CN113181376A - Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用 - Google Patents

Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。Htra2基因表达抑制剂用于预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。本发明还提供了一种用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向并敲除Htra2基因。本发明证实AAV‑CRISPR/Cas9‑Htra2基因编辑体系内耳显微注射可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。

Description

Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。
背景技术
衰老、噪声、感染及耳毒性药物是引起人类后天获得性感音神经性聋的主要原因，但治疗手段十分有限。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)已被应用于多项临床实验，并已经获得批准应用于临床，对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，能感染处于有丝分裂后期的细胞，具有安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、物理性质稳定、表达时间长及稳定等优点。多项研究表明AAV是目前感音神经性耳聋基因治疗的首选载体。对于获得性非遗传性感音神经性聋，已有利用AAV作为载体导入外源性过表达基因或RNA干扰(RNAinterference，RNAi)体系进行治疗的研究报道。这类技术有其相应的优势和局限性。
AAV介导的过表达策略可能需要多次给药以维持治疗效果，诱发临床相关免疫反应，并有引起外源性基因异位过表达的风险。RNAi是一种常用的基因失活工具，它的主要缺陷在于会引起序列特异性的脱靶效应。这样的脱靶效应很难预测，因为siRNA能够影响与它部分互补的序列，像microRNA那样抑制基因的表达。
规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas system)中的CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，依靠简单的向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)实现靶DNA序列识别，可以通过对sgRNA进行简单修改完成不同基因的靶向编辑，该系统目前已成功应用于多种生物的基因组编辑，极大地促进了功能基因研究。CRISPR/Cas9系统已经应用于肿瘤及艾滋病的治疗研究，并取得了良好的实验结果。虽然CRISPR/Cas9技术已在遗传性聋基因治疗领域取得了令人瞩目的研究成果，但目前尚未有将该技术应用于防治获得性非遗传性感音神经性聋的研究。
在抑制基因表达效率方面，RNAi是在转录后水平降低基因表达，而CRISPR/Cas9则可以靶向DNA并改变或敲除基因表达。CRISPR/Cas9系统的靶向精确性更高，sgRNA靶向序列必须和基因组序列完全匹配，Cas9蛋白才会对DNA进行剪切。shRNA或sgRNA均可靶向互补序列，可能造成依赖序列的脱靶效应。但是，RNAi还表现出不依赖序列的脱靶活性。两者相比，由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用，其脱靶效率要远低于RNAi。
氨基糖甙类抗生素(Aminoglycosides，AGs)所致耳毒性聋是获得性非遗传性感音神经性聋的典型代表且有成熟的动物模型可用于研究。AGs由于其成本低、高效对抗革兰氏阴性细菌、耐药性低而广泛应用于临床，但是，AGs耳毒性会导致内耳感觉毛细胞的死亡，影响前庭觉和/或听觉。对于需要多疗程静脉用药的病人(例如，结核病和囊性纤维化病患者)来说，耳毒性的发病率更高，甚至超过50％。
Htra2基因所编码的Omi/HtrA2蛋白是一种具有凋亡调节功能的蛋白酶，具有促进细胞凋亡的作用。以往的研究表明Omi/HtrA2通过抑制XIAP的功能促进了caspase-3的活化，导致细胞凋亡的发生。目前尚未发现调控Htra2基因拮抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的研究。
发明内容
本发明的目的是提供Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用，Htra2基因表达抑制剂用于敲除或抑制Htra2基因表达。
为了达到上述目的，本发明提供的Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用中，优选地，所述的Htra2基因表达抑制剂用于预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。
优选地，所述的氨基糖甙类抗生素包括新霉素。
本发明还提供了一种用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向并敲除Htra2基因。
优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过AAV递送。
优选地，所述的Cas9选择SpCas9或SaCas9。
优选地，所述的基因编辑系统包括特异性靶向小鼠Htra2基因的gRNA，其序列选自SEQ ID NO：1、2、3或6。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。
