JP6962912B2 - 治療用核酸のデリバリによる眼障害の治療のためのデバイスおよび方法 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された、米国仮出願番号６２／２４９１４３の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

（分野）
本開示のいくつかの実施形態は、一般的に、眼の治療のシステムに関連し、より具体的には、治療用核酸のデリバリによる眼障害の治療のためのシステム、デバイス、および方法に関連する。

（関連技術の説明）
多くの眼障害は治癒不可能なままであるため、このような障害を治療する技術のシステムの発展は重要である。例えば、緑内障は、網膜神経節細胞およびそれらの軸索を破壊して、視力喪失を引き起こす眼障害である。増加した産生または房水の流出の減少のいずれかによる眼内圧の上昇は、緑内障に関連する。眼内圧の上昇は、例えば、異常な線維柱体網の損傷、または他の原因の中で、虹彩の傷害や病気による網状組織の損傷などにより引き起こされる。

一般的に、医師は、点眼剤、投薬、手術などの眼障害の治療を支援するために、様々な戦術を採用している。しかしながら、点眼薬および／または治療薬を使用する患者は、いくつかの望ましくないおよび／または意図しない不快感、または他の副作用を経験することがある。加えて、手術をしても、医師は眼の疾病を効率的にコントロールできないことがある。典型的な手術の後、患者は、眼圧が高すぎたり低すぎたり、炎症、不快感、および／または瘢痕などのいくつかの合併症やリスクに直面することもある。多くの慢性眼障害では、治療は、異常な遺伝子またはタンパク質などの要因に起因する基礎的な病因を戻すのではなく、障害の進行を阻止することのみを求める。

眼内圧上昇に伴うおよび／または引き起こされる眼障害の治療の必要性において、本明細書では、眼内圧を生理学的（または生理学的に近い）レベルに規制するための種々の方法、デバイス、システムおよびキットが提供される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの正電極が配備されている第１のアーチ状の筐体、少なくとも１つの負電極が配備されている第２のアーチ状の筐体を含む電解を生成し印加するデバイスが提供される。いくつかの実施形態では、前記第１および第２のアーチ状の筐体は、所望の寸法の卵形を生じるように互いに調整が可能であり、前記所望の寸法は、対象の眼の外面の形状に一致する。

いくつかの実施形態では、前記第１および第２のアーチ状の筐体は、複数の正電極または複数の負電極を含む。いくつかの実施形態では、特定の眼の標的組織の電場を印加する間に作動される前記複数の正電極および負電極のパーセンテージに関連するユーザ入力を受け取るように構成される、制御モジュールをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記複数の正電極および前記複数の負電極は、数が等しい。

いくつかの実施形態では、高まった眼内圧を治療するための眼の特定の標的組織へと治療薬をデリバリする注射システムを含む。いくつかの実施形態では、前記注射システムは、前記対象の眼の前房に治療剤をデリバリするように構成される第１のシリンジ、および前記対象の眼の前房から房水を引き抜くように構成される第２のシリンジを含む。実施形態に応じて、シリンジを使用する必要はなく、治療薬のデリバリに好適な他のデバイスを使用することができる（例えば、治療薬源および圧力または慣性源に流体連通されて、治療薬をデリバリさせるニードルまたは他の注射デバイス）。

いくつかの実施形態では、前記前房の眼圧を評価するように構成される、１またはそれ以上の圧力変換器を含む。いくつかの実施形態では、前記治療剤のデリバリの体積、濃度、速度、頻度、または圧力のうち１つまたは複数を、前記評価された眼圧に基づき選択する、制御モジュールまたは他のロジックを含む。

いくつかの実施形態では、デバイスは、対象とする前記眼の繊維柱帯網に焦点を当てて電場を印加するように構成される。追加の実施形態では、前記デバイスは、前記対象とする眼の毛様体に焦点を当てて電界を印加するように構成される。

いくつかの実施形態では、前記眼の標的組織は、線維柱帯網であり、前記電場は、１００ｍＶと１００Ｖとの間の電圧で印加され、前記電場は、１パルスと２０パルスの間でパルス出力され、前記パルスは、１パルス当たり０．５ミリ秒と１０ミリ秒の間の持続時間で印加され、前記パルスは、約２０ミリ秒から１５０ミリ秒の間の間隔で隔てられている。

いくつかの実施形態では、デバイスは、前記治療剤を約１０から１０００マイクロリットルの体積、かつ１ミリリットル当たり核酸約１０マイクログラムから１ミリリットル当たり５０００マイクログラムの間の濃度でデリバリするように構成される。

いくつかの実施形態では、引き抜かれた房水の体積は、デリバリされる治療剤の体積に等しく、房水の引き抜きは、治療剤のデリバリの前に実施される。しかし、追加の実施形態では、引き抜かれた房水の体積は、デリバリされた治療剤の量よりも多くなるか少なくなり得る。同様に、治療剤のデリバリおよび房水の引き抜きは、交互のセグメント（例えば、デリバリ、引き抜きなど）を含む、任意の順序で行うことができる。さらに、房水の引き抜きは、治療剤のデリバリとは異なる部位にあり、以前にデリバリされた治療剤の引き抜きを、低減または排除することができる。

いくつかの実施形態では、前記デバイスは、１分当たり約０．１マイクロリットルと１分間当たり約１００マイクロリットルの間の速度で、前記治療剤をデリバリするように構成される。いくつかの実施形態では、前記デバイスは、水銀柱における約１０と約４０ｍｍの間の圧力で、前記治療剤をデリバリするように構成される。

いくつかの実施形態では、前記デバイスは、特定の眼標的組織への治療剤のデリバリを可能にするように構成され、前記治療剤は、プラスミドを含む。いくつかの実施形態では、前記治療剤は、リジルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）、ＣＹＰ１Ｂ１、ミオシリン、ＴＧＦ―ベータ潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）、プロスタグランジンＦ合成酵素、 Ｃ３転移酵素、カルデスモンまたはそれらのバリアントをコードする、ポリヌクレオチドを含む。

また、本明細書では、いくつかの実施形態では、眼圧の上昇の治療のための、本明細書に記述される実施形態に関するデバイスの使用を提供する。

いくつかの実施形態では、緑内障に罹患し、眼内圧の上昇を示すかまたはそのリスクを有する対象の眼の眼圧を評価すること、
デリバリ・デバイスを前記対象の眼の前房内に導入すること、および
前記評価された眼圧に基づき治療遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを含むプラスミドを含む、治療剤を前記前房にデリバリすること
を含む、緑内障を治療する方法を提供する。

実施形態に応じて、前記治療剤のデリバリの体積、濃度、速度、頻度、または圧力のうち１つまたは複数は、前記評価された眼圧に基づき、任意的に選択される。いくつかの実施形態では、前記治療剤は、約１０から１０００マイクロリットルの体積でデリバリされる。しかしながら、いくつかの実施形態では、前記治療剤を前前記前房でデリバリする前に、記対象の眼の前記前房からある体積の流体を除去することをさらに含む。実施形態に応じて、前記除去およびデリバリは、２回と１０回の間、（例えば、約５から８回）実施される。このような実施形態では、 眼の中の流体を繰り返し除去し、プラスミドＤＮＡを含む溶液を体積で置換すると、前記前房に存在するプラスミドＤＮＡの量が増加する。ゆえに、プラスミドＤＮＡ（および治療剤）の最大量は、デリバリされることができる。

いくつかの実施形態では、前記治療剤の濃度は、１ミリリットル当たり核酸約１０マイクログラムから５０００マイクログラムである。実施形態に応じて、治療剤のデリバリの速度は変化するが、一般的には、１分当たり約０．１マイクロリットルと、１分当たり約１００ミリリットルの間である。デリバリの頻度も変化するが（例えば、眼障害の状態および／または強度にもよる）、いくつかの実施形態では、デリバリの頻度は、４週間毎に１回と２年毎に１回の間である。もう一度、障害の状況および／または強度は制御できるが、いくつかの実施形態では、前記治療剤は、水銀柱における約１０と約４０ｍｍの間の圧力でデリバリされる。いくつかの実施形態では、前記デリバリ（および／または引き抜き）に圧力測定が行われ（任意にリアルタイムで）、前記前房の圧力は、所望の圧力窓内に維持される。

実施形態によると、前記治療剤は、リジルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）、ＣＹＰ１Ｂ１、ミオシリン、ＴＧＦ―ベータ潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、プロスタグランジンＦ合成酵素、Ｃ３転移酵素、 カルデスモンまたはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含み得る。直接的または間接的に、眼内圧および／または排液に影響する、他の遺伝子も使用され得る。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、誘導性プロモーターまたは他の調節可能なプロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、前記治療剤は、前記前房に手動的にデリバリされる。いくつかの実施形態では、前記治療剤は、前記前房に半手動的にデリバリされる。いくつかの実施形態では、前記治療剤は、前記前房に自動的にデリバリされる。

いくつかの実施形態では、眼内組織の少なくとも一部分にわたって焦点を合わせた電場を発生し印加することをさらに含む方法。いくつかの実施形態では、前記眼内組織は、線維柱帯網である。いくつかの実施形態では、前記眼内組織は、前記毛様体である。いくつかの実施形態では、前記焦点を合わせた電場の印加は、エクストロポーション装置の使用によって達成され、前記エクストロポーション装置は、少なくとも１つの正電極および少なくとも１つの負電極を含む。いくつかの実施形態では、前記エクストロポーション装置は、複数の正電極および複数の負電力を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の正電極は、前記対象の眼の外側の湾曲を模すような形状を取るアーチ状の筐体に配備され、前記複数の負電極は、前記対象の眼の反対側の外側の湾曲（または反対側ではない他の部分）を模すような形状を取るアーチ状の筐体に配置される。任意的に、前記複数の正電極および負電極は、数が等しい。いくつかの実施形態では、前記複数の正電極および前記複数の負電極のパーセンテージの作動を制御する制御モジュールを用いる。一実施形態では、前記眼内の組織は、線維柱帯網であり、前記電場は１パルスと２０パルスの間を用いて１００ｍＶと１００ Ｖの間の電圧で印加され、 前記パルスは、１パルス当たり０．５ミリ秒と１０ミリ秒の間の持続時間に印加され、前記パルスは約２０ミリ秒から１５０ミリ秒の間の間隔で隔てられている。

本明細書は、眼標的組織の電場を生成し印場し、複数の正電極に位置する第１アーチ状の筐体、複数の負電極に位置する第２アーチ状の筐体を含むデバイスをも提供し、前記第１および第２アーチ状の筐体は、所望の寸法の卵型を生じるように互いに調整が可能であり、前記所望の寸法は、対象の眼の外面の形状に一致する。

いくつかの実施形態では、前記デバイスは、対照の眼の線維柱体網に焦点を合わせた電場を印加するように構成される。他の眼組織は、例えば、毛様体も標的にされ得る。

一実施形態では、前記複数の正電極および前記複数の負電極は、数が等しい。

いくつかの実施形態では、前記デバイスは、特定の眼の標的組織の電場を印加する間に動作される、記複数の正電極および負電極のパーセンテージに関連するユーザ入力を受け取るように構成される、制御モジュールをも含む。いくつかの実施形態では、前記デバイスは、治療剤を灌流するように構成される第１シリンジおよび房水を引き抜くように構成される第２シリンジを含む、注射システムも含む。いくつかの実施形態では、前記デバイスは、前記眼の眼内圧を検出するように構成される、圧力変換器をも含む。

実施形態は、複数のシリンジ、プラスミドＤＮＡをデリバリするように構成される針、針および複数のシリンジを接続するための管、および複数のプランジャを含む、注射システムをも提供する。いくつかの実施形態では、複数のシリンジは、止めコックが、前記複数のシリンジのそれぞれの中にあることをさらに含む。いくつかの実施形態では、それぞれの止めコックは、ボタンをさらに含む。

一実施形態では、前記複数のプランジャは、第１のプランジャおよび第２のプランジャを含み、前記第１のプランジャは、前記複数のシリンジの第１シリンジに結合され、前記第２のプランジャは、前記複数のシリンジの第２のシリンジに結合される。

実施形態によると、前記複数のプランジャおよび／または止めコックは、手動で操作されるか、半自動的に操作されるか、または自動的に操作される。

いくつかの実施形態では、前記複数のシリンジは、流体を標的空間にデリバリするように構成される第１のシリンジ、および標的空間から流体を引き抜くように構成される第二のシリンジを含む。そのような一実施形態では、前記デリバリ・シリンジは、一度に約２５０マイクロリットルまでの流体をデリバリするように構成される。追加の実施形態では、前記引き抜きシリンジは、一度に約２５０マイクロリットルまでの流体を引き抜くように構成される。いくつかの実施形態では、前記システムは、流体を引き抜いてはプラスミドＤＮＡをデリバリすることを交互に繰り返すように構成される。

いくつかの実施形態は、前記変換機筐体の外面に連結されているディスプレイ、圧力変換器、および 振動板を含む変換器筐体をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記圧力変換機の筐体は、脱着可能である。任意的に、前記圧力変換器の筐体は、ジャックをさらに含み、前記ジャックは、コントローラに接続されるように構成され、ポンプに接続されるように構成され、増幅器に接続されるように構成されるか、またはそれらの（アナログまたはデジタル）コンビネーションに接続されるように構成される。

本明細書は、目的の遺伝子を含むプラスミド、生体適合性を有し、前記プラスミドを溶解するように構成され、それによって、前記プラスミドを注射によるデリバリに適するものとする、緩衝液、注射デバイス、および使用説明書を含む、標的組織へプラスミドＤＮＡをデリバリするためのキットも提供する。いくつかの実施形態では、前記プラスミドは治療遺伝子を含み、前記治療遺伝子は、リジルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）、ＣＹＰ１Ｂ１、ミオシリン、ＴＧＦ―ベータ潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）、プロスタグランジンＦ合成酵素、Ｃ３転移酵素、カルデスモン、またはそれらのバリアント、切り詰め、ミュータント、または断片からなる群より任意的に、選択される。いくつかの実施形態では、前記治療遺伝子は、眼圧への治療的変化を直接的または間接的に促進する遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミドは、レポーター因子をさらに含む。追加の実施形態では、前記プラスミドは誘導因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記注射デバイスは、注射シリンジ、引き抜きシリンジ、前記注射シリンジおよび引き抜きシリンジと流体連通している管、前記管と流体連通している針、および前記管と流体連通している圧力変換器を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、前記標的組織に電場を印加するように構成されるエクストロポーション装置をさらに含む。任意的に、前記キットは、複数の追加のプラスミドＤＮＡをもさらに含み、前記追加のプラスミドＤＮＡは、異なる治療遺伝子を任意選択的に含むか、異なる量のプラスミドＤＮＡを任意選択的に含むか、同じ治療遺伝子の異なる起点を任意選択的に含むか、異なる誘導因子を任意的に含むか、または異なるプロモーターを任意選択的に含む。

本明細書は、眼圧の上昇を治療または予防するための治療遺伝子を含み、前記プラスミドＤＮＡは、眼圧の上昇を有するか、その傾向がある対象の眼の前房にデリバリされるように構成され、前記プラスミドＤＮＡのデリバリは、線維柱帯網および毛様体などの、前記眼の組織における前記治療遺伝子の発現を誘導するように構成される、プラスミドＤＮＡの使用をも提供する。本使用のデバイスおよびシステムも本明細書に記載され、デバイスおよび／またはシステムの機能のコンビネーションは、眼圧の上昇を治療または予防する治療遺伝子を含む、プラスミドＤＮＡの特定の使用を適用することができる。

前述した、および他の特徴、本発明の実施形態の態様および利点は、ここに開示される発明を限定するものではなく、例示することを目的とし、様々な実施形態の図面を参照して以下に詳細に説明される。本図面は、以下の図を含む：

