5N1)病毒株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离鉴定并保存，上述试验均在扬州大学动物生物安全三级实验室完成。
2、样品处理：样品临用前DMSO配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
3、阳性对照药：利巴韦林注射液(国药准字H19993157)，江苏涟水制药有限公司(批号19022581)。磷酸奥司他韦，上海蓝木化工有限公司(批号S2597)。分别以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，置5％CO2，37℃培养。24小时后每孔感染100TCID50流感病毒，吸附1小时后弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％CO2，37℃培养。待病毒对照组病变程度(CPE)达3+以上时采用血凝试验检测每孔的病毒滴度。按Reed-Muench计算50％抑制病毒复制的浓度(IC50)和治疗指数(SI)，SI＝TC50/IC50。血凝试验方法与判定标准参照WHO流感病毒诊断标准进行。
测试结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002924876960000101
注：
(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，所检测的样品，可利霉素对禽流感病毒A/Duck/Jiangsu/Sheyang/2004(H5N1)有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
实施例6可利霉素抗甲型H3N2流感病毒
测试原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。
测试材料和方法：
1、病毒株：流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2018.3)，-80℃保存。
2、样品处理：样品临用前用DMSO配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
3、阳性对照药：利巴韦林(RBV)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。磷酸奥司他韦，上海罗氏制药有限公司分装(批号SH0071)。分别以RPMI 1640培养液为溶剂，过滤除菌，备用。
4、病毒抑制作用测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板，每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，置5％CO2，37℃培养。24小时后每孔感染流感病毒1/3 10-5，吸附2小时，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％CO2，37℃培养。待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度(TC50)和对病毒的半数抑制浓度(IC50)。
测试结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002924876960000111
注：
(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
结论：
本次试验条件下，所检测的样品中，可利霉素对流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)有一定的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信。
需要说明的是，实施例1-实施例6中，细胞毒性的检测方法包括：在96孔平底板上，分别将各样品用培养基进行3倍梯度稀释，然后每孔加入100ul的4×105/ml的细胞悬液，然后每孔用完全培养基调至终体积200u1，同时设置正常细胞的对照孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。第三天将96孔细胞培养板1500rpm离心后，移去150ul的培养上清，然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时，然后每孔加入100ul的20％SDS-50％DMF，37℃孵育过夜，用酶标仪(测定波长为595nm，参考波长为655nm)读数，计算其细胞存活率，再以Reed-Muench法进一步计算其CC50(50％cytotoxic concentration)值，即样品对50％细胞产生毒性的浓度。
实施例7可利霉素抗HIV-1病毒
一、实验材料
1、对照物和待测样品
待测样品为可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ，均由沈阳同联集团有限公司生产。待测样品均溶于DMSO中，样品储液浓度为50mM，储存条件为-20℃。
阳性对照化合物叠氮胸苷(AZT)购自Sigama公司，以RPMI 1640为溶剂，过滤除菌，分装后-20℃保存。
2、试剂和溶液
RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)，含有10％的小牛血清(Invitrogen公司)，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，50mM 2-巯基乙醇，100u/ml的青、链霉素，过滤除菌，-20℃保存；
MTT(四甲基偶氮唑盐)，以PBS缓冲液配成5mg/ml的溶液，过滤除菌，4℃冰箱保存；
十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)购自BBI公司，以N，N'-二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamine，DMF)和水为溶剂，配成20％SDS-50％DMF溶液，调节pH4.7。
3、实验用病毒和细胞
C8166细胞和H9细胞为T淋巴细胞系，由英国Medical Research Council(MRC)，AIDSReagent Project惠赠。细胞均按常规方法复苏、培养、传代和冻存，每次实验均采用处于对数生长期的细胞。
病毒H9/HIV1IIIB，也由英国MRC惠赠，按常规方法复苏，培养，收集，分装和冻存。
4、仪器
生物安全柜、二氧化碳培养箱、96孔培养板、倒置显微镜、灭菌锅、高速冷冻离心机。
二、试验方法
(一)细胞和病毒的准备
1、细胞培养
H9、C8166细胞均按常规方法复苏、培养、传代和冻存。每次实验均采用处于对数生长期的细胞。