(2)本发明证实AAV-CRISPR/Cas9-Htra2基因编辑体系内耳显微注射可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋，支持将CRISPR/Cas9基因编辑技术进一步应用于获得性非遗传性聋的治疗研究
附图说明
图1为实施例1根据小鼠Htra2基因序列设计的CRISPR/SpCas9治疗体系的构建结果图。
图2是AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系在新生鼠出生后1天(P1)内耳显微注射、新霉素损伤造模及后续各实验指标的检测时间点流程图，以及AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系内耳显微注射后14天的三种gRNA的体内编辑效率检测结果。
图3是实施例2根据小鼠Htra2基因序列设计的AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系的构建结果图。
图4是AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系在新生鼠出生后1天(P1)内耳显微注射、新霉素损伤造模及后续各实验指标的检测时间点流程图，以及AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系内耳显微注射后14天的体内编辑效率检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
以下通过构建针对Htra2基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，并用AAV包装该系统后导入活体新生小鼠内耳，说明其对氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋的保护作用。CRISPR/Cas9基因编辑系统可对Htra2基因进行基因编辑，以敲除Htra2基因。
实施例1
SpCas9系统对氨基糖甙类耳毒性聋的预防作用。
1、设计AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系。
图1是实施例1根据小鼠Htra2基因序列设计的CRISPR/SpCas9治疗体系的构建结果图。gRNA设计图(图1中的a图)显示了三种gRNA的靶向序列，分别为
Sp-g1：GCCTAGCGGGGATACTTATG(SEQ ID NO：1)；
Sp-g2：CTGCAGAACACGATCACATC(SEQ ID NO：2)；
Sp-g3：CGCGATGCAGAAACTCCCTA(SEQ ID NO：3)。
图1中的b图是三种gRNA的体外编辑效率结果；图1中的c图是三种gRNA引起整码(In-frame)和移码(Frameshift)突变的比例。
图1中的a图还示出了PAM(protospacer adjacent motif)。CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列，这个短的DNA序列通常在靶DNA的3'末端作用，被称为protospacer adjacentmotif(PAM)。
2、在新生小鼠P1通过显微注射的方式将AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系导入内耳中阶，注射后10天即P11开始新霉素(Neomycin)损伤，200mg/kg皮下注射连续损伤7天至P17，在小鼠4周龄、6周龄及10周龄测试听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)，比较注射耳与未注射耳的听力情况。
3、部分内耳注射治疗体系的小鼠在4周龄测试ABR后施行安乐死，取双侧耳蜗，通过免疫荧光染色并在激光共聚焦显微镜下拍照，比较注射耳与未注射耳的耳蜗毛细胞存活情况。
4、编辑效率检测，方法为：P1内耳显微注射AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系，P7取小鼠双侧耳蜗，在体外培养7天，相当于P14时将培养的Corti氏器用胰蛋白酶消化，通过流式分选收集带绿色荧光的细胞并提取基因组DNA，进行深度测序，分析测序结果得到编辑效率，未注射耳作为对照。
图2中的a图是AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系在新生鼠出生后1天(P1)内耳显微注射、新霉素损伤造模及后续各实验指标的检测时间点流程图。图2中的b图是AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系内耳显微注射后14天的三种gRNA的体内编辑效率检测结果。
通过P1小鼠内耳注射AAV-CRISPR/SpCas9治疗体系，P11至P17连续7天皮下注射新霉素造模，并在小鼠4周龄、6周龄以及10周龄测试ABR，且在4周龄取耳蜗做免疫荧光化学染色，比较注射耳与未注射耳的听力情况及毛细胞存活情况，研究结果发现AAV-CRISPR/SpCas9系统可明显促进耳蜗中、底圈毛细胞的存活。注射耳蜗中圈及底圈每100μm感觉上皮区的毛细胞计数结果分别为48.5±6.2及13.3±1.0个，而未注射耳蜗的计数结果为22.5±6.2及10.5±1.3个。ABR测试结果显示注射AAV-CRISPR/SpCas9体系4周后，注射耳的ABR阈值在8、16、24和32kHz比未注射耳明显下降，平均阈值下降9–16dB，最好的阈值改善达到40dB，且治疗效果持续至小鼠10周龄(实验观察期)。
实施例2