図１は、眼の断面側面図を示す。

図２Ａ〜２Ｂは、眼の概略図であり、開放角（２Ａ）および虹彩と角膜（２Ｂ）との間の閉じた角度での逆向きの流れを示す。

図３は、注射システムの実施形態を含む、眼の断面側面図を示す。

図４は、注射システムおよび帯電したプローブの実施形態を含む、眼の断面側面図を示す。

図５は、エレクトロポレーションシステムの実施形態を含む、眼の断面側面図を示す。

図６Ａは、エレクトロポーションシステムの実施形態の側面概略図である。

図６Ｂは、エレクトロポレーションシステムの実施形態の上面概略図である。

図７Ａ〜７Ｃは、エレクトロポレーションシステムの実施形態を、眼の前眼房に配置する方法を示す、フローチャートである。

図８は、注射システムの実施形態を示す概略図である。

図９Ａは、注射システムの実施形態の上面図を示す概略図である。

図９Ｂは、注射システムの実施形態の下面図を示す概略図である。

図１０は、注射システムとポンプとの間の接続の実施形態の概略図である。

図１１は、エレクトロポレーションシステムの実施形態の上面概略図である。

図１２は、眼の断面側面図およびエレクトロポレーションシステムの配置を示す。

図１３は、２ピース手動システムのための、医療処置の実施形態を示すフローチャートである。

図１４は、ワンピース半手動システムのための、医療処置の実施形態を示すフローチャートである。

図１５は、ワンピース自動システムのための、医療処置の実施形態を示すフローチャートである。

図１６は、ＧＦＰを発現する単一のＴＭ細胞の、実施形態の画像である。

図１７Ａ〜１７Ｃは、免疫組織化学の実施形態を示す。

図１８Ａ〜１８Ｂは、線維柱体網（Ａ）の細胞でのＤｓＲｅｄ２プラスミド媒介発現を示す一方、ｉｎ ｖｉｖｏでの前房デリバリ後のプラスミド（Ｂ）なしの媒体のみを受容する対照組織では発現しないことを示す図である。

図１９は、ミクロフィブリル上の弾性繊維重合の実施形態の概略図である。

図２０Ａ〜２０Ｃは、エラスチンリッチなＴＭの実施形態を示す。

図２１Ａ〜２１Ｂは、流体力学的灌流後およびエレクトロポレーション後のＴＭにおける、プラスミドＤＮＡの発現レベルを示す。

図２２Ａ〜２２Ｃは、線維柱体網（ＴＭ）および毛様体（ＣＢ）のｉｎ ｖｉｖｏ ＥＧＦＰプラスミド媒介トランスフェクションを示す。２２Ａ：対照眼、媒体のみを受容する。２２Ｂ：治療された眼、レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ；緑色発現）を有するプラスミドを受容する。２２Ｃ：サイトゾルＥＧＦＰ発現を有するＴＭ中の単一細胞の詳細。矢線：ＴＭ。 矢頭：ＣＢ。

図２３は、ＬＯＸＬ１および、トロポエラスチンがＷＴマウスＴＭにコローカライズする実施形態を示す。

図２４Ａ〜２４Ｂは、ＬＯＸＬ１発現に関する実験データを示す。２４Ａは、ｐＤＮＡ灌流後の、ＬＯＸＬ１マウスＴＭにおける原線維を欠如したエラスチン凝集体の間でのトランスジェニックＬＯＸＬ１発現の実施形態を示す。２４Ｂは、ＷＴ陰性対照マウスにおける、線維性エラスチンの実施形態を示す。

図２５は、ＬＯＸＬ１マウスにおけるＩＯＰの実施形態を比較するグラフである。

図２６Ａ〜２６Ｂは、ヒト眼組織へのプラスミドＤＮＡのデリバリを評価するための灌流チャンバー装置を示す。

図２７Ａ〜２７Ｄは、ヒトＴＭにおけるｐＤＮＡ発現の実施形態を示す。

発明の詳細な説明

いくつかの実施形態を通じて、実施例および図解を以下に開示する。 本明細書に記載された本発明は、当業者により具体的に開示された実施形態、実施例および図解を超えて拡張され、本発明の他の用途およびその明白な改変および等価物を含むことが理解されるであろう。本発明の実施形態は、添付の図面を参照して説明され、同様の参照番号は同様の要素を参照する。本明細書に提示された説明で使用される用語は、単に本発明の特定の明細書の実施形態の詳細な説明と併せて使用されているので、制限的または限定的に解釈されることを意図するものではない。加えて、本発明の実施形態は、いくつかの新規的な特徴を含み、単一の特徴がその望ましい属性を単独で担うものではなく、また、本明細書に記載された本発明を実施するために不可欠なものである。

本明細書の開示は、上述した障害の治療を効率的に制御する能力を劇的に改善する、治療用核酸のデリバリによる眼障害の治療のための方法、システム、およびデバイスを提供する。眼障害を治療するための従来のシステムでは、眼の前房に薬剤および／または医薬を供給することができるが、薬剤および／または医薬の投与量を、効果的に制御することはできない。加えて、眼の液体の流出の滴定は、典型的には不完全である。本明細書の開示は、眼内圧上昇を効果的に防止または制御する、実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、眼障害の治療の方法、システムおよびデバイスは、治療を通して圧力を加えることができ、および／または規模を適用することができる。

従来の眼障害の治療システムでは、医師は、導入されたプラスミド、薬物および／または他の医薬の標的位置を、効率的に制御することができない場合がある。本明細書の開示は、導入されたプラスミド、薬物、および／または他の医薬の流れを、眼の前房を横切って、線維柱体網のような生理学的流出空間に影響を与える実施形態を提供する。眼障害を治療するための従来のシステムは、眼圧が高すぎたり低すぎたり、炎症、不快感、および／または瘢痕化などのいくつかの合併症およびリスクを結果としてもたらす場合がある。本明細書では、治療剤のデリバリ、量および標的化を効果的に制御することによって、合併症のリスクを低減する実施形態が提供される。

外科手術のような、眼障害疾患を治療するための従来のシステムでは、膀胱漏出、感染、瘢痕、白内障および／または他の副作用を含む、多くの合併症が生じる。加えて、他のタイプの従来的な外科手術の後、患者は、毎日の点眼剤または他の局所的な医薬を必要とする場合もある。伝統的なタイプの薬物投与は、特定の眼障害を完全に治療するために、重要な患者コンプライアンスを必要とすることがある。また、従来の手術方法の後に、眼の圧力制御も、失われる可能性がある。

本明細書の開示は、とりわけ、これらの合併症を軽減することができる実施形態を提供する。本明細書に開示される実施形態は、眼圧を効果的かつ効率的に監視し、治療に必要なＤＮＡプラスミドを含む組成物のデリバリ圧力および量を正確に決定し、注射装置を眼の中または近くに適切に配置し、および／または全治療を通したシステムや過程を制御する。いくつかの実施形態では、治療システムは、手動、半自動、およびまたは自動とすることができる。本明細書中に開示されるいくつかの実施形態はまた、眼障害の治療におけるコンプライアンスに関し、患者関与を低減することが必要となる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、一度プラスミドが注射された後、眼の前房にＤＮＡプラスミドを向けるために使用され得る。エレクトロポレーションはまた、目の線維柱帯網または毛様体への遺伝子デリバリを増強し得る。いくつかの実施形態では、これは、瘢痕、炎症および／または他の副作用の軽減を支援する。

排液インプラントなどの眼障害を治療する、いくつかの従来システムは、非常に低い眼圧、白内障、角膜剥離脈絡膜および／または網膜の破壊、および／または眼球運動障害の結果になり得る。インプラントが失敗するかブロックされると、しばしば追加の手術が必要になることがある。本明細書の開示は、眼圧を効率的かつ効果的に監視し、治療に必要なＤＮＡセラミドの適切な量を決定するシステム、デバイスおよび方法を提供する。このため、いくつかの実施形態を通して、眼障害の治療の従来のシステムに関するコンプライアンスは、実質的に軽減され得る。

医学的治療システムの技術分野の前述した改善を達成するために、本明細書に開示するシステムは、様々な機能、技術、および方法論を採用する。本明細書に記載の新たな特徴、技術および方法論は、特に、眼の障害の部門に生じる問題、特に緑内障の治療の問題を解決する。本明細書に開示されたシステムは、緑内障を治療するために主に記載されているが、開示されたシステムは、眼または任意の身体器官に関係する他の障害の治療に使用することが出来る。

（眼の解剖学）
眼は、光を検出し、それをニューロンの電気化学的インパルスに変換する特殊な感覚器官であり、それにより視力を可能にする。目には複数の房、すなわち前房（ヒトにおいて約２５０マイクロリットルの房水で満たされている）後房（虹彩の後ろの小さな空間であるが、レンズの前方））、および硝子体房（３つの房のうち、最も後方にある）を有している。前房は、眼の外面、角膜および虹彩との間に位置する。房水は、毛様体から分泌され、前房に流入する。房水は、これらに限定されるものではないが、眼内圧を維持し眼球を膨らませること、栄養を角膜、線維柱帯網、レンズおよび他の前房解剖学的構造に提供すること、および視力を向上させるための屈折率を提供するという複数の機能を有する。房水は、連続的に生成され、したがって眼内圧の維持は、等しい速度の房水排液で釣り合わなければならない。

房水は、前房から線維柱帯網を通って、シュレム管に流入する。シュレム管は、上強膜静脈への房水の流れを可能にする。流出の主要な調節因子として、線維柱帯網は、水の流れに対して最大の抵抗を提供する。線維柱帯網は、最大９０％の水流出を処理する。この組織は、高く弾性であり、収縮性であり、ゆえに流体の流れを調節し、したがってＩＯＰを調節するのに重要な役割を果たす。線維柱帯網の弾力性および収縮性を調節するメカニズムの病理学的変化は、水流出およびＩＯＰに悪影響を及ぼし、緑内障を引き起こす可能性がある。流出の二次経路は、ブドウ膜腔の排液（眼内圧より独立している）を経由するものであり、その経路は、通常、線維柱帯網よりもはるかに少ない排液を説明する。

（眼障害）
上述したように、房水の生産と排出のバランスは、通常の眼内圧の維持を必要とする。緑内障は、網膜神経節細胞およびそれらの軸索を破壊して、対応する視力低下を引き起こす進行性疾患である。これは世界中の不可逆的な失明の主原因であり、現在までは治癒不可能である。上昇した眼内圧は、房水の生産の増加または流出の低下のいずれかによるものであり、緑内障に関連する。眼内圧の上昇は、例えば、異常な線維柱帯網、または虹彩の損傷または疾患による網状組織の損傷によって引き起される。

種々のタイプの緑内障が存在し、主要な分類は、緑内障が開放隅角または閉塞隅角緑内障であるかどうかである。問題の角度は、虹彩と角膜との間の角度による。この角度が狭くなったり閉じたりすると、圧力が上がり、最終的に視神経に損傷を与えて視力喪失につながる。

原発性開放隅角緑内障は、排液管の詰まりが進行して眼圧が上昇し、進行する視神経損傷を引き起こす結果である。これは、緑内障の中で最も普通のタイプであり、米国では９０％のケースを占める。発症は遅く、無痛であり、視力喪失は徐々にかつ不可逆的である。狭小角緑内障では、虹彩が前方に弓なりになり、眼を排液する角度が狭まり、眼内圧が上昇する。治療しない場合は、閉塞隅角緑内障の緊急事態を引き起こす。閉塞隅角緑内障（閉塞隅角緑内障）では、虹彩が前方に弓なりになり、虹彩と線維柱帯網の間の物理的接触を引き起こし、眼内からの房水の流出を阻止する。この接触は、水生産の速度を保つことをできなくさせ、眼圧が上昇するまで、線維柱帯網の機能に対する妥協を増大させる。症状の発症は、突然起こり、痛みや他の症状が顕著に現れ、緊急事態として処置される。

二次的な緑内障は、別の病気、外傷、薬物または処置が眼圧上昇を引き起こし、視神経損傷および視力喪失をもたらす場合を指す。

角膜剥離緑内障では、圧力は、房水の正常な排液を妨げる顕微鏡的な粒状タンパク質繊維の蓄積に起因する。本質的に、破片は線維柱帯網の流出通路を閉塞する。同様に、色素性緑内障は、虹彩の裏側から色素細胞を剥がし、前房に集めて線維柱帯網を詰まらせることによって生じる。リシルオキシダーゼライク１（ＬＯＸＬ１）遺伝子の多型は、剥離症候群に関連し、眼圧が上昇して緑内障が発症する。剥離症候群で発生する緑内障は、特に攻撃的である。ＬＯＸＬ１は、弾性繊維の維持に関与しており、ＬＯＸＬ１の欠乏は、組織における弾性的な攪乱を引き起こす。線維柱帯網では、これにより眼圧の調節不全および隆起が生じると考えられている。

剥脱症候群が探索され得る動物モデルは、以下でより詳細に議論されるＬＯＸＬ１ホモ接合性ノックアウト（ＬＯＸＬ１−／−）マウスである。ＬＯＸＬ１−／−マウスは、正常なエラスチン含量で生まれているが、経時的なエラスチン維持障害のために、この含量は年齢と共に減少する。以下に述べるように、剥離症候群の早期に、線維柱帯網のＬＯＸＬ１異常を矯正する能力は、ＬＯＸＬ１異常に関連する眼内圧上昇および緑内障の予防を可能にする場合もある。

原発性若年性緑内障は、新生児または若年性異常であり、出生時またはその直後に高眼圧症が明らかであり、典型的には、前眼房角発達における解剖学的異常の結果であり、房水流出の閉塞をもたらす。

尿毒症性緑内障は、ブドウ膜炎（ブドウの腫れおよび炎症、目の中間層）の結果である。ブドウ膜炎の眼圧上昇は、炎症自体またはそれを治療するために使用されたステロイドに起因する。

以下でさらに詳しく述べるように、いくつかの実施形態では、長期間の緑内障を効果的に管理、治療、最終的に治癒または緩和することは、眼内圧の異常（例えば、線維柱帯網のような）の原因となる組織の分子欠損の矯正の結果となる。

（緑内障の治療）
上述したように、緑内障は、房水の過剰産生および／またはより一般的には房水の排液障害により生じる。したがって、緑内障治療は、典型的には、房水生成または排液の一方または両方の側面に集中している。１つの治療のアプローチは、毛様体による房水の生成を減少させる薬物治療を含む。しかし、経時的な薬物投薬量は、定期的に監視されなければならず、その時の患者のコンプライアンスは所望の治療効果未満になる。加えて、薬物療法は、副作用を打ち消すために、追加の医薬療法を必要とする重要な副作用を与え、患者のコンプライアンスをさらに低下させる。別のアプローチは、例えば、線維柱帯網をステント留置することによって（または網状組織全体を通過させることによって）房水の流出を強化または増強することに特に焦点を当てている。これらのアプローチの１つの欠点は、手順の侵襲性である。加えて、これらは物理的なアプローチであるため、それらはまた、線維柱帯網自体が、経時的な流出効率と同じ漸進的な低下を被ることもある。例えば、ステントは、インプラントの直後に流出増強を提供し得るが、経時的にゆっくりと閉塞され、それにより、ステントを清浄化および／または置換するための追加の侵襲的手術を必要とする。いくつかのアプローチは、薬物デリバリを物理的ステントと結合する一方で、房水の排液を強化するために、標的組織に薬物をより正確にデリバリするためのインプラント型デバイスを使用する、追加のアプローチも提供する。これらのアプローチには確かな欠点があるかもしれないが、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、緑内障の治療において、強化された治療効果を提供するために、これらのアプローチに匹敵するよう構成される。

分子的なアプローチはまた、緑内障を主に治療するための試みとして使用されており、例えば、遺伝子治療である。しかし、下記に、より詳細に記述するように、遺伝子治療は、関心のある治療用遺伝子のデリバリのためのウイルスベクターを典型的には用いるものであり、眼内環境で使用する場合、いくつかの制限および免疫原性リスクなど潜在的な欠点がある。ある種のウイルスベクター（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）は、網膜遺伝子治療にある程度成功しているが、それらのベクターは、遺伝子運搬能に問題があり、免疫応答や悪性腫瘍を誘発する能力を依然として残している。

