CN113197861B - Cpul1脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域,涉及CPUL1脂质体及其制备方法；CPUL1脂质体，其特征在于，其包含胆固醇，磷脂和CPUL1，其中胆固醇与磷脂的质量之比为1:1‑1:10，CPUL1与磷脂的质量之比为1:1‑1:30；CPUL1（吩嗪类化合物）是一种水溶性很差的一类化合物，其限制在药学方面应用，因此需要采用不同方法进行增溶。本发明将其制备成脂质体，获得脂质体冻干制剂，该冻干制剂在冻干前后其粒径范围和包封率都差异不大，可以用于下一步的研究与开发。

Description

CPUL1脂质体及其制备方法
技术领域:
本发明属于医药技术领域,涉及新吩嗪类化合物CPUL1脂质体冻干粉及其制备方法,该制备方法不仅能够很好地解决CPUL1难溶解的问题，且为CPUL1脂质体的储存和运输问题提供了可行的解决办法。
背景技术:
CPUL1：吩嗪类化合物是一类具有氧化还原活性的微生物次生代谢产物，它们有较多的生物活性，包括抗菌、抗疟疾、抗癌等。自从1956年发现吩嗪具有抗肿瘤作用以来，科研工作者已发现100种吩嗪天然产物和合成6000种以上的吩嗪产物，其中大多数化合物具有抗肿瘤的活性。我们也从北极海洋假单胞菌中，分离得到了一系列吩嗪类化合物，其中新化合物CPUL1在体内外具有较好的抑制肿瘤细胞生长作用,我们的研究已初步证实2-氨基吩嗪类化合物具有抗肿瘤的活性。
Figure GDA0003501384250000011
脂质体(liposomes)是一种具有类似于生物膜结构的分子小囊，因为它的组成结构和细胞生物膜相似，所以容易与细胞发生吸附、融合、脂交换、内吞，从而被细胞摄取和被细胞膜融合，最后将药物送入细胞内部。大量的实验证据表明，脂质体作为药物的载体，具有可以提高药物的治疗指数、降低药物的毒性、减少毒副作用、具有靶向性、可以缓释长效从而减少药物剂量、具有和脂质体细胞的亲和性和与组织相容性等特点。
脂质体在体外容易被氧化渗漏，不能很好地贮存，又存在稳定性差等缺点。为了使脂质体和被其包封的药物能在常温条件下长期稳定地贮存，我们采用了冷冻干燥技术。冷冻干燥技术可以使脂质体以固态的形式贮存，只需在临用前加入分散介质摇匀，再分散形成液态脂质体即可。这种方法不但解决脂质体稳定性的问题，而且便于运输，最重要的是适合工业化生产。冷冻干燥技术可以大大的提高药物制剂长期贮存的稳定性。
CPUL1具有的难溶解的特点影响了其疗效，而制成CPUL1脂质体后，药物包裹在双分子层内，可以增加药物的溶解度，延长药物在体内的循环时间，提高对肿瘤的靶向性，从而提高其抗肿瘤作用。
发明内容:
本发明提供一种CPUL1脂质体冻干粉及其制备方法。制备工艺可以除菌除热源，设备简单，利于放大，易于工业化生产，提高药物溶解度和稳定性，更易于储存和运输。
制备工艺如下：
称取磷脂、胆固醇及CPUL1溶解于适量有机溶剂，加入活性炭过滤除热源。在一定温度和搅拌的条件下，向该有机溶液中加入水溶性载体，在减压条件下除去有机溶剂。随后加入适量水化介质进行水化，在一定温度条件下搅拌使其充分水化。将得到的脂质体溶液经外力作用处理降低粒径，并依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除菌整粒。加入冻干保护剂进行冷冻干燥，制成CPUL1脂质体冻干粉。
其中，有机溶剂可以为乙醇、甲醇、叔丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿中的一种或几种。
水溶性载体可以为氯化钠，糖类物质，如：蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等中的一种或几种。
水化介质可以为蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水等。
冻干保护剂可以为蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等中的一种或几种。
外力作用可以为探头超声、高压匀质机等。
胆固醇与磷脂的质量之比为1:1-1:10，优选1:4-1:8。其中磷脂可以是大豆磷脂、蛋黄磷脂、心磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化磷脂等中的一种或几种。
药物与磷脂的质量之比为1:1-1:30，优选1:12-1:24。
水溶性载体的用量为10％-30％，优选10％-20％(g/mL)。
冻干保护剂的加入量为5％-20％，优选10％-15％(g/mL)。
工艺优化过程：
1.在低于或高于本专利保护范围时，可以形成空白脂质体，但粒径大于注射剂小于100nm的要求；进行载药时，则无法形成脂质体。
Figure GDA0003501384250000021
Baseline Index为基线水平，样品测量评分，满分10分。评分≥5分时，实验结果可信。评分为0分时，实验结果不可信。
Figure GDA0003501384250000022
2.设计三因素三水平正交试验
Figure GDA0003501384250000031
试验结果：
Figure GDA0003501384250000032
试验结果显示：
(1)A2B3C1组，即：胆固醇：磷脂质量比为1:5，药物：磷脂质量比为1:24，水溶性载体为10％，可以形成符合要求的载药脂质体。其粒径小于100nm，符合注射剂要求；包封率为88.31％，大于80％，包封率良好，基本实现发明目的。
(2)胆固醇：磷脂小于1:5时，无法形成脂质体，说明合适的胆固醇、磷脂质量之比是形成脂质体的基础。
(3)胆固醇：磷脂为1:5时，药物：磷脂小于或大于1:24时，形成的粒径均大于100nm，且包封率均小于80％，无法满足制备要求，说明药物与磷脂合适的质量之比是提高包封率的关键。
(4)胆固醇：磷脂大于1:5时，虽能形成脂质体，但粒径均大于100nm，且包封率均小于80％，无法完全满足最佳制备要求。