SaCas9系统对氨基糖甙类耳毒性聋的预防作用。
1、设计AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系。
图3是实施例2根据小鼠Htra2基因序列设计的AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系的构建结果图。图3中的a图是gRNA设计图，图中显示了三种gRNA的靶向序列；分别为
Sa-g1：GGAGCCCTGGAAGCCGTCGGC(SEQ ID NO：4)；
Sa-g2：AGGCACCTGGGCCGGGAGACT(SEQ ID NO：5)；
Sa-g3：GCAGATCTGACGTCTAGGACC(SEQ ID NO：6)。序列末端为PAM。
图3中的b图是三种gRNA的体外编辑效率结果，选取编辑效率最高的Sa-g3进行后续的体内实验。
2、在新生小鼠P1通过显微注射的方式将AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系导入内耳中阶，注射后10天即P11开始新霉素损伤，200mg/kg皮下注射连续损伤7天至P17，在小鼠4周龄测试ABR，比较注射耳与未注射耳的听力情况。
3、部分内耳注射治疗体系的小鼠在4周龄测试ABR后施行安乐死，取双侧耳蜗，通过免疫荧光染色并在激光共聚焦显微镜下拍照，比较注射耳与未注射耳的耳蜗毛细胞存活情况。
4、编辑效率检测，方法为：P1内耳显微注射AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系，P7取小鼠双侧耳蜗，在体外培养7天，相当于P14时将培养的Corti氏器提取基因组DNA，进行深度测序，分析测序结果得到编辑效率，未注射耳作为对照。
图4的a图是AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系在新生鼠出生后1天(P1)内耳显微注射、新霉素损伤造模及后续各实验指标的检测时间点流程图。图4的b图是AAV-CRISPR/SaCas9治疗体系内耳显微注射后14天的体内编辑效率检测结果。
结果表明，小鼠4周龄的耳蜗免疫荧光化学染色结果显示AAV-CRISPR/SaCas9系统可明显促进耳蜗中、底圈毛细胞的存活。4周龄注射耳的ABR阈值在测试的所有频率(4、8、16、24和32kHz)均比未注射耳明显下降，平均阈值下降10–20dB。在小鼠6周龄，保护效果仍十分明显，最好的阈值改善达到50dB。
在研究观察期内，AAV-CRISPR/SpCas9及SaCas9体系对野生型小鼠的听觉功能均无明显影响，说明该治疗体系内耳显微注射是安全的。
综上，本发明证实AAV-CRISPR/Cas9-Htra2基因编辑体系内耳显微注射可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋，支持将CRISPR/Cas9基因编辑技术进一步应用于获得性非遗传性聋的治疗研究。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
<120> Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctagcggg gatacttatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcagaaca cgatcacatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcgatgcag aaactcccta 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagccctgg aagccgtcgg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcacctgg gccgggagac t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagatctga cgtctaggac c 21

Claims (7)

1.Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。
2.根据权利要求1所述的Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用，其特征在于，所述的Htra2基因表达抑制剂用于预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。
3.根据权利要求1所述的Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用，其特征在于，所述的氨基糖甙类抗生素包括新霉素。
4.一种用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向并敲除Htra2基因。
5.根据权利要求4所述的用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过AAV递送。
6.根据权利要求4所述的用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的Cas9选择SpCas9或SaCas9。
7.根据权利要求4所述的用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的基因编辑系统包括特异性靶向小鼠Htra2基因的gRNA，其序列选自SEQID NO：1、2、3或6。
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