（ベクターとしてのプラスミド）
ウイルスベクターとは対照的に、プラスミドＤＮＡなどの非ウイルス性の天然由来のＤＮＡは、免疫原性および／または安全性のリスクが有意に低下するか、または存在しない。プラスミドＤＮＡを使用する場合、プラスミドＤＮＡベクターに組み込むことができる目的の治療遺伝子のサイズの制限がほとんどないなど、さらなる利点が実現される。したがって、ウイルスベクターに適合する十分小さい治療遺伝子のプールは、大きく低減されることもあるが、広範囲の治療遺伝子が所与の疾患について評価することができる。加えて、プラスミドＤＮＡは、非常に安定であり、長期間安定性を維持するために冷凍または凍結を必ずしも必要とせず、実験室環境での長い使用の歴史を有する。まとめると、プラスミドＤＮＡの特徴の多くは一般に理解されており、プラスミドＤＮＡは、本明細書に開示されている、いくつかの治療的実施形態にとって理想的な選択肢となる。さらに、プラスミドは、遺伝子がプラスミドに挿入される方向性にある程度の柔軟性を与える（遺伝子は、目的の治療用遺伝子をコードするポリペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域で、プラスミド内の所望の位置に挿入することができる）。目的の治療用遺伝子の適応性を変化させるこの能力は、当業者に理解されるいくつかの利点を提供する。加えて、上述したように、プラスミドは、サイズ制限があるとしてもほとんどないので、大きな治療遺伝子でさえ、マーカーまたは他のタイプのレポーター遺伝子をプラスミドに組み込む能力を残している（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または標的細胞内の治療遺伝子の長期寿命のデリバリおよび決定のための品質管理として使用され得る、いくつかの他の識別可能なマーカなど）。

（治療遺伝子）
上述したように、高まった眼内圧に関連するか、さもなければそれに関連する様々なタイプの眼障害が存在する。よって、本明細書に開示された、いくつかの実施形態にしたがい、眼内圧を正常レベルに低下させるために、または圧力上昇を防止するために使用することができる治療遺伝子を、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムと共に使用することができる。実施形態に応じて、治療遺伝子は、３つの主な概念的経路の１つ、すなわち、眼内液の生成の低減；眼内流体の流出の増加；病気に関連した流出の減少によって、眼内圧上昇に関連する障害の症状を軽減しおよび／または治療するために使用することができる。

例えば、一実施形態では、リシルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）をコードするポリヌクレオチドは、角膜の緑内障の治療で投与が可能である。このようなヌクレオチドの一例は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ_００５５７６．２である。一実施形態では、ミオシリンをコードするポリヌクレオチドは、若年性緑内障の治療で使用が可能である。一実施形態では、ＣＹＰ１Ｂ１をコードするポリヌクレオチドは、小児期および／または成人緑内障の治療で使用が可能である。一実施形態では、プロスタグランジンＦ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、眼の組織を誘導するために、プロスタグランジンの産生を上方制御するため投与が可能であり、毎日のプロスタグランジンの点眼薬の使用を補う（または置き換える）ために使用することができる。また追加の一実施形態では、Ｃ３転移酵素またはカルデスモンをコードするポリヌクレオチドは、眼内および／または眼球外の筋肉（例えば、ミオシンのＡＴＰアーゼ活性の阻害による）の収縮性を減少するために投与が可能であり、副次的な効果として、眼全体の圧迫を軽減することができる。

実施形態によると、目的の治療遺伝子の断片、誘導体、ミュータント、切り詰め、または他のバリアントが使用できる。これらの用語は、その通常の意味を与えられるものとする。それらはまた、少なくとも４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５% 、または９９％は、天然（例えば、野生型）ポリヌクレオチドと同一である、ポリヌクレオチド；少なくとも４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９８% または９９% は、天然のポリペプチドと同一である、ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸ミューテーション（例えば、付加、欠失および／または置換）（天然ポリペプチドと比較した）を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；中程度または典型的な、ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件下で、天然ポリペプチドをコードする核酸に、ハイブリダイズすることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または、中程度または典型的なストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも２０個の連続したアミノ酸、少なくとも３０個の連続したアミノ酸、少なくとも４０個の連続したアミノ酸、少なくとも５０個の連続したアミノ酸、少なくとも７５個の連続したアミノ酸、少なくとも１００個の連続したアミノ酸、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸、または少なくとも１５０個の連続アミノ酸の天然ポリペプチドの断片をコードする、核酸配列にハイブリダイズできるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに言及する。

加えて、天然ポリヌクレオチドの誘導体、断片、またはバリアントは、天然ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を保有する、ポリペプチドをコードするものを含む。

上述したように、治療遺伝子は、場合によりレポーター遺伝子と一体化していてもよいし、レポーター遺伝子と一列に並んでいてもよい。適切なレポーター遺伝子は、これらに限定されないものの、ｌａｃＺ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または本明細書に開示される他のまたはヒト療法での使用に適切なレポーターを含むことができる。

いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡはまた、治療遺伝子の遺伝子発現を、ポジティブまたはネガティブに調節する誘導性要素を含む。実施形態によると、化学的に調整または物理的に調整された誘導性要素のいずれかが使用される。物理的に調節される誘導性要素は、光（例えば、光度）、温度、例えば眼内環境などで見られるような、生理学的温度に反応するものを含むが、これらに限定されない。化学的に調節される誘導性要素は、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ドキシサイクリンなどの薬物、ステロイド化合物、金属または金属イオンなどの存在または非存在に基づいて、遺伝子発現を調節することに応答するものを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態は、例えば、Ｃｒｅ―ｌｏｘ誘導性システムを使用する。いくつかの実施形態は、例えば、Ｔｅｔ―ｏｎ／Ｔｅｔ―ｏｆｆシステム（または他の薬物ベースの調節システム）を使用する。いくつかの実施形態は、インターフェロンαおよびγならびにｄｓＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）によって誘導可能な、ミクソウィルス抵抗性１（Ｍｘ１）プロモーターを使用する。上記のように、このようなシステムを用いて、治療遺伝子の陽性および／または陰性調節を達成することができる。治療遺伝子の発現を調節するために、例えば、低分子干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの、他のメカニズムも使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子発現のレギュレーターは、利点的には感光性である。いくつかの実施形態では、レギュレーターは、局所的または経口的に投与される。

他の利点に加えて、目的の治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのデリバリは、治療遺伝子の発現を促進する調整されたプロモーターの使用をも含み、いくつかの実施形態では、標的効果を低減または回避するために、組織特異的プロモーターが使用される。しかし、特定の実施形態では、組織特異的ではないプロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの、十分に確立された高効率プロモーターが使用される。

（デリバリおよび付属デバイス）
下記にさらに充分に議論されるように、裸のプラスミドＤＮＡをデリバリするためのデバイスおよびシステムは、実施形態に応じて変えることができる。例えば実施形態によっては、デリバリ・デバイスは、所望の体積のプラスミドＤＮＡを対象の標的組織（例えば眼組織）にデリバリする注射シリンジを含む。実施形態によっては、デリバリ・デバイスは、所望の圧力の枠内でプラスミドＤＮＡを対象の眼組織にデリバリするために、マノメータを組み込むおよび／またはマノメータと通信する。いくつかの実施形態は、１つまたは複数のデリバリ変量（例えば、注入の圧力、体積、速度、持続時間など）を動力学的に調整することを可能にする、コンピュータ・インターフェースを含む。いくつかのそのような実施形態では、眼組織への電場の印加などの付属の方法も、コンピュータ・インターフェースによって制御することができる。

図３は、注射システム８００の一実施形態を図示する。一実施形態では、注射システム８００の針８０２は、眼の前房に接触していてもよい。一実施形態では、注射システム８００は、プラスミドＤＮＡを眼組織にデリバリする。

図４は、別の実施形態を図示する。ここでは、注射システム８００の針８０２は、眼の前房に接触、穿刺、貫通、その他進入してもよい。一実施形態では、負電荷を持つ電極４０４が、眼の一方の側に配置されていることがある。一実施形態では、正電荷を持つ電極４０６が、眼の別の側に配置されていることがある。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極が、正電荷または負電荷を有していることがある。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極が、眼の反対側に配置されていることがある。眼の反対側または異なる側に配置された１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはそれを超える電極のそれぞれが、逆の電荷を有していることがある。逆の電荷を持つ電極を眼の反対側に配置することによって、注射されたＤＮＡプラスミドの眼の一方の側から他方へ流れる方向を制御する能力が有利に増強されることがある。実施形態に応じて、眼の全体にわたって電荷のバランスが取られている必要はない（例えば、眼の一部分が３つの電極に接触する可能性があるが、一方で反対の部分が１つの電極のみに接触する）ことが認識されよう。同様に、電極の配備では、正確に反対である必要はない（例えば、電極間が１８０度未満の角度が使用されてもよい）。

図５は、エレクトロポレーション・システムの一実施形態を図示する。一実施形態では、負電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０２が、正電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０４に連結されることがある。負電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０２および正電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０４の側壁は、下方へ傾いていることがある。これによって、エレクトロポレーション・システムを、眼の前房を覆って合わせることが可能になろう。実施形態によっては、エレクトロポレーション・システムは、様々なサイズの眼に適合するように調整可能である場合がある。一実施形態では、注射システム８００は、エレクトロポレーション・システムに連結される。他の実施形態では、注射システム８００を、エレクトロポレーション・システムの中心に置くことができる。一実施形態では、注射システム８００のシリンジ５０６を、エレクトロポレーション・システムの中心の周りにまたはシステムの側に回転させることができる。これによって、ＤＮＡプラスミドを様々な角度で注射することが可能になり、眼のある種の構造の外傷および瘢痕が回避される。逆の電荷を持つエレクトロポレーション・プレートを眼の両側に配置することによって、注射されたＤＮＡプラスミドの眼の一方の側から他方へ流れる方向を制御する能力が有利に増強されることがある。

図６Ａは、エレクトロポレーション・システムの一実施形態を図示する。エレクトロポレーション・システムの一実施形態は、正電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０２、負電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０４、および／または注射システム８００のシリンジ５０６を含むことがある。図６Ｂは、エレクトロポレーション・システムの一実施形態の上面概略図を示す。一実施形態では、正電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０２および負電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０４は、半円形、矩形、円形および／または任意の他の形状を有することがある。一実施形態では、エレクトロポレーション筐体６１０は、矩形、半円形、円形および／または任意の他の形状としてもよい。

図７Ａ〜７Ｃは、眼を覆ってエレクトロポレーション・システムを置くためのプロセスの一実施形態の上面概略図を示す。図示されるように、眼の前房を覆ってエレクトロポレーション・システムを置く。

図８は、注射システム８００の一実施形態の概略図である。一実施形態では、注射システム８００は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ、またはそれを超えるシリンジまたは他の注射システムとしてもよい。一実施形態では、注射システム８００は、手動で操作される、半自動的である、および／または完全に自動的であるものとできる。一実施形態では、注射システム８００は、引き抜くおよび／または灌流するように構成されるものとできる。

一実施形態では、注射システム８００は、針８０２、Ｙ字管８０４、灌流シリンジ８０６、引抜きシリンジ８０８、止めコック８１０、ディスプレイ８１２、第１のプランジャ８１４、第２のプランジャ８１６、および／または圧力変換器筐体８１８を含むことがある。針８０２は、Ｙ字管８０４の第１の部分８２２および／または第２の部分８２４および／またはａ第３の部分８２６に連結されることがある。実施形態によっては、Ｙ字管８０４を非膨張性としてもよい。

注射システム８００は、圧力変換器筐体８１８にある圧力変換器を含むことがある。一実施形態では、振動板９０２および／またはホイートストン・ブリッジも、圧力変換器筐体８０８にあることがある。一実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、注射システム８００から取り外し可能であることがある。

実施形態によっては、圧力変換器筐体８１８は、Ｙ字管８０４の第２の部分８２４に連結されていることがある。他の実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、Ｙ字管８０４の第１の部分８２２、第２の部分８２４、および／もしくは第３の部分８２６、もしくはＹ字管８０４の任意の他の部分、および／または注射システム８００の任意の部分の間に形成された接合点に連結されていることがある。さらになお、他の実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、灌流シリンジ８０６および／または引抜きシリンジ８０８に連結されることがある。一実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、針８０２に連結されることがある。他の実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、第１のプランジャ８１４および／または第２のプランジャ８１６に連結されることがある。

ディスプレイ８１２は、圧力変換器筐体８１８の外面に連結することができる。ディスプレイ８１２は、アナログおよび／またはデジタルとすることができ、実施形態によっては目盛盤を含んでいることがある。ディスプレイ８１２は、圧力変換器によって決定された圧力を表示するように構成されてもよい。一実施形態では、ジャック８２０は、圧力変換器筐体８１８の第２の外面に連結されることがある。ジャック８２０は、コントローラおよび／またはポンプ１００２に接続するように構成されてもよい。コントローラは、実施形態によっては、アナログとしてもデジタルとしてもよい。

一実施形態では、灌流シリンジ８０６は、第１のプランジャ８１４で構成されることがある。この実施形態では、灌流シリンジ８０６は、最大２５０マイクロリットルを注射するように構成することができる。他の実施形態では、灌流シリンジ８０６は、２５０マイクロリットル超を注射するように構成されることがある。実施形態によっては、灌流シリンジ８０６は、医薬、ＤＮＡ、プラスミド、および／または任意の他の物質で予め充填されていることがある。他の実施形態では、灌流シリンジ８０６は、予め充填されていないことがある。灌流シリンジ８０６は、ガラス製としてよい。

一実施形態では、引抜きシリンジ８０８は、第２のプランジャおよび止めコック８１０を含むことがある。止めコック８１０は、引抜きシリンジ８０８を開くおよび／または閉じるためのボタンを含むことがある。実施形態によっては、引抜きシリンジ８０８は、予めゼロマイクロリットルに設定することができ、最大１２５マイクロリットルを引き抜くように構成することができる。他の実施形態では、引抜きシリンジ８０８は、１２５マイクロリットル超を引き抜くように構成することができる。

図９Ａ〜９Ｂは、注射システム８００の一実施形態を描いた概略図である。図９Ａは、灌流シリンジ８０６の一実施形態の側面図である。図９Ｂは、引抜きシリンジ８０８の一実施形態の側面図である。一実施形態では、圧力変換器筐体８１８は、管連結チャンバ９０４によって灌流シリンジ８０６に連結される。一実施形態では、圧力変換器筐体８１８の振動板９０２は、第１の止めコック９０６のボタン９０８に連結される。一実施形態では、振動板９０２を、圧電性とすることができる。圧力変換器筐体８１８内にある圧力変換器によって標示された特定の圧力に基づき、第１の止めコック９０６は、注射される医薬および／またはＤＮＡを適正な量とすることを可能にするために、開くおよび閉じるように構成することができる。

注射システム８００は、何通りかで使用することができる。一例では、注射システム８００は、医薬および／またはＤＮＡを含む５０％の水性液体を変換圧力に交換するように構成することができる。このプロセスの一実施形態では、灌流シリンジ８０６は、その最大注射容量を２５０マイクロリットルに設定することができる。針８０２は、角膜の前房内に挿入することができる。次に、第２の止めコック９１０を開くことができる。次に、引抜きシリンジ８０８の第２のプランジャ８１６を引いて、最大１２５マイクロリットルの水性液体を引き抜くことができる。その後、第１の止めコック９０６を開くことができ、第１のプランジャ８１４を押すことによって、灌流シリンジ８０６中にある医薬および／またはＤＮＡを注射して、引き抜いた水性液体と置換することができる。引き抜いた水性液体が置換されれば、第１のプランジャ８１４をさらに押して医薬および／またはＤＮＡを注射して、変換圧力を増加させることができる。圧力が変換圧力のレベルに到達すれば、針８０２を引き抜いてプロセスを完了することができる。

別の実施形態では、ポンプ１００２は、コネクタ１００８によってジャック８２０に接続することができる。一実施形態では、コネクタ１００８は、ジャック８２０をブリッジ・アンプに、および／またはブリッジ・アンプをデジタル入力および／もしくは出力に、および／またはブリッジ・アンプをアナログ・ボルト・ポンプ・コントローラに、および／またはアナログ・ボルト・ポンプ・コントローラをポンプ１００２に、接続することがある。これは、さらに長く灌流するのに有利であり、なぜなら、この実施形態によって、変換圧力（例えば、３５ｍｍＨｇ、１５ｍｍＨｇ、２５ｍｍＨｇおよび／または１５ｍｍＨｇから３５ｍｍＨｇ）を灌流の期間にわたって修正および／または制御することが可能になるためである。変換圧力は、針８０２を角膜の前房内に挿入することによって決定されてもよい。一実施形態では、灌流シリンジ８０６のポンプ１００２は、作り付けのアナログ電圧インテグレータを含むことがある。一実施形態では、ポンプ１００２は、ディスプレイを含むことがある。