3.按照A2B3C1中的比例进行制备脂质体并进行冻干，对冻干保护剂的用量进行考察。
Figure GDA0003501384250000041
试验结果显示：
(1)冻干保护剂用量在10％-20％时，冻干效果最佳，冻干后的脂质体平整、饱满，无塌陷、空泡、破碎等问题。
(2)冻干保护剂用量小于10％-20％时，冻干效果较差，出现空泡、塌陷等问题，且复溶后溶液浊度较高。
(3)冻干保护剂用量大于10％-20％时，冻干后的脂质体虽平整、光滑，但复溶后仍见轻微浑浊。
综上，胆固醇:磷脂质量比为1:5，药物:磷脂质量比为1:24，水溶性载体用量为10％，冻干保护剂加入量为10％-20％为最佳制备条件，基本实现发明目的。
有益效果：
1、CPUL1(吩嗪类化合物)是一种水溶性很差的一类化合物，其限制在药学方面应用，因此需要采用不同方法进行增溶。本发明将其制备成脂质体，获得脂质体冻干制剂，该冻干制剂在冻干前后其粒径范围和包封率都差异不大，可以用于下一步的研究与开发。
附图说明
图1为实施例1制备获得的脂质体电镜图，A为1μm，B为0.5μm，C为0.2μm。
具体实施方式:
下面将结合本发明具体实施对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)将120g大豆磷脂、24g胆固醇及5g CPUL1溶解于1000mL的无水乙醇中，加入1％活性炭过滤除热源。
2)在40℃和搅拌下，向该有机溶液中加入水溶性载体，在减压条件下除去无水乙醇。
3)随后加入1000mL蒸馏水进行水化，在40℃和搅拌下使其充分水化。
4)将得到的脂质体溶液经外力作用处理降低粒径，并依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除菌整粒。
5)加入100g海藻糖作为冻干保护剂进行冷冻干燥，制成CPUL1脂质体冻干粉。
实施例2
1)将240g大豆磷脂、48g胆固醇及10g CPUL1溶解于1000mL的无水乙醇中，加入1％活性炭过滤除热源。
2)在40℃和搅拌下，向该有机溶液中加入水溶性载体，在减压条件下除去无水乙醇。
3)随后加入1000mL蒸馏水进行水化，在40℃和搅拌下使其充分水化。
4)将得到的脂质体溶液经外力作用处理降低粒径，并依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除菌整粒。
5)加入100g蔗糖作为冻干保护剂进行冷冻干燥，制成CPUL1脂质体冻干粉。
CPUL1-L包封率的测定：
精取0.1mL CPUL1脂质体于10.0mL量瓶中，加1.2mL PBS(pH＝7.4)用体积分数为90％异丙醇溶液(含0.75mol·L-1HCl)溶解，稀释至刻度，定容，摇匀，480nm波长下测定吸光度A0。另精取0.1mL CPUL1脂质体，置于葡聚糖凝胶柱顶端，2000r·min-1离心3min。再于柱顶端加入400μL PBS(pH＝7.4)，2000r·min-1离心3min，重复两次，合并洗脱液。将洗脱液转移至10.0mL量瓶中，用体积分数为90％异丙醇溶液(含0.75mol·L-1HCl)溶解，稀释至刻度，定容，摇匀，测吸光度A1，计算包封率。
CPUL1脂质体冻干前后粒径和包封率的测定
将实施例1中的CPUL1脂质体冻干粉使用注射用生理盐水复溶，测定其冻干前后的粒径、包封率、电位和PDI的变化，结果显示，冻干前后脂质体的各项指标均表现稳定，CPUL1脂质体冻干粉稳定性良好。
表1 CPUL1脂质体冻干前后粒径的比较
Figure GDA0003501384250000051
表2 CPUL1脂质体冻干前后包封率的比较
Figure GDA0003501384250000052
Figure GDA0003501384250000061
表3 CPUL1脂质体电位测定
Figure GDA0003501384250000062
表4 CPUL1脂质体冻干前后PDI的比较
Figure GDA0003501384250000063
以上对本发明实施例所提供的CPUL1脂质体冻干粉及其制备方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.CPUL1脂质体，其特征在于，其包含胆固醇，磷脂和CPUL1，其中胆固醇与磷脂的质量之比为1:1-1:5，CPUL1与磷脂的质量之比为1:1-1:24；
Figure 571997DEST_PATH_IMAGE002
；
还包括冻干保护剂和水溶性载体；水溶性载体为氯化钠，蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种；磷脂是大豆磷脂、蛋黄磷脂、心磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化磷脂中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的CPUL1脂质体，其特征在于按溶于1000mL水中计，水溶性载体的用量为10%-30% g/mL；冻干保护剂的加入量为5%-20% g/mL。
3.根据权利要求2所述的CPUL1脂质体，其特征在于按溶于1000mL水中计，120g大豆磷脂、24g胆固醇、5g CPUL1，水溶性载体用量为100g，冻干保护剂加入量为100-200g。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的CPUL1脂质体的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现：
称取磷脂、胆固醇及CPUL1溶解于有机溶剂；搅拌加入水溶性载体，除去有机溶剂；随后加入水化介质搅拌使其水化；将得到的脂质体溶液进行外力作用处理后，加入冻干保护剂进行冷冻干燥，制成CPUL1脂质体冻干粉。
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