2、病毒的培养和收集
复苏H9/HIV-1IIIB细胞，低速离心，用RPM1-1640完全培养基调整细胞浓度至4×105/ml，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每三天补加等量未感染的处于对数生长期的H9细胞。一定时间后，低速离心，收集培养上清，分装于冻存管中，-70℃冻存。
3、病毒感染性的滴定
在96孔板上，用完全培养基将HIV-1IIIB上清液4倍比稀释，做9个梯度，每个梯度设置6孔，同时设正常细胞对照。每孔加入50μl(含4×104的C8166细胞)的RPM1-1640完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，第三天每孔补加完全培养基100μl。第七天观察每孔的病毒诱导的细胞病变作用，以每孔是否有合胞体的形成确定；根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50值。
(二)待测试样品在体外对HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用
原理：合胞体诱导型的HIV株(Syncytium Induced，SI)可以诱导感染的C8166细胞之间相互融合，形成巨细胞融合体，即合胞体，其体积比未融合的细胞大5倍左右，在显微镜下可以明显的观察到。基于此原理的合胞体形成抑制法是一种比较灵敏的检测方法，容易判断待测样品有无抗HIV作用。
具体方法如下：
在96孔平底板上，分别将各样品用培养基进行5倍梯度稀释，共设8个稀释度，每个梯度设2个重复孔，每孔加入4×104个C8166细胞，然后每孔加入25μl(1200TCID50)的HIV-1IIIB上清液，每孔的终体积为200μl。同时设置正常细胞的阴性对照、不加药物的病毒阳性对照以及AZT药物对照；置于37℃、5％CO2培养箱中培养。感染72小时后在倒置显微镜下，计数HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数目，并以下列公式计算其合胞体形成抑制率:
Figure BDA0002924876960000131
进一步以Reed-Muench法计算其EC50值(50％effective concentration)，即样品抑制50％合胞体形成时的浓度。
(三)待测样品在体外对C8166细胞的毒性作用
采用MTT比色法检测细胞毒性，具体方法如下：
在96孔平底板上，分别将各样品用培养基进行5倍梯度稀释，然后每孔加入100ul的4×105/ml的C8166细胞悬液，即每孔加入4×104的细胞，然后每孔用完全培养基调至终体积200u1，同时设置正常细胞的对照孔，37℃、5％CO2培养箱中培养。第三天将96孔细胞培养板1500rpm离心后，移去150ul的培养上清，然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时，然后每孔加入100ul的20％SDS-50％DMF，37℃孵育过夜，用酶标仪(测定波长为595nm，参考波长为655nm)读数，以下列公式计算其细胞存活率:
Figure BDA0002924876960000132
以Reed-Muench法进一步计算其CC50(50％cytotoxic concentration)值，即样品对50％细胞产生毒性的浓度。根据EC50和CC50值计算其治疗指数(TI，therapeutic index)，计算公式为：TI＝CC50/EC50。
三、实验结果
1、根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50值，得到的病毒滴度为4.0×105TCID50。合胞体形成数量的多少与病毒感染之间为剂量依赖关系。
2、采用上述体外对HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制试验方法和对C8166细胞的毒性试验方法，分别对阳性对照品AZT和待测的样品(可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素Ⅲ)进行测定，结果如下表所示。
表7
Figure BDA0002924876960000133
Figure BDA0002924876960000141
上表中，CC50为样品抑制50％C8166细胞生长的样品浓度；EC50为抑制50％C8166细胞被病毒感染导致细胞病变的样品浓度；TI＝CC50/EC50。
由表7中结果可以看出，可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素Ⅲ对C8166细胞的毒性较小，CC50越大代表毒性越小，且对HIV-1IIIB病毒均有一定的抑制作用，其中，可利霉素和异戊酰螺旋霉素Ⅰ的抑制效果较好。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗或预防肠道病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防肠道病毒感染的药物中的应用；
优选的，所述肠道病毒包括肠道病毒68型、肠道病毒69型、肠道病毒70型、肠道病毒71型或肠道病毒72型；
优选的，所述肠道病毒为肠道病毒71型。
3.异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗疱疹病毒感染的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用；
优选的，所述疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型，单纯疱疹病毒2型，水痘-带状疱疹病毒，EB病毒，人类巨细胞病毒，人类疱疹病毒6型，人类疱疹病毒7型和卡波济肉瘤相关病毒；
优选的，所述疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型。
5.异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或其组合；
优选的，所述流感病毒为甲型流感病毒；
更优选的，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、甲型H3N2流感病毒。
8.异戊酰螺旋霉素类化合物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中两种或三种的组合在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述艾滋病病毒包括艾滋病病毒HIV-1型、艾滋病病毒HIV-2型；
优选的，包括艾滋病病毒HIV-1IIIB。
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