図１２は、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極の配置の一実施形態を図示する。概して、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、角膜と強膜との縁接合部１１２８の近くに据えられることがある。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、線維柱帯網１１１８上に配置されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、線維柱帯網１１１８からの第１の距離１１２２に配置されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、例えば、接合部１１２８からおよそ０．５から０．７５ｍｍに配置されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、毛様体１１２０上に配置されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、毛様体１１２０からの第２の距離１１２４に配置されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極は、毛様体１１２０からおよそ１．０から２．０ｍｍに、例えば、かつ強膜１１２６の上方に配置されてもよい。

図１１は、エレクトロポレーション・システムの一実施形態を図示する。エレクトロポレーション・システムの一実施形態は、全体的に円錐の形状、円筒の形状、および／または任意の他の形状を有していてもよい。

一実施形態では、エレクトロポレーション・システムは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートで構成される。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれは、患者の眼の表面の輪郭に適合するように上向きの角度に傾斜させることができる。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれは、正電荷および／もしくは負電荷を有していてもよい、および／または電荷を有していなくてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれは、ケーブルを接続して電流を供給するための正極および／もしくは負極を有していてもよい、および／または電極を有していなくてもよい。眼内に導入されたプラスミドの流れを方向付けるために、両側に配置された１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれが逆電荷を有することが有利である。

例えば、図１１では、エレクトロポレーション・システムは、第１のエレクトロポレーション・プレート１１０２および第２のエレクトロポレーション・プレート１１０４を含むことがある。一実施形態では、第１のエレクトロポレーション・プレートは、正極１１３０を有することがあり、第２のエレクトロポレーション・プレートは、負極１１３２を有することがある。一実施形態では、第１のエレクトロポレーション・プレート１１０２および第２のエレクトロポレーション・プレート１１０４のそれぞれは、半円形および／または任意の他の形状を有するものとすることができる。例えば、図６Ｂは、エレクトロポレーション・システムの一実施形態の上面図を示す。一実施形態では、正電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０２および負電荷を持つエレクトロポレーション・プレート５０４は、半円形、矩形、円形および／または任意の他の形状を有することがある。一実施形態では、エレクトロポレーション筐体６１０は、矩形、半円形、円形および／または任意の他の形状としてもよい。

一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれは、部分に分割されてもよい。例えば、図１１では、第１のエレクトロポレーション・プレート１１０２および第２のエレクトロポレーション・プレート１１０４は、それぞれ第１の部分および第２の部分に分割されて四分円を形成している。各部分は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれに電荷を持たせるために、および／または眼に電流を供給するために、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える電極１１０８を含んでいてもよい。有利には、各四分円は、例えば、３つ、４つ、または５つの電極１１０８を含有することがある。１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える電極１１０８のそれぞれは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレート内のワイヤによって接続されてもよい。

一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８のそれぞれが、配置可能および／または置換可能であることがある。これによって、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８を常に滅菌する必要がなくなることから、さらに効率の良い治療が可能となろう。一実施形態では、電極スイッチ１１１６が、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれの外面に連結されてもよく、これらのプレートは、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８を係合または格納するように構成されてもよい。一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８のそれぞれが係合状態にある際に、１つ、２つ、３つ、４つ、および／もしくは５つまたはそれを超える電極１１０８は、エレクトロポレーション・プレート表面の直下および／または下に、角膜と強膜との縁接合部１１１２内の眼の任意の部分（例えば角膜１１１０）に接触させて配置されることがある。実施形態によっては、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８は、格納可能でなくてもよい。

上に記載されたように、エレクトロポレーション・システムの一実施形態の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれを超える電極１１０８を眼に接触させることが有利である。エレクトロポレーションは、電場を細胞に印加して、細胞膜の多孔性を増加させる。これによって、ＤＮＡおよび／または薬剤を細胞内に導入することが可能になる。複数の実施形態では、注射システム８００を通じて、プラスミドを眼内に注射することができる。そうして、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える電極１１０８の供給する電流によって、細胞内へのプラスミドの導入が促進され、それによって、標的組織へデリバリされる目的の治療遺伝子の量が増加する。さらに、エレクトロポレーションは、眼から排出するための線維柱帯網などの組織に向かう、眼の前房におけるプラスミドの流れを有利に方向付けることがある。さらに、プラスミドは、一定および／または様々な圧力下で眼に供給されることがあり、実施形態によっては、高容量、中容量、および／または低容量で眼に供給されることがある。それにもかかわらず、エレクトロポレーションによって、プラスミドの導入を制御することが可能になろう。

実施形態によっては、エレクトロポレーションは、眼の一周縁の眼の一部分に印加されてもよい。視覚障害を治療するための他の遺伝子療法の方法では、治療がオフ・ターゲットとなり、その結果、望ましくない眼の範囲に望ましくない発現が生じる可能性がある。エレクトロポレーション・システムおよび／または注射システムの複数の実施形態は、タンパク質産生によって形成される発現を制御できることから有利である。実施形態によっては、ある特定量のタンパク質のみを生成させることが必要である。眼の一周縁の眼の一部分のみへエレクトロポレーションを加えることによって、治療されるべき特定の眼の範囲で、タンパク質を濃縮して生成させることが可能になろう。

一実施形態では、第１のエレクトロポレーション・プレート１１０２および第２のエレクトロポレーション・プレート１１０４は、調整可能とすることができる。一実施形態では、スライド１１０６によって、第１のエレクトロポレーション・プレート１１０２および第２のエレクトロポレーション・プレート１１０４をスライド１１０６の周りに動かして、各エレクトロポレーション・プレート間の空間を調整することが可能になる。他の実施形態では、スライド１１０６は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるエレクトロポレーション・プレートのそれぞれに連結される。このことは有利であり、なぜなら、エレクトロポレーション・プレートのそれぞれが電荷を有し、エレクトロポレーション・プレートの間の空間が遮蔽を提供するためである。加えて、各患者の眼の線維柱帯網および形状が様々であることから、スライド１１０６は有利である。実施形態によっては、スライド１１０６によって、エレクトロポレーション・システムを患者の眼の輪郭および形状に合わせて調整することが可能になろう。

実施形態によっては、ホルダ１１１４が、エレクトロポレーション・プレートのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つおよび／またはそれを超える数のものに連結されることがある。ホルダ１１１４は、一実施形態では絶縁されていることがある。

一実施形態では、エレクトロポレーション・システムは、一体化された注射システムを含んでいてもよい。他の実施形態では、注射システムは、エレクトロポレーション・システムと一体化されていない。図５に図示される実施形態など、一実施形態では、注射システムが、（完全にまたは部分的にのどちらかで）エレクトロポレーション・システムの中心（または中央部分）を垂直に通過する。有利には、瘢痕および他の潜在的な副作用を予防するために、シリンジは、中心を外しておよび／またはある角度で、エレクトロポレーション・システムを通過することがある。

複数の実施形態では、エレクトロポレーションの間に採用される様々なパラメータは、具体的な患者、具体的なプラスミド、または他のコンテクストの具体的な特徴に誂えることができる。この具体的な特徴は、線維柱帯網などの標的組織に対し治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの所望のデリバリを達成するように、最適化できる。上に記載されたように、本明細書に開示されるエレクトロポレーション・デバイスの複数の実施形態は、特定の患者の眼表面に最適な適合をもたらすように調整可能であり、それに加えて、そのような実施形態では、アーチ状のエレクトロポレーション・デバイスが採用され、電場が通過して印加される円弧（例えば角度の数）を調整することができる。実施形態によっては、眼の周縁全体が単純に四分円に分割され、そこでは、第１の四分円に正電場が印加され、反対側の四分円に負電場が印加される。追加の実施形態では、眼の周縁全体の周りをさらに小さく分割したものが使用され、そのようなものとしては、例えば約１°から約５°の間、約５°から約１５°の間、約１５°から約２５°の間、約２５°から約３０°の間、約３０°から約４５°の間、約４５°から約６０°の間、約６０°から約９０°の間の円弧、および端点を含めてそれらの列挙された値の間にある任意の円弧などがある。実施形態によっては、例えば、眼のスキャンまたは他の診断測定が実施される際に、多様な円弧がコンピュータにより制御され、それらのスキャンまたは測定では、結果として得られるデータがコンピュータ・モジュールを通じて処理される。例えば、診断用スキャンを実施して、特定の値のエレクトロポレーションに最適な円弧が明らかにされることがある。他の実施形態では、多様な円弧が、患者に伴う過去の経験、診断的評価、または医師の通常の技術に基づき、医師により手動で制御および設定される。

実施形態によっては、エレクトロポレーションに使用される電圧は、約５０ミリボルト（ｍＶ）から約１５０ボルト（Ｖ）の間に及び、そのようなものとしては、約５０ｍＶから約７５ｍＶの間、約７５から約１００ｍＶの間、約１００ｍＶから約１５０ｍＶの間、約１５０から約２００ｍＶの間、約２００から約２５０ｍＶの間、約２５０から約３００ｍＶの間、約３００から約３５０ｍＶの間、約３５０から約４００ｍＶの間、約４００から約４５０ｍＶの間、約４５０から約５００ｍＶの間、約５００から約５５０ｍＶの間、約５５０から約６００ｍＶの間、約６００から約６５０ｍＶの間、約６５０から約７００ｍＶの間、約７００から約７５０ｍＶの間、約７５０から約８００ｍＶの間、しかし８００から約８５０ｍＶの間、約８５０から約９００ｍＶの間、約９００から約９５０ｍＶの間、約９５０ｍＶから約１Ｖの間、約１から約５Ｖの間、約５から約１０Ｖの間、約１０から約１５Ｖの間、約１５から約２０Ｖの間、約２０から約２５Ｖの間、約２５から約３０Ｖの間、約３０から約３５Ｖの間、約３５から約４０Ｖの間、約４０から約４５Ｖの間、約４５から約５０Ｖの間、約５０から約５５Ｖの間、約５５から約６０Ｖの間、約６０から約６５Ｖの間、約６５から約７０Ｖの間、約７０から約７５Ｖの間、約７５から約８０Ｖの間、約８０から約８５Ｖの間、約８５から約９０Ｖの間、約９０から約９５Ｖの間、約９５から約１００ボルトの間、約１００から約１１０Ｖの間、約１１０から約１２０Ｖの間、約１２０から約１３０Ｖの間、約１３０から約１４０Ｖの間、約１４０から約１５０Ｖの間、および端点を含めて列挙されたそれらの間にある任意の電圧が挙げられる。

１回の所与のエレクトロポレーションのセッションで眼表面に印加されるパルスの数は、約２パルスから約２０パルスの間に及ぶことがあり、そのようなものとしては、２から３パルス、３から４パルス、４から５パルス、５から６パルス、６から７パルス、７から８パルス、８から９パルス、９から１０パルス、１０から１２パルス、１２から１４パルス、１４から１６パルス、１６から１８パルス、または１８から２０パルスが挙げられる。実施形態に応じて、さらに多数のパルスが使用されることがある。

１回の所与のエレクトロポレーションのセッションで眼表面に印加されるパルスの持続時間は、約０．５ミリ秒（ｍｓ）から約１０ｍｓの間に及ぶものとすることができ、そのようなものとしては、約０．５から約１ｍｓ、約１から約２ｍｓ、約２から約３ｍｓ、約３から約４ｍｓ、約４から約５ｍｓ、約５から約６ｍｓ、約６から約７ｍｓ、約７から約８ｍｓ、約８から約９ｍｓ、もしくは約９から約１０ｍｓ、または列挙されたそれらの時間と時間との間にある端点を含めた任意の時間が挙げられる。

印加されるパルスとパルスとの間の間隔も、実施形態に応じて変えることができる。パルス間隔は、約２０ｍｓと約２００ｍｓの間とすることができ、そのようなものとしては、約２０から約３０ｍｓ、約３０から約４０ｍｓ、約４０から約５０ｍｓ、約５０から約６０ｍｓ、約６０から約７０ｍｓ、約７０から約８０ｍｓ、約８０から約９０ｍｓ、約９０から約１００ｍｓ、約１００から約１１０ｍｓ、約１１０から約１２０ｍｓ、約１２０から約１３０ｍｓ、約１３０から約１４０ｍｓ、約１４０から約１５０ｍｓ、約１５０から約１７０ｍｓ、約１７０から約１９０ｍｓ、約１９０から約２００ｍｓ、または列挙されたそれらの間にある端点を含めた任意の時間が挙げられる。

パルス列は、実施形態に応じて、同様に変わるものとできる。実施形態によっては、パルス列は、１から１０までに及び、そのようなものとしては、１から２まで、２から３まで、３から４まで、４から５まで、５から６まで、６から７まで、７から８まで、８から９まで、９から１０まで、または端点を含めてその間にある任意の体積が挙げられる。本明細書に議論されるように，電気割当量と併せてデリバリされるＤＮＡの量も、調整することができる。例えば、実施形態によってはプラスミドＤＮＡ濃度は、約１と約３００μＬとの間の体積中で約０．１から約２０μｇまでに及ぶ。さらに具体的には、ＤＮＡの量は、約０．１μｇから約１μｇまで、約１μｇから約２μｇまで、約２μｇから約３μｇまで、約３μｇから約４μｇまで、約４μｇから約５μｇまで、約５μｇから約６μｇまで、約６μｇから約７μｇまで、約７μｇから約８μｇまで、約８μｇから約９μｇまで、約９μｇから約１０μｇまで、約１０μｇから約１２μｇまで、約１２μｇから約１４μｇまで、約１４μｇから約１６μｇまで、約１６μｇから約１８μｇまで、約１８μｇから約２０μｇまでに及ぶものとでき、端点を含めてこれらの列挙された値の間にある任意の量のプラスミドＤＮＡとすることができる。デリバリされるプラスミドＤＮＡの体積および特定の対象の前房の容積に応じて、実施形態によっては、ＤＮＡの量をさらに多くすることができる。．さらに、プラスミドＤＮＡ溶液の体積は、実施形態に応じて、約１μＬから約２μＬまで、約２μＬから約２．５μＬまで、約２．５μＬから約３μＬまで、約３μＬ約３．５μＬまで、約３．５μＬから約４μＬまで、約４μＬから約４．５μＬまで、約４．５μＬから約５μＬまで、約５μＬから約６μＬまで、約６μＬから約７μＬまで、約７μＬ約８μＬまで、約８μＬから約９μＬまで、約９μＬ約１０μＬまで、約１０μＬから約１２μＬまで、約１２μＬから約１４μＬまで、約１４μＬ約１６μＬまで、約１６μＬから約１８μＬまで、約１８μＬから約２０μＬまで、約２０μＬから約２５μＬまで、約２５μＬから約３０μＬまで、約３０μＬから約３５μＬまで、約３５μＬから約４０μＬまで、約４０μＬから約４５μＬまで、約４５μＬから約５０μＬまで、約５０μＬから約１００μＬまで、約１００μＬから約１５０μＬまで、約１５０μＬから約２００μＬまで、約２００μＬから約２５０μＬまで、約２５０μＬから約３００μＬまでに及ぶものとすることができ、列挙されたそれらの間にある任意の体積とすることができる。さらに、本明細書に議論されるように、他の特徴（例えば、デリバリされるプラスミドＤＮＡの量、特定の対象の前房の容積など）に応じて、さらに多い体積を使用することもできる。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されたデバイスを有利に使用して、前房から流体を引き抜いた後にその流体をプラスミドＤＮＡ溶液に置き換えるプロセスを通じて、プラスミドＤＮＡの濃度を増加させることができる。例えば、内房にアクセスすれば、引き抜きシリンジは、例えば２５から５０μＬの眼液（その中にプラスミドＤＮＡを含有しない眼液）を除去することができる。除去される流体の体積は、次いで、プラスミドＤＮＡを含む治療溶液に置換することができる。この引き抜きと注射の手順を複数回繰り返すことによって、プラスミドＤＮＡを含む治療溶液で前房の全流体体積が構成される点まで、プラスミドＤＮＡの最終濃度を増加させることができる。

個別の電極とアーチ状の電極のどちらを使用するかという電極の配置に応じて、エレクトロポレーションの間に印加される電場の平面は、具体的な眼組織を標的にすることができる。上に記載されたように、実施形態によっては、電場平面は、線維柱帯網に焦点を合わされる。追加の実施形態では、電場平面は、毛様体に焦点が合うように移動される。別の追加の実施形態では、電場平面は、眼の角膜縁および／または眼球後方に焦点が合うように移動される。

図１３は、２部構成の手動のシステムを含む治療システムに用いる医療プロセスの一実施形態を描いたフローチャートである。一実施形態では、プロセスはブロック１３０２で開始することができる。ブロック１３０４では、シリンジを患者の眼内に挿入することができる。ブロック１３０６では、シリンジ中のおよび／またはシリンジに接続されている圧力検出器を使用することによって、眼の圧力を決定することができる。一実施形態では、圧力を圧力検出器のディスプレイ上で見てもよい。一実施形態では、圧力を治療システムのディスプレイ上で見てもよい。一実施形態では、圧力の読み取りを使用して、所定の圧力でのプラスミドのデリバリをガイドしてもよい。上記に述べたように、このプロセスは、一連の引き抜き動作および注入動作の連続を任意選択的に含むこともできる（任意選択的なブロック１３０９を参照‐示されていないが、対応する任意選択的なブロックが、図１４および図１５に示される手順に存在する）。すなわち、前房からの眼液を引き抜いて、プラスミドＤＮＡを含む治療溶液に置換することができる。実施形態によっては、モニターの圧力は、操作者が引き抜きおよび／または注入のプロセスの間に望ましい圧力の枠を維持し、それによって眼内の組織への損傷の可能性を低減する助けとなる。引き抜きおよび注入のプロセスが繰り返されることから、前房にデリバリされるプラスミドＤＮＡの濃度を上昇させることができる。

ブロック１３０８では、ブロック１３０６で決定された圧力に基づき、用量を設定することができる。一実施形態では、この用量を、目盛盤に設定するおよび／またはシリンジに接続することができる。ブロック１３１０では、ブロック１３０６で決定された投薬に基づき、眼内に治療化合物を注射することができる。ブロック１３１２では、１つまたは複数のエレクトロポレーション・プローブを、眼の表面に適用してもよい。ブロック１３１４では、ある量（例えば、体積またはパーセンテージ）のエレクトロポレーションを、眼に適用するために決定することができる。ブロック１３１６では、ブロック１３１４で決定された通りのエレクトロポレーションの量を、眼に適用することができる。本明細書にさらに詳細に議論されるように、実施形態に応じて、電場の印加の際のＤＮＡデリバリを隔てる時間は変わるものとできる。デリバリと電場の印加との間の時間のバリエーションは、実施形態によっては、デリバリされているプラスミドＤＮＡの量およびまたは前房内での濃度（例えば、上に記載された引き抜きと注入の手順の結果として）によって規定されていてもよい。引き抜きおよび注入の手順を採用するさらに追加の実施形態では、任意選択的に、エレクトロポレーションを各回のプラスミドＤＮＡの注射の後に適用することができる。あるいは、所望の量のプラスミドＤＮＡが前房にデリバリされていれば、単回の電場の印加を使用することができる。

ブロック１３１８では、眼を分析して、プロセスの治療効果を決定することができる。治療効果に応じて、プロセスを、ブロック１３０６で開始して繰り返すことができる。プロセスが繰り返されないことがある場合には、ブロック１３２０でプロセスを完了することができる。

図１４は、１部構成の半自動システムを含む治療システムのための医療プロセスの一実施形態を描いたフローチャートである。一実施形態では、プロセスをブロック１４０２で開始することができる。ブロック１４０４では、治療システムを、患者の眼の表面上に据えることができる。ブロック１４０６では、治療システムを調整して、線維柱帯網を覆っておよび／またはその近くに、１つまたは複数のエレクトロポレーション・プローブを配備することができる。一実施形態では、治療システムを調整して、眼の他の部分を覆っておよび／またはその近くに、１つまたは複数のエレクトロポレーション・プローブを配備することができる。

ブロック１４０８では、この治療システムから眼内にのシリンジを挿入してもよい。ブロック１４１０では、シリンジ中のおよび／またはシリンジに接続されている圧力検出器を使用することによって、眼の圧力を決定することができる。一実施形態では、圧力を圧力検出器のディスプレイ上で見てもよい。一実施形態では、圧力を治療システムのディスプレイ上で見てもよい。

ブロック１４１２では、ブロック１４１０で決定された圧力に基づき、用量を設定することができる。一実施形態では、この用量を、目盛盤に設定するおよび／またはシリンジに接続することができる。ブロック１４１４では、ブロック１４１０で決定された圧力に基づき、眼内に治療化合物を注射することができる。ブロック１４１６では、ある量（例えば、体積またはパーセンテージ）のエレクトロポレーションを、眼に適用するために決定することができる。ブロック１４１８では、ブロック１４１６で決定された通りのエレクトロポレーションの量を、眼に適用することができる。

ブロック１４２０では、眼を分析して、プロセスの治療効果を決定することができる。治療効果に応じて、プロセスを、ブロック１４０６で開始して繰り返すことができる。プロセスが繰り返されないことがある場合には、ブロック１４２２でプロセスを完了することができる。

図１５は、１部構成の自動システムを含む治療システムのための医療プロセスの一実施形態を描いたフローチャートである。一実施形態では、プロセスをブロック１５０２で開始することができる。ブロック１５０４では、治療システムを、患者の眼の表面上に据えることができる。ブロック１５０６では、治療システムを調整して、線維柱帯網を覆っておよび／またはその近くに、１つまたは複数のエレクトロポレーション・プローブを配備することができる。一実施形態では、治療システムを調整して、眼の他の部分を覆っておよび／またはその近くに、１つまたは複数のエレクトロポレーション・プローブを配備することができる。

ブロック１５０８では、この治療システムから眼内にのシリンジを挿入してもよい。ブロック１５１０では、治療システムを作動させてもよい。ブロック１５１２では、シリンジ中のおよび／またはシリンジに接続されている圧力検出器を使用することによって、眼の圧力を決定することができる。一実施形態では、圧力を圧力検出器のディスプレイ上で見てもよい。一実施形態では、圧力を治療システムのディスプレイ上で見てもよい。

ブロック１５１４では、ブロック１５１２で決定された圧力治療システムに基づき、用量を設定することができる。ブロック１５１６では、ブロック１５１２で決定された圧力に基づき、眼内に治療化合物を注射することができる。ブロック１５１８では、ある量（例えば、体積またはパーセンテージ）のエレクトロポレーションを、眼に適用するために決定することができる。ブロック１５２０では、ブロック１５１８で決定された通りのエレクトロポレーションの量を、眼に適用することができる。

ブロック１５２２では、眼を分析して、プロセスの治療効果を決定することができる。治療効果に応じて、プロセスを、ブロック１５０６で開始して繰り返すことができる。プロセスが繰り返されないことがある場合には、ブロック１５２４でプロセスを完了することができる。

（デリバリ）
実施形態に応じて、治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのデリバリは、種々のルートのうち１つまたは複数によるものとすることができる。ルートの選択は、治療される標的組織、患者の特定の特徴（例えば患者の治療時現在の健康状態）、デリバリされるプラスミドＤＮＡおよびまたは治療遺伝子の特定の特徴（例えば、間接的なデリバリのルートを有効にできるように使用される組織特異的なプロモーターに関する）、または本明細書に議論される他の変量に依存することがある。いくつかの実施形態によれば、デリバリは、標的組織への静脈内注入、動脈内注入、筋肉内注射、皮下注射、直接注射による、局所的、経口的、経鼻的な、標的組織と連絡している開口部または房へのプラスミドＤＮＡのデリバリ、１つまたは複数の粘膜へのデリバリなどとすることができる。ある特定の実施形態では、プラスミドＤＮＡのデリバリとは、本明細書に開示されるデバイスのうち１つまたは複数を使用して、注射によって、プラスミドＤＮＡを対象の眼の前房にデリバリすることである。線維柱帯網が前房からの眼液の流出の門番としての役割を果たすことから、前房へプラスミドＤＮＡがデリバリされる結果、線維柱帯網の細胞によるプラスミドＤＮＡの取り込みと、それに続いて、線維柱帯網のそれらの細胞における治療遺伝子の発現とが生じる。

様々な担体を使用して、治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのデリバリを促進することができ、そのような担体としては、例えば、括弧リン酸緩衝生理食塩水、通常生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、Ｋｒｅｂｓ緩衝液、眼液（合成または天然のどちらか）、または眼内のデリバリに適合性のある任意の他の種々の適切な担体などがある。

実施形態に応じて、本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、診療所の状況下（例えば外来患者の環境）にある患者に治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをデリバリする際に、使用することができる。実施形態によっては、治療用プラスミドＤＮＡのデリバリは、下記に記載されるように、さらに長い経過時間にわたって実施することができる。例えば、外科手術一式のある環境では、上記に議論されたようなデリバリの方法および時間の選択は、それらは患者および／またはデリバリされる特定のプラスミドＤＮＡの特徴に依存する。

デリバリのパラメータは、本明細書に開示される他に考慮されるもののうち特定の対象およびその身体的な特徴に応じて、変えることができる。実施形態によっては、プラスミドＤＮＡの注射（または注入）の頻度は、数週間毎のデリバリから１週間に１回もしくは２回のみのデリバリまでに及ぶものとするか、またはさらに頻度を少なくすることができる。例えば、デリバリは、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、６週間毎に１回、８週間毎に１回、１２週間毎に１回、１６週間毎に１回、２０週間毎に１回、もしくは２４週間毎に１回（または端点を含めて列挙されたそれらの間にある任意のデリバリ間隔で）とすることができる。実施形態によっては、デリバリは、１〜２年毎に１回または２回とすることを目指す。

他に考慮されるもののうち目的の遺伝子および／または標的細胞集団に応じて、効能の持続時間（例えば、目的の治療遺伝子がどれほど長い間発現するか）は、実施形態に応じて、数週間から数ヶ月まで、またはさらに数年にまで変えてもよい．例えば、実施形態によっては、目的の治療遺伝子はデリバリ後、少なくとも３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、または少なくとも約２４ヶ月間（または端点を含めて列挙されたそれらの間にある任意の持続時間）発現する。

デリバリの体積は、実施形態によっては、治療されている患者（例えば小児対成人）に依存するものとなるが、概して約１０から約１０００μＬの間に及ぶものとなる。そのようなものとしては、約１０から約２０μＬの間、約２０から約３０μＬの間、約３０から約４０μＬの間、約４０から約５０μＬの間、約５０μＬから約１００μＬの間、約１００μＬから約１２５μＬの間、約１２５μＬから約１５０μＬの間、約１５０μＬから約１７５μＬの間、約１７５μＬから約２００μＬの間、約２００μＬから約２５０μＬの間、約２５０μＬから約３００μＬの間、約３００μＬから約３５０μＬの間、約３５０μＬから約４００μＬの間、約４００μＬから約４５０μＬの間、約４５０μＬから約５００μＬの間、約５００μＬから約６００μＬの間、約６００μＬから約７００μＬの間、約７００μＬから約８００μＬの間、約８００μＬから約９００μＬの間、約９００μＬから約１０００μＬの間、または端点を含めて挙げられるそれらの間にある任意の体積が挙げられる。

治療用プラスミドＤＮＡのデリバリの速度は、実施形態に応じて変えるものとなる。例えば、外来患者の診療所では注射が行われるのに対して、例えば外科手術の一式があるところまたは手術室では、さらに長い持続時間のかかる灌流が実施される。デリバリされている治療用プラスミドＤＮＡの体積も、デリバリの速度に影響を及ぼすものとなる。しかし、実施形態によっては、デリバリの速度は、約１から約３秒の間、約３から約６秒の間、約６から約１０秒の間、約１０から約１５秒の間、もしくは約１５から約２０秒の間（または列挙されたそれらの間にある端点を含めた任意の時間）となる。さらに長い注射時間も使用されることがあり、実施形態に応じて、例えばおよそ約３０から６０秒となる。治療用プラスミドＤＮＡが灌流によってデリバリされる際の実施形態では、灌流の持続時間は、約５から約９０分までに及ぶものとすることができ、そのようなものとしては、約５から約６分、約６から約７分、約７から約８分、約８から約９分、約９から約１０分、約１０分から約２０分、約２０分から約３０分、約３０分から約４０分、約４０分から約５０分、約５０分から約６０分、約６０分から約７０分、約７０分から約８０分、約８０分から約９０分、または列挙されたそれらの時間と時間との間にある端点を含めた任意の時間が挙げられる。実施形態によっては、より長い注入時間が有益であり、これはなぜなら、標的細胞、例えば線維柱帯網では、線維柱帯網細胞の最終的なトランスフェクション効率を低減させる可能性がある過剰なプラスミドＤＮＡによるはみ出しがないためである。

実施形態に応じて、プラスミドＤＮＡのデリバリを、一定の速度にまたは多様な速度にすることができる。例えば、デリバリの一定の速度は、１分当たり約０．２５μＬから１分当たり約３０μＬとすることができ、そのようなものとしては、１分当たり約０．２５μＬから１分当たり約０．５μＬ、１分当たり約０．５μＬから１分当たり約１μＬ、１分当たり約１μＬから１分当たり約２μＬ、１分当たり約２μＬから１分当たり約４μＬ、１分当たり約４μＬから１分当たり約８μＬ、１分当たり約８μＬから１分当たり約１０μＬ、１分当たり約１０μＬから１分当たり約１５μＬ、１分当たり約１５μＬから１分当たり約２０μＬ、１分当たり約２０μＬから１分当たり約２５μＬ、１分当たり約２５μＬから１分当たり約３０μＬ、および端点を含めて列挙されたそれらの間にある任意の体積が挙げられる。

多様な速度が使用される際の実施形態では、速度を調整して、例えば、圧力の増加にリアルタイムで適応させることができるが、この圧力の増加は、プラスミドＤＮＡを含有する溶液を眼の前房（または別の標的組織）にデリバリすることを通じて発生する可能性があるものである。それだけでなくリアルタイムで（または刻一刻の単位で）調整して、対象の眼の眼圧の変動を把握することができる。

実施形態に応じて、治療剤のデリバリの圧力を、所与の対象の現時点の眼の圧力を把握するために変えることができる。例えば、眼疾患の初期段階にある患者は、僅かに眼圧の上昇があるに過ぎないことがあり、僅かに眼圧の上昇があるに過ぎないことがあり、敏感な眼内組織に圧力による損傷を生じるリスクを冒すことなく、より高圧の治療剤のデリバリの圧力に耐えることができる。これに対して、他の患者は、大幅な眼圧の上昇に付随するさらに進行した病態を有することがあり、それゆえ、治療剤のデリバリによってもたらされる追加の圧力は、敏感な眼内組織を損傷するリスクがなければさほど大きくならない可能性がある。そのため、複数の実施形態による治療剤をデリバリする圧力は、水銀柱で約１０ミリメートル（ｍｍＨｇ）から約５０ｍｍＨｇの間で変わるものとできる。例えば、治療剤をデリバリする圧力は、約１０から約１５ｍｍＨｇまで、約１５から約２０ｍｍＨｇまで、約２２から約２５ｍｍＨｇ、約２５から約３０ｍｍＨｇまで、約３０から約３５ｍｍＨｇまで、約３５から約４０ｍｍＨｇまで、約４５から約５０ｍｍＨｇまで、および端点を含めて列挙されてそれらの間にある任意の圧力に及ぶものとすることができる。

本明細書に開示される他の変量に加えて、デリバリされる治療剤内のプラスミドＤＮＡの量または濃度は、対象ごとに変わるものとできる。例えば、実施形態によっては、所与の標的細胞（例えば線維柱帯網細胞）の核内に導入されるＤＮＡコピーの標的範囲は、５０と５０，０００コピーの間である。しかし、全ての治療遺伝子が他のもののように効率良く発現されるわけではないことが認識されるべきである。それゆえ、濃度を、所与の治療遺伝子の所望の発現レベルに応じて変えることができる。このことを考慮すると、特定のプロモーターを選択して目的の治療遺伝子の発現レベルを最大にすることもできる。実施形態によっては、目的のＤＮＡ配列のコピー数は、核１つ当たり約１０００コピーから核１つ当たり約５０００コピーに及び、そのようなものとしては、核１つ当たり約１０００から約２０００コピーまで、核１つ当たり約２０００から約３０００コピーまで、核１つ当たり約３０００約４０００コピーまで、核１つ当たり約４０００約５０００コピーまで、および端点を含めて間にある任意の量が挙げられる。この濃度は、本開示に与えられたガイダンスに基づいて、当技術分野の通常技術を使用して、所望の治療効能を達成するように変えることができることが認識されるべきである。

対象の眼の前房（または他の標的場所）にデリバリされるプラスミドＤＮＡ（目的の治療遺伝子を含む）の量は、実施形態に応じて変わるものとできる。この量は、約０．１マイクログラム（μｇ）と約１０μｇとの間とすることができ、そのようなものとしては、約０．１から約０．５μｇ、約０．５から約１．０μｇ、約１．０から約１．５μｇ、約１．５から約２．０μｇ、約２．０から約２．５μｇ、約２．５から約３．０μｇ、約３．０から約３．５μｇ、約３．５から約４．０μｇ、約４．０から約４．５μｇ、約４．５から約５．０μｇ、約５．０から約７．５μｇ、約７．５から約１０．０μｇ、および端点を含めて列挙されたそれらの間にある任意の量が挙げられる。

例によっては、プラスミドを用いる組織トランスフェクションが、所望とするところよりも効率が悪いことがある一方で、複数の実施形態によれば、隔離された前房区画内にｐＤＮＡを流体力学的に灌流することによって、線維柱帯網の細胞のトランスフェクションの効率が増加する。加えて、複数の実施形態では、エレクトロポレーションと組み合わせた際に、線維柱帯網のプラスミド・トランスフェクションの効率が大幅に増加する。

形質膜は、細胞内空間と細胞外空間とを隔てる脂質の障壁である。細胞外空間に堆積した外来性の遺伝子またはＤＮＡおよび数多くの薬剤が、この障壁を横断して細胞に進入することはできない。細胞内空間および細胞外空間は、イオン伝導正の流体で満たされている。ある電場では、細胞内空間および細胞外空間にあるイオンは、電気泳動によって移動するが、一方の空間から他方内への横断を形質膜によって妨げられる。その代わりに、逆電荷を持つ粒子が、形質膜の各側に蓄積する。これによって、形質膜を横切る電位差が発生する。エレクトロポレーションは、電位差の閾値を超えて起こり、そこでは、一過的な構造変化が形質膜に起こり、その膜の伝導性および透過性を変える。複数の実施形態に従って本明細書に記載されるように、電気刺激のパラメータ（例えば、場の強度、パルス持続時間、パルス数）を様々にすることによって、ある種の膜透過性の特徴を調節することができ、それによって、トランスフェクション・プロセスをある程度制御することが可能になる。また、電気刺激パラメータを変えて、エレクトロポレーション後の細胞の回復と生存率を決定してもよい。これらの特徴によって、エレクトロポレーション支援型遺伝子療法は魅力ある提案となる。膜の障壁機能に電気的に誘導される変化は、膜孔の一過的な開口に起因する。これらの膜孔は初めには疎水性であるが、続いて、膜脂質が再配置されて孔を親水性にするものと考えられる。これによって、イオンおよび分子の膜貫通移送が促進される。ＤＮＡ自体は、エレクトロポレーションの間に電場のベクターに沿って移動させることがあるように、高い電荷を有し、方向付けが可能であり。

ＴＭは、眼表面の外部かつ前房の内部のすぐ隣に位置する。ＴＭは房水に浸っている。房水は、生理的な塩溶液であり、隣にある角膜のエレクトロポレーションの間に立証されたように、優れたイオン導電体としての役割を果たす。房水で満たされた前房は、遺伝子またはＤＮＡを角膜貫通注射によって内部に堆積し易くする、デポーに相当する。この空間内で、外来性ＤＮＡは、ＴＭエレクトロポレーションと連結される際の遺伝子デリバリを増強するように、房水と混ざり合い、次いでＴＭ細胞を浸らせる。ＴＭは、眼表面のすぐ隣にあり、組織を横切って電場を発生するのに使用される表面電極によってアクセス可能である。これによって、侵襲性の最も小さなエレクトロポレーション支援型遺伝子デリバリおよびトランスフェクションに理想的な、前眼におけるＴＭの位置が設けられる。ウイルスベクター非存在下でヒトのＴＭをトランスフェクションするためのエレクトロポレーションを、図２４Ａ〜図２４Ｂに示す。

（実施例１−線維柱帯網への核酸のエレクトロポレーション支援型デリバリ）
この実施例は、遺伝子を線維柱帯網(TM)にデリバリする方法としての、非ウイルス性のエレクトロポレーション支援型トランスフェクションに関する。上に記載されたように、ＴＭは、眼表面の外部かつ前房の内部のすぐ隣に位置する。ＴＭは房水に浸っている。房水は、生理的な塩溶液であり、優れたイオン導電体としての役割を果たす。房水で満たされた前房は、遺伝子またはＤＮＡを上記に開示される角膜貫通注射、灌流などによって内部に堆積し易くする、デポーに相当する。この空間内で、外来性ＤＮＡは、房水と混ざり合い、次いでＴＭ細胞を浸らせる。ＴＭ細胞への目的の遺伝子のデリバリを促進するために、電場の印加を使用することができる。ＴＭは、眼表面のすぐ隣にあり、組織を横切って電場を発生するのに使用される表面電極によって容易にアクセス可能であり、それによって、侵襲性の最も小さなエレクトロポレーション支援型遺伝子デリバリおよびトランスフェクションに特に理想的な、前眼におけるＴＭの位置が設けられる。図16に示される予備データは、エレクトロポレーションを使用して、ウイルスベクター非存在下でヒトのＴＭをトランスフェクションできることを示す。

エレクトロポレーションを用いたプラスミドＤＮＡの補足的なデリバリの効能を決定するために、ＬＯＸＬ１遺伝子を有する／有さないプラスミドＤＮＡベクターを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＬＯＸＬ１^−／−マウスのＴＭにデリバリするものとする。図１７Ａ〜図１７Ｃに示されるように、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＬＯＸＬ１およびエラスチンを豊富にＴＭに発現している。図１７Ａは、ＬＯＸＬ１の発現を示し、図１７Ｂは、エラスチンの発現を示し、図１７Ｃは、それら２遺伝子の共局在を示す。この発現パターンは、ＬＯＸＬ１を欠損しているＬＯＸＬ１−／−マウスとは対照的である。次いで、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション支援型ＬＯＸＬ１トランスフェクションの効果および効率を評価するものとする。

（材料および方法）
マウスＬＯＸＬ１のクローニング
マウスＬＯＸＬ１遺伝子の全長ｃＤＮＡコード配列（ｃＤＮＡ ３．１５ｋｂｐ；クローン＃ＭＣ２０３２０７（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ＮＭ＿０１０７２９）を、ＣＭＶプロモーターの下流にＤｓＲｅｄ２赤色蛍光レポーターを有する商業的に入手可能な哺乳類発現ベクター（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃａｔ＃６３２４０６）内にクローニングするものとする。ＬＯＸＬ１遺伝子を有するベクター（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１．ＬＯＸＬ１）を増幅し、エンドトキシン除去キットを使用して精製するものとする。
前房の灌流のみによるＬＯＸＬ１のトランスフェクション

ＬＯＸＬ１を有する／有さないプラスミドＤＮＡベクターを、灌流によってマウスの前房にデリバリするものとする。８〜１２週齢（ｗ）のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用するものとする。初めに、最適化実験を実施するものとし、そこでは、空のｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクターをＷＴマウスでのみ灌流させるものとする。続いて、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１．ＬＯＸＬ１をＷＴマウスで灌流させるものとする。様々なパラメータを試験してトランスフェクション効率を最適化するものとするが、そのようなものとしては、以下に限定されないが、灌流された溶液の体積、灌流の速度および持続時間、およびＤＮＡ用量が数ある中でも挙げられる。体積および流速がトランスフェクション効率に影響を与える場合があることから、様々な用量のｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクターおよびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１．ＬＯＸＬ１（０．１〜１０μｇ）を様々な体積（２．５、５、１０、２０μＬのＰＢＳ）中に希釈して、様々な一定流速（０．２５、０．５、１、２、４μＬ／分）で様々な持続時間（３０秒、１、２、４分）にわたって灌流するものとする。さらに持続時間の長い灌流（３０、６０分）も、流速０．２５、０．５および１μＬ／分で実施するものとする。トランスフェクション効率および導入遺伝子の発現を、遺伝子デリバリの２４〜４８時間後にフラット・マウントおよび免疫組織化学（図１８Ａ〜図１８Ｂ）において評価するものとする。
野生型マウスにおけるエレクトロポレーション支援型ＬＯＸＬ１トランスフェクション

灌流のみによる最適なＴＭトランスフェクションのストラテジー（デリバリできるプラスミドＤＮＡの実施例にあるようなｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１およびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１．ＬＯＸＬ１のもの）がＷＴマウスで決定されていれば、エレクトロポレーションの影響下で、このプロトコールを繰り返すものとする。前房での遺伝子の灌流（上記に開示される実施形態によっては、エレクトロポレーションが投与と同時に起こるとはいえ）の直後に、眼をエレクトロポレーションするものとする。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０エレクトロポレータ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州）のピンセット電極（チップまたはパッドの付いた２０Ｇの白金−イリジウム・ループ）を使用して実施するものとする。マウスは、ケタミン／キシラジン／アサプロマジンのカクテルを腹腔内投与して麻酔し、体温加温器の下に横倒しにするものとする。眼瞼を分離し、緩やかな圧力をマウスの眼窩周囲範囲に加えて眼球を僅かに脱出させ、マウス角膜縁領域を露出させて、電極チップ（負極および正極）を、ＴＭ上に重なる強膜と接触させて１８０度離して据えるものとする。電極が正しく配備されたら、フット・ペダルを押し下げて、予め設定されたパラメータに従って電流を印加するものとする。エレクトロポレーションの間、電極−電極の接触を避けるように留意するものとする。

生きたマウスのＴＭのエレクトロポレーション支援型ＬＯＸＬ１トランスフェクションを最適化するプロトコールを決定するものとする。エレクトロポレーションに用いる開始域は、（ａ）電圧５〜８０Ｖ、（ｂ）５〜１０パルス、（ｃ）１〜５ｍｓのパルス持続時間、（ｄ）５０〜１００ｍｓのパルス間隔，（ｅ）１〜３パルス列、および（ｆ）２．５〜２０μＬ中０．１〜１０．０μｇのＤＮＡ濃度とする。トランスフェクション効率は、灌流のみによってトランスフェクションを受けた対照と比較するものとする。他方の灌流されなかった眼および別個体のトランスフェクションされなかったＷＴマウスが、陰性対照としての役割を果たすことになる。電気的に誘導される損傷を組織または細胞が受ける可能性を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって評価するものとする。組み合わせた知見を使用して、エレクトロポレーション・パラメータの微調整をガイドするものとする。

エレクトロポレーション後、マウスは、目覚めて動き出すまで（１〜２時間）、清潔なケージにて暖かい毛布の下で回復させるものとする。人工涙液を５〜１０分おきに角膜に投与して、乾燥を予防する。トランスフェクション効率および導入遺伝子の組織局在は、遺伝子デリバリの２４〜４８時間後に、前眼部のフラット・マウントで免疫組織化学によって評価するものとする。（ａ）ＤＳＲｅｄ２（ベクター）および（ｂ）ＬＯＸＬ１（抗体標識；Ａｌｅｘａ−４８８）の各種蛍光体を、共焦点顕微鏡によって評価し区別するものとする。確立された方法によって、定量的な蛍光のプロファイリングをＴＭで実施するものとする。

発現の寿命をトランスフェクションの１週間後、１ヶ月後、３ヶ月後、および６ヶ月後に評価するものとする。下流の房水流出路（シュレム管、集水チャネル、強膜上静脈）における導入遺伝子の発現を、放射状の組織学的切片で確かめるものとする。
ＬＯＸＬ１欠損マウスにおけるエレクトロポレーション支援型ＬＯＸＬ１トランスフェクション

ＷＴマウスにおけるエレクトロポレーション支援型ＬＯＸＬ１トランスフェクションに最適化されたプロトコールを構築すれば、前房へｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（ベクター対照）および／またはｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１．ＬＯＸＬ１のデリバリした後にエレクトロポレーションすることを含む同じプロトコールを、８〜１２週齢のＬＯＸＬ１^−／−マウスに適用するものとする。ＤＳＲｅｄ２の蛍光強度の定量的なプロファイリングを、ＴＭのホール・マウントおよび免疫組織化学切片で実施して、トランスフェクション効率、導入遺伝子の局在、および発現の寿命を決定するものとする（トランスフェクションの６ヶ月後まで）。ＬＯＸＬ１^−／−マウスのＴＭにおいてＬＯＸＬ１トランスフェクションがＬＯＸＬ１およびトロポエラスチンの発現に及ぼす効果を分析するものとする。細隙灯およびＨ＆Ｅ染色を使用して、遺伝子デリバリおよびエレクトロポレーションの後にＴＭおよび前眼部の炎症が生じる可能性を調べるものとする。

（結果および考察）
この実施例は、目的の治療遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをヒト対象に治療的にデリバリするためのモデルとして、生きたマウスのＴＭにおけるウイルス不含エレクトロポレーション支援型トランスフェクションの有用性を決定するためにデザインされた。段階的なストラテジーによって、プロトコールを最適化することが可能になり、首尾良く導入遺伝子がＴＭで発現されることを、ホール・マウント分析および免疫組織化学によって立証されるように検出できるようになる。有利には、研究のデザインによって、異なる蛍光体の検出および共局在分析に基づき、ベクターとＬＯＸＬ１遺伝子の発現の組織局在を別々に分析することが可能になる。エレクトロポレーションによって、ＴＭのトランスフェクション効率が、前房での遺伝子の灌流によるデリバリのみの効率を超えて増加するようになること、ならびに電極の配置および電場のベクターが導入遺伝子の局在に影響を及ぼすようになることが推定される。万一、トランスフェクション効率を所望よりも低くする場合には、代替のプラスミドＤＮＡベクター、例えば、Ｎ末端での遺伝子挿入の代わりのＣ末端での挿入、異なるプロモーター、または蛍光レポーターのないプラスミドＤＮＡを供試することができる。同様に、必要に応じて、異なる蛍光体（例えばｍＣｈｅｒｒｙ）を有する代替のプラスミドＤＮＡ構築体を利用することができる。ＴＭ細胞は有糸分裂が終了していることから、導入遺伝子の発現は寿命が長いことが予想される。電場のベクターを変えるための電極の配置（例えば角膜縁および眼球後方）など、上で議論された変量を調整して、発現を増加させることができる。また、ＴＭ周縁を取り巻く複数の場所でエレクトロポレーションすることによって、さらに広範な組織での導入遺伝子の発現が促進されることがある。電気的に誘導される組織損傷が起こるか、またはＴＭ細胞の生存率が低減した場合、デリバリされる電圧を低減する必要がないことがある。ＬＯＸＬ１遺伝子およびＬＯＸＬ１−／−マウスを、ＩＯＰの上昇および落屑緑内障に関連のあるヒトＬＯＸＬ１遺伝子の異状のモデルとしてここに選ぶ。この焦点が関わるのは、エレクトロポレーションによってＴＭへの遺伝子デリバリが増強され、分子的な欠陥が組織中で修正されて疾患を予防または治療し得るという概念が支持されるか否かということである。これに続いて、エレクトロポレーションによってデリバリされるＬＯＸＬ１導入遺伝子が、ＬＯＸＬ１欠損マウスにおいてエラスチンの維持を回復させ、緑内障の表現型の発達を予防するか否かについて、研究が実施されることになる。

（実施例２−緑内障を治療するための裸のＤＮＡの線維柱帯網へのデリバリ）
よくある緑内障のバリアントである落屑緑内障（ＸＦＧ）は、不治であり、悪性度の高い視力喪失、激しい眼圧（ＩＯＰ）の変化、およびリジルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）に関連がある。本実施例は、異常なＩＯＰの原因である組織の分子的な欠陥を修正することによる、ＸＦＧからの治癒または長期の緩和を特定することを目的とする。

ウイルスベクターは、動物モデルの組織で遺伝子を効率的にデリバリするために使用されるが、一方で、ヒトの遺伝子療法での使用は、致死性を含めた免疫原性および安全性のリスクにより制限されている。非ウイルス性の裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、これらのリスクを持たないが、使用がさらに簡単である。本明細書に開示されるシステム、方法、およびデバイスは、ヒトの緑内障の遺伝子療法のための安全かつ有効なベクターとしてのｐＤＮＡの使用に関連する。

線維柱帯網（ＴＭ）は、前房の出口に位置する、ＩＯＰの主要な組織調節器であり、組織への遺伝子デリバリの助けとなる場所である。前房水中に堆積した遺伝子は、必然的に、ＴＭを通過して眼から出て行く。ここで、ＴＭ細胞は、貪食性でありかつ有糸分裂の終了した特長を有し、この特長によって、外来性ＤＮＡの内部移行および導入遺伝子の発現の保持が促進されることが予想される。また、ＴＭがこのユニークな場所にあることから、前房の流体力学的灌流に容易にアクセスすること、およびｉｎ ｖｉｖｏの細胞性取り込みを増強する手法であるエレクトロポレーションを適用することが可能になる。上に記載されたように、本出願は、ｐＤＮＡを前房にデリバリした後に、トランスフェクションされた導入遺伝子がＴＭで有効に発現することを開示する。

ＬＯＸＬ１は、弾性線維の架橋および再生に重要な役割を果たし、ＸＦＧに関係がある。公知のＬＯＸＬ１のＳＮＰがどのようにエラスチンに富むＴＭの機能性を攪乱させ、ＩＯＰの上昇の原因となるかは不明である。概念実証研究では、ｐＤＮＡベクターを使用して、生きたＬＯＸＬ１ホモ接合性ノックアウト（ＬＯＸＬ１^−／−）マウスで、前房の流体力学的灌流によって、野生型（ＷＴ）のＬＯＸＬ１遺伝子をデリバリするものとする。遺伝子の欠陥を安全にレスキューし、表現型を変えるか否かを決定するものとする。併行して効能および安全性の研究をヒトのＴＭで実施するものとする。
生きたマウスにおけるｐＤＮＡデリバリの効能

本実施例では、ＬＯＸＬ１−／−マウスにおいて、ｐＤＮＡ媒介性のＬＯＸＬ１導入遺伝子の発現が、エラスチン維持の不全に起因するＴＭの機能欠損をレスキューする能力を検討するものとする。この研究では、ｐＤＮＡ媒介性の遺伝子療法の有効性を立証し、さらにＩＯＰおよびＸＦＧの決定におけるＬＯＸＬ１の役割の理解を確立するものとする。

ｐＤＮＡベースのＷＴおよび変異型のＬＯＸＬ１遺伝子（ヒトＳＮＰ：ｒｓ１０４８６６１（Ｒ１４１Ｌ）およびｒｓ３８２５９４２（Ｇ１５３Ｄ））をＬＯＸＬ１−／−マウスにデリバリするものとする。試験により、以下、トランスフェクションされたＬＯＸＬ１タンパク質を確認するものとする。すなわち、（ａ）組織分布、トランスフェクション効率、発現持続時間、炎症または組織損傷との関連、およびエレクトロポレーション後の発現、（ｂ）持続される発現が弾性線維に経時で影響を及ぼすか否か、（ｃ）表現型に及ぼす効果（臨床上の特長、ＩＯＰ、流出能）を、ＬＯＸＬ１−／−マウスで経時で調べるものとする。

（ヒト線維柱帯網へのｐＤＮＡのターゲティング）
この試験によって、ヒトの緑内障遺伝子療法に用いるヒトＴＭへのｐＤＮＡベースの遺伝子デリバリを検討するものとする。それによって、ヒトＴＭへのｐＤＮＡベースの遺伝子デリバリの効能および安全性を確立し、マウス試験のヒトへの適用性を確認するものとする。ＷＴのＬＯＸＬ１がタグ化されたｐＤＮＡを、ｅｘ ｖｉｖｏ器官系にてヒトの生存ＴＭへ灌流でデリバリした後、ｉｎ ｓｉｔｕ２光子イメージングを行い、以下、トランスフェクションされたＬＯＸＬ１タンパク質を決定するものとする。すなわち、（ａ）ヒトＴＭ内での分布、トランスフェクション効率、発現持続時間、およびエレクトロポレーション後の発現、および（ｂ）正しく有効かつ安全なタンパク質の発現の反映である、エラスチンとの正しい共局在性である。

ＸＦＧは、本明細書に開示される非ウイルス性の緑内障遺伝子療法のデバイスおよび方法を試験するために、少なくとも以下の理由により、魅力のある疾患モデルである。すなわち、（ａ）ＸＦＧはありふれたものであり、世界中の開放隅角緑内障（ＯＡＧ）の２５％の原因であること、（ｂ）ＸＦＧは初期のＯＡＧよりも侵襲性が高く治療が難しく、それゆえ治療法を見つけるかまたは長期間の有効な緩和をもたらすことが重要であること、（ｃ）ＬＯＸＬ１のＳＮＰの強い関連性は多様な集団を越えて再現性があるが、その生物学的基盤は未知であり、明らかにすることが求められていること、および（ｄ）関連の変異型ＬＯＸＬ１マウスが利用可能であること、（ｅ）ヒトでのウイルスベクターの使用に伴う重大な安全性の懸念が残っており、より安全な代替物を見つけることが重要であること、である。

ＬＯＸＬ１は、エラスチンの架橋を触媒し、弾性線維を維持する。ＸＦＧでは、弾性線維が異常である証拠が、（ａ）ＬＯＸＬ１エピトープ、ミクロフィブリル・エピトープ、およびエラスチン・エピトープを含有する、眼の不溶堆積物、（ｂ）弾性のある水晶体小帯の自然発生的な崩壊、（ｃ）強膜および篩骨篩板の異常、（ｄ）ブルッフ膜の脆弱性、および（ｅ）心血管および脳血管の疾患に起因する血管の異常、として見出されている。弾性線維の異常がどのようにＩＯＰの調節不全に寄与するのかは不明であるが、理解は重要である。トロポエラスチンはエラスチンの単量体形であり、それらの重合によって、フィブリリン骨格上に弾性のミクロフィブリルが形成される。フィブリン−５は、ＬＯＸＬ１とトロポエラスチンの両方に結合してそれらをフィブリリンと近接させ（図１９）、その結果、ＬＯＸＬ１がエラスチン、フィブリリン、およびフィブリン−５と共局在する。これによって、ＬＯＸＬ１は、弾性ミクロフィブリルの限局的な自己集合、安定化、および再生触媒することが可能になるが、ＬＯＸＬ１の不在または低減によってこのプロセスは途絶される。

ＬＯＸＬ１の機能が不充分であることによって弾性線維の維持および再生の欠陥が生じるものと考えられる。時間と共に、このことによってＴＭの弾力性の欠損、収縮調節機構への応答の不全、およびＩＯＰの上昇が生じる。

ＴＭは、エラスチンに富んだ収縮組織であり、眼から水分の９０％までを排出する。ＴＭの細胞は、精緻な内部の弾性線維システムおよび組織の収縮性を調節する（図２０Ａ〜２０Ｃ）。図２２０Ａは、ＴＭの排水孔を取り巻く弾性線維の２光子自家蛍光評価を図示する。図２０Ｂは、ＴＭ細胞の梁を取り巻くＦ−アクチンを図示する。図２０Ｃは、コラーゲン、エラスチン、およびシュレム管の場所（点線部）の間の物理的な関係を描いた３Ｄモデルを図示する。弾性コンプライアンスおよび収縮トーンを調節することによりもたらされたバランスによって、房水流出耐性およびＩＯＰが動力学的に調節される。本明細書に議論されるような、弾力性／収縮性のバランスに影響を与える遺伝子発現‐正常または異常な‐は、流出耐性およびＩＯＰに影響を与えることになろう。そのため、ＸＦＧでは、ＴＭにおける細胞の異常なＬＯＸＬ１発現によって、弾性線維のホメオスタシスが危ういものとなりかねず、収縮力に対する組織コンプアイアンスが損なわれて流出耐性およびＩＯＰの調節不全が引き起こされかねない。しかし、正常なＬＯＸＬ１発現を取り戻すことによって、本明細書に開示される複数の方法の結果のように、さらに多くの生理的なバランスおよびＩＯＰを回復させることができよう。

上に記載されたように、本明細書に開示されるようなプラスミドベクターの使用は、少なくとも部分的には、その優れた安全性プロファイルに基づく。免疫原性は稀であるため、導入遺伝子の発現の持続時間を制限しないはずである。ゲノムの組み込みは比較的効率が悪いことから、発がんは制限されることが予想される。プラスミドの遺伝子パッケージング能は重要であり、この能力によって大きなゲノムＤＮＡ断片および複数のタンパク質コード体（ポリシストロニックな発現カセット）であっても収容される。ごく最近では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターが、アデノウイルスなどのベクターよりも有害事象が少なく炎症性が低い、網膜の遺伝子療法に適用されている。とはいえ、ＡＡＶベクターは、免疫原性能を保持し、発がんなど長期間にわたるリスクを有し、大きな遺伝子を収容することができない。プラスミドの他の利点は、その簡単な造り、増幅の容易さ、および室温での安定性であり、それらにより保管および操作のためのメリットがもたらされることから、プラスミドは臨床で広く使用された。ｐＤＮＡは、肝臓、筋骨格系、および心血管系などの器官への遺伝子デリバリに用いるのに提案されている。安全性の課題は、数多くの心血管の臨床試験では顕著に少ないものとなっており、ＦＤＡはヒトでの使用の認可さえもしている。

ＴＭは、ｐＤＮＡベースの遺伝子デリバリのためのユニークな組織標的である。それは前房からの水分のための出口に位置し、したがって、水分中にデリバリされる遺伝子は、通常の流出の間は必然的にＴＭに直面する。ＴＭ細胞へのこの直接的な経路によって、酵素による分解、血清成分との相互作用、血管から溢出してＥＣＭを通って遊走する必要性など、血中への全身性デリバリの問題が回避される。しかし、上に記載されたように、他の投与経路も実施形態によっては使用されてもよい。

プラスミドのデリバリは、他の組織区画を用いて成功している。すなわち、前房の角膜内皮細胞、肝類洞内の肝細胞への静脈内デリバリ、唾液腺房細胞への逆行性の腺管デリバリ、ならびに筋肉の線維および細胞をトランスフェクションするための筋肉の筋膜区画内への注射である。隔離された組織区画内では、細胞は、ウイルスベクターがなくても、流体力学的灌流下ではさらに効率良くトランスフェクションされる。本明細書に開示される複数の実施形態では、灌流は、物理的および一過的に形質膜の障壁を乗り越えて、外来性ＤＮＡのサイトゾル内への進入を可能にする。例として、流体力学的灌流による肝細胞のトランスフェクション効率は、７０％の高さにも達することがある。貪食性であることなど、ＴＭ細胞のいくつかの特長が、裸のｓｉＲＮＡの灌流で起こるように、トランスフェクションの機会をさらに増加させることがある。核に輸送されれば、ｐＤＮＡは、活発に分裂している細胞よりもＴＭなどの有糸分裂が終了した細胞で、発現を存続させ持続する傾向が強い。有糸分裂が終了した組織によっては、ｐＤＮＡ媒介性の発現の発現は、少なくとも１年半続く。眼表面の直下にあるＴＭの配置は、細胞取り込みを増強するための物理的な手法であるエレクトロポレーションに好都合である。外面的には、ＴＭは、強膜表面の電極の配置の数ミクロン内にある。内面的には、それは房水に浸っており、その内部へ、角膜を貫くルートによってｐＤＮＡを容易にかつ最小の侵襲性でデリバリする。生理的な塩水溶液は、膜を貫く電圧の発生を促進する導電媒質であり、その電圧によって、外来性ＤＮＡに対する膜透過性が一過的に増加する

上に記載されたように、緑内障の病態形成および療法の研究では、ＴＭと房水流出耐性およびＩＯＰを調節するその分子機構とを精査する可能性が提示されている。ＴＭを深く追究するためのこのプラットフォームによって、ヒト緑内障に関連する遺伝子操作、表現型の観察、および橋渡し（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）研究が可能となる。出生時にエラスチンを欠損しているフィブリリンおよびフィブリン−５の変異型マウスとは異なり、若齢のＬＯＸＬ１^−／−マウス（本明細書に議論される実験で使用されるかまたは使用することを提案されている）の弾性フィブリルは正常である。しかし、老齢のＬＯＸＬ１^−／−マウスでは、成熟し組織化された弾性フィブリルの代わりに、重合の少ない未熟なエラスチンが見られる。器官の脱出などの異常は、組織の支持が不全であるために起こる。このように、ＬＯＸＬ１の欠損は、エラスチンの維持および再生を不全とし、加齢に伴い異常な表現型を展開させる。同様のストレスが、生理的なＩＯＰを支持するエラスチンに富んだＴＭにかけられる。若齢のＬＯＸＬ１^−／−マウスでは高いＩＯＰが報告されていない一方で、ＬＯＸＬ１^＋／−マウスのＩＯＰが加齢と共に上がることが決定されている（図２５）。このシナリオは、加齢に関連するＸＦＧを模しており、このＸＦＧは、ＬＯＸＬ１の機能の不充分さが十分早期に修正された場合に予防可能となりうるものである。ＴＭのＬＯＸＬ１の異常が後期に修正されたとしても、比較的生理的な弾性線維の構造および機能をレスキューすることは依然として可能である場合がある。ＬＯＸＬ１^−／−マウスにおける有効なｐＤＮＡベースの遺伝子デリバリによって、これらの可能性を供試するための簡単かつ有効な選択肢が提供される。また本明細書に詳説および開示されるのは、ｐＤＮＡデリバリを試験するためのヒトのＴＭ組織ベースのモデルである。最先端の２光子励起蛍光イメージング（ＴＰＥＦ）および深部組織光学切片法によって、分子的な事象のｉｎ ｓｉｔｕでの可視化および分析が可能になる。

この試験は、ｉｎ ｖｉｖｏのｐＤＮＡデリバリが遺伝子の欠陥による機能の欠失を回復させるか否かを焦点としている。この結論に向けて、ＬＯＸＬ１^−／−マウスは、エレクトロポレーションを用いておよび用いずに、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｐＤＮＡの流体力学的灌流によって、ＷＴおよび変異型のＬＯＸＬ１遺伝子の形態を受けるものとする。試験は、（ａ）トランスフェクション効率、発現の持続時間、および組織分布の特徴を明らかにすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴＭでのｐＤＮＡトランスフェクションの実現性を探るために、（ｂ）炎症、灌流に関連する損傷、正しいＥＣＭターゲティング、および弾性線維の再組織化の可能性についてアッセイに反映されるような、ＬＯＸＬ１導入遺伝子の安全性および機能を決定するために、（ｃ）若齢のＬＯＸＬ１^−／−マウスにおけるＷＴのＬＯＸＬ１のＴＭでの遺伝子デリバリが典型的なＬＯＸＬ１^−／−表現型を予防するか否かを決定するために、デザインされる。

目的の遺伝子を含むｐＤＮＡは、確立された手法を用いて、生きたＬＯＸＬ１^−／−マウスの前房内に灌流でデリバリするものとする。初めに、ＬＯＸＬ１のない空のｐＤＮＡベクター（ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰ；ＯｒｉＧｅｎｅカタログ番号ＰＳ１０００１０）を使用して、最適な流体力学的灌流のためのパラメータを決定するものとする。増幅し、エンドトキシン不含プラスミド・プレップ・キットを用いて精製した後、異なる濃度のｐＤＮＡ（０．１〜１μｇ／５μＬ）を、生理的に妥当な２０〜３５ｍｍＨｇの範囲の一定の灌流圧力（上に記載されたように、実施形態に応じて他の圧力も使用することができるが）に見合った流速で、灌流するものとする。特定の患者には別の濃度および／または灌流圧力が適用可能である場合があることが認識されよう。灌流の持続時間を計算して、マウスの前房の体積×１〜３の体積（〜５μＬ）をデリバリすることを可能にするものとする。最適なプロトコールが決定したら、これを使用して（ａ）ＷＴのＬＯＸＬ１（ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰ−ＬＯＸＬ１；ＮＭ＿００５５７６、ＯｒｉＧｅｎｅカタログ番号ＲＧ２０９８３０）を灌流するものとする。ＰＢＳのみまたはＧＦＰレポーターを有した空のｐＤＮＡを陰性対照として役立てるものとする。ＬＯＸＬ１遺伝子を有したウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ｍＧＦＰ−ＬＯＸＬ１；ＯｒｉＧｅｎｅカタログ番号ＭＲ２０９３６１Ｌ２）を陽性対照として役立てるものとする。

エレクトロポレーションは、最適な流体力学的灌流のプロトコールが決定したら実施するものとする。それは、ｐＤＮＡの灌流の間に、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０エレクトロポレータ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州）のピンセット電極を使用して実施するものとする。電極チップ（陽極および陰極）を、ＴＭの上に重なっている強膜から１８０度離して据えるものとする。本明細書に開示される通りとはいえ、他の配置を進んで使用してもよい。エレクトロポレーション支援型ＴＭトランスフェクションを最適化するプロトコールを（ａ）８０Ｖ、（ｂ）繰り返しを伴う５パルス列、（ｃ）１０ｍｓのパルス持続時間、および（ｄ）１００ｍｓのパルス間隔で開始して決定するものとする。（ｉ）流体力学的デリバリのみおよび（ｉｉ）エレクトロポレーションを用いた後の、組織アッセイを比較するものとする（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。図２１Ａは、フラット・マウントにしたマウス線維柱帯網細胞から収集したデータを図示し、この細胞は、流体力学的灌流のみによってデリバリされたＧＦＰを発現している。図２１Ｂは、ＧＦＰ遺伝子を持つプラスミドＤＮＡのデリバリが灌流とエレクトロポレーションとを組み合わせて行われた際に、ＧＦＰ発現が増強されたことを図示する。エレクトロポレーションのパラメータは、個々の実験の知見および本明細書に記された開示に基づき、容易に微調整することができる。

ｐＤＮＡデリバリの１週間後、動物を麻酔し、眼を摘出してフラット・マウント、凍結切片の作製、および免疫組織化学（ＩＨＣ）に用い、以下を解析するものとする。（１）組織分布：前眼部組織［例えばＴＭ（図２２Ａ〜図２２Ｃ、これらはマウスの隅角構造におけるＧＦＰの発現を図示しており、プラスミドを灌流デリバリした後の放射状切片（２２Ｂ）がビヒクル対照（２２Ａ）と比較されており、細胞の詳細なクローズアップが２２Ｃに示されている））、毛様体、レンズ、角膜］および遠位の流出経路（例えばシュレム管、集水チャネル、強膜上静脈内皮）におけるＧＦＰの発現に基づく。（２）トランスフェクション効率：（ｉ）ヘキストで核を標識したＩＨＣの切片における、ＧＦＰを担持するＴＭ細胞のパーセント；および（ｉｉ）前眼部のフラット・マウント調製物における、ＧＦＰを担持するＴＭ周縁のパーセント。（３）発現持続時間：繰り返しの可能なトランスジェニックタンパク質の発現が確認されたら、ｐＤＮＡデリバリの３０日後、６０日後、および９０日後にＩＨＣを繰り返すものとし、標示されるよりも長期である場合には、ウェスタン・ブロットおよび定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による確認を補う。

導入遺伝子の発現の安全性および有効性を検討するために、（ａ）充血と前房の発赤および細胞について、細隙灯検査を実施するものとし、（ｂ）ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ；構造の崩壊、組織の熱傷、炎症細胞）およびヘキスト標識（細胞の欠失）の後、パラフィン切片で、灌流に関連する損傷を探索するものとし、（ｃ）カルセインＡＭ標識化の後に、新鮮な全眼のＴＰＥＦ分析（細胞生存率分析）、（ｄ）血液房水関門の破綻または炎症の指標として総タンパク質を測定するために、複数のマウス（５〜１０頭）からプールした房水試料にブラッドフォード・アッセイを行った。弾性線維の組織化に及ぼす効果は、蛍光顕微鏡によるＨ＆Ｅ切片の試験によって評価し、定量的強度分析、およびＶｏｅｒｈｏｆｆ’ｓ ｖｏｎ Ｇｉｅｓｓｏｎ染色、および比較のために抗体標識トロポエラスチンによって、エラスチンに関連するエオシンの蛍光を可視化および分析した（例えば図２３を参照されたいが、この図は、エオシン標識された線維柱帯網の線維を示す）。

表現型も評価するものとし、その評価は例えば、流出能、耐性、および収縮性に対する応答性を導入遺伝子のトランスフェクションのパーセントに比較して検討すること、ＩＯＰの測定、および前眼部のデジタル撮影を用いる細隙灯検査によって行い、ｐＤＮＡデリバリの前後に実施する。発現の持続時間に関する知見によって、長期の表現型の観察がガイドされる。表現型の変化の検討は、デリバリ後６〜１２ヶ月までの間実施するものとする。上に記載されたように、実施形態によっては、レポーター・エレメントまたはマーカーを採用するが、そのような実施形態が所望の効能よりも低いものを実現した場合、代替のアプローチを採用することができる。例えば、代替のプラスミドベクターのデザイン（例えば、Ｎ末端での遺伝子挿入の代わりのＣ末端での挿入、異なるプロモーター（例えばＭＩＥｍＣＭＶ）、および／または蛍光タンパク質レポーターのないｐＤＮＡを供試することができ、例えば図２４Ａ〜図２４Ｂを参照されたい）。図２４Ａは、プラスミドＤＮＡの灌流後のＬＯＸＬ１−／−マウスの線維柱帯網細胞における、エラスチンの凝集体に囲まれたＬＯＸＬ１の発現を図示する（ＧＦＰではなく抗体標識ＬＯＸＬ１−ＤＤＫを使用）。図２４Ｂは、野生型陰性対照マウスにおけるフィブリル状エラスチンを図示する。

有効なｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰ−ＬＯＸＬ１導入遺伝子の発現があれば、ＧＦＰ蛍光レポーターは、（図２２および図２４に示されるデータによって立証されるように）ＴＭでは細胞内に、およびＥＣＭに、エラスチンと共局在して容易に検出されるはずである。ＷＴのエラスチン染色がフィブリル状のパターンを有する一方で、ＬＯＸＬ１−／−のエラスチン染色は凝集を示す（図２４）。ＷＴの導入遺伝子の発現が持続しているＬＯＸＬ１−／−マウスは、時間と共にフィブリル状のエラスチンのパターンをより多く進展させることがあり、このことはエラスチンの回復を反映する。十分早期にトランスフェクションされる場合、ＬＯＸＬ１−／−エラスチンの解体が全体的に予防されることがある。房水関門の破綻やレンズの混濁など、ＬＯＸＬ１抗体で標識される欠損も、改善されることがある。抗体によるＬＯＸＬ１の標識はまた、ＬＯＸＬ１−／−マウスにおいて、トランスフェクションされたトランスジェニックＬＯＸＬ１と例外なく共局在するはずであり、このことはトランスジェニックＬＯＸＬ１のみが存在することを反映する。しかし、ＷＴマウスでは、内在性のＬＯＸＬ１が、トランスジェニックＬＯＸＬ１と共局在しない画分として検出可能であるはずである。それゆえ、内在性およびトランスジェニックのＬＯＸＬ１は区別されることがある。これらのマウスの齢に伴い、徐々に流出能が不全となることが予想されるが、それはおそらくは、弾力性の不全によってＴＭのコンプライアンスが低減するためである。ＷＴのＬＯＸＬ１の発現が回復される場合は、しかしながら、比較的生理的な応答が回復する場合がある。ＬＯＸＬ１−／−マウスでは、齢と共にＩＯＰをさらに高く進展することがあり（図２５、この図は、ヘテロ接合性のＬＯＸＬマウスの眼圧が齢と共に３０％まで増加することを示す）、これはカウンターパートで予想される眼圧を超えているが、ＷＴのＬＯＸＬ１の発現を復活させることによって、このＩＯＰの上昇が鈍ることがある。逆に、ＬＯＸＬ１−／−マウスにおける変異型ＬＯＸＬ１導入遺伝子の発現によって、ヒトＸＦＧに類似した表現型が生じる可能性があり、そのような表現型としては、未熟な不溶のエラスチンが眼に堆積するなどがあり、これはＬＯＸＬ１−／−マウスでは特段には見られないものである。導入遺伝子の発現が持続することは、これらの表現型の変化を駆り立てるのに必要となろう。しかし、導入遺伝子の発現が一過的または所望よりも短期である場合、上記に開示されるものなどの代替のステップ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ｐＤＮＡデリバリを繰り返すか、またはプラスミドの改変（例えばＤＮＡ核ターゲティング配列を含有させる；非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含量を低減させることによって自然免疫応答が低減する。上に記載されたように、一実施形態では、理想的な発現の持続時間は数ヶ月（例えば３から６ヶ月）である。導入遺伝子の発現が不定であることは、治癒のための概念としては魅力がある一方で、治療プロセスにわたっていくらかの制御をもたらすには、より発現が有限であることが望ましい。Ｉｎ ｖｉｖｏでの強膜を貫くＴＰＥＦを経時試験に適用して、トランスフェクションされた導入遺伝子の発現の持続時間を検証するものとする。実施形態によっては、ＴＰＥＦの知見を、ＩＨＣ、ウェスタン・ブロット、およびｑＰＣＲによってバリデーションするものとする。

いくつかの実施形態によれば、プラスミドを非ウイルスベクターとして使用して、遺伝子をヒトのＴＭに効率良くデリバリし、それによって簡単かつ安全なヒト緑内障の遺伝子療法の選択肢を提供してもよい。本明細書に開示される試験によって、ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトＴＭへのｐＤＮＡベースの遺伝子デリバリの効率、有効性、および安全性が確立されよう。また提供されるのは、ヒト組織ベースのモデルであり、そこでは、生きたＴＭがｉｎ ｓｉｔｕでその本来の三次元構造を保持し、ＴＰＥＦ深部組織光学切片法によってイメージングされる。複数の実施形態では、人工の前房を、灌流試験のために再構築するものとする。

例によっては、無傷かつ生存可能な房水排水管を含有する死後のヒトのドナーの角強膜を、ＶｉｓｉｏｎＳｈａｒｅから購入するものとする。初めに、内部のアプローチによるＴＰＥＦ硝子体内イメージングを実施して、ＴＭ細胞の生存率を分析するものとする。前房の再構築のために、角強膜の周縁を基板の上に留めるものとする（図２６Ａ）。基板は２つの注入口を有し、それらは作り付けのチャネルによってルアー・ロック・ハブに接続され、ハブは外部の管に取り付けられている。図２６Ｂに示されるように、一方の注入口はマイクロシリンジ・ポンプおよび灌流装置に、他方は圧力変換器に接続している。灌流装置は、低グルコースＤＭＥＭ、ｐＨ７．４で満たし、ウォーター・ジャケット・インキュベータに３７℃、５％ＣＯ２で格納するものとする。圧力および流速をリアルタイムでサンプリングしながら、ｐＤＮＡを人工前房内にデリバリするものとする。

エレクトロポレーションを伴う補足的な流体力学的デリバリだけでなく、ｐＤＮＡのヒトＴＭへの流体力学的デリバリも評価するものとする。例えば、（ａ）ｅｘ ｖｉｖｏの流体力学的灌流デリバリを評価するものとし、この評価を、ヒト組織ベースの系において（ａ）空のｐＤＮＡベクター、および（ｂ）ＷＴのＬＯＸＬ１を有したｐＤＮＡを試験および最適化することによって行う。これらの最初の試験は、トランスフェクション効率、およびタンパク質の正しさ、奏功性および安全性に焦点を合わせるものとし、エラスチンと会合する程度を分析することによって行う。ＤＭＥＭ／ＧＦＰを有した空のｐＤＮＡを陰性対照とし、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ｍＧＦＰ−ＬＯＸＬ１を陽性対照とする。また、評価するのは、エレクトロポレーション後の組織、流出能および耐性であり、さらに長期の観察がｒ７〜１４日にわたって行われることを除く（最大２８日）。その際に、生存性の継続を生体内で検証することと組み合わせるものとする。エレクトロポレーションを使用してプラスミドＤＮＡをデリバリした際に、初めのデータは発現の増強を示す。代表的なデータを図２７Ａ〜図２７Ｄに示す。図２７Ａでは、灌流のみを介したデリバリの１週間後のヒト線維柱帯網におけるプラスミドＤＮＡの発現（ＤＳＲｅｄ２）を選んでいる。図２７Ｂは、２７Ａに図示された場所から１８０°離れたプラスミドＤＮＡの発現（さらにＤＳＲｅｄ２も）を図示するが、ここでは、エレクトロポレーションを使用してプラスミドＤＮＡがデリバリされている。図２７Ａおよび図２７Ｂは、露光下では一致し、発現の強度の増加は、エレクトロポレーションを使用した際にプラスミドＤＮＡのデリバリの度合いがより大きなものとなることを示している。図２７Ｃおよび図２７Ｄは、陰性対照の線維柱帯網細胞の２光子細胞イメージングを図示する。

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語が本明細書に使用される際には、特段明確に規定されない限り、複数の指示対象を含むことが認識されよう。それゆえ、例えば、「ａｎ薬剤」という言及は、２つまたはそれ以上の薬剤を含むなどである。本明細書に使用されるような語「ｏｒ」などの用語は、特定の一覧にある任意の１つのメンバーを意味し、その一覧のメンバーの任意の組合せを含む。

この書面の記載および請求項を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの語のバリエーションは、「含むがこれらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、構成物、整数、またはステップを除外することを意図するものではない。

上記に開示される実施形態の具体的な特長および態様の様々な組合せまたはサブコンビネーションがなされ、依然として１つまたは複数の本発明内にある場合があることが想定される。さらに、一実施形態に関連する任意の特定の特長、態様、方法、特性、特徴、質、属性、要素などに関する本明細書の開示は、本明細書に規定される他の全ての実施形態で使用することができる。したがって、開示される発明に関する様々なモードを形成するために、開示される実施形態の様々な特長および態様を、互いに組み合わせるかまたは置き換えることができることが理解されるべきである。それゆえ、本明細書に開示される本発明の範囲が、上に記載された特定の開示される実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明が様々な改変、および代替の形態を許容する一方で、それらの具体的な実施例が図面に示されており、本明細書に詳細に記載される。しかしながら、理解されるべきは、本発明が、開示される特定の形態または方法に限定されることはないが、それとは逆に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範疇にある、あらゆる改変、等価物、および代替物をカバーするものとなるということである。本明細書に開示される任意の方法は、説明された順番で実施される必要はない。本明細書に開示される方法は、実践者の取るある種の動作を含むが、それらの動作に関する任意の第三者の指示を、明確にまたは暗示でのどちらかで含むこともできる。例えば、「ヒスタミンを投与すること」などの動作は、「ヒスタミンの投与を指示すること」を含む。また、本明細書に開示される範囲は、任意のおよび全ての重複、部分範囲、およびそれらの組合せを包含する。「まで」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「よりも小さい」、「の間」などの言葉は、規定された数を含む。「約」や「およそ」などの用語の先立つ数は、規定された数を含む。例えば、「約３ｍｍ」は「３ｍｍ」を含む。

Claims (18)

1. 少なくとも１つの正電極が配備されている第１のアーチ状の筐体、
   少なくとも１つの負電極が配備されている第２のアーチ状の筐体、
   前記第１および第２のアーチ状の筐体は、単一の平面上で、所望の寸法の単一の卵形の外周の少なくとも一部を生じるように互いに調整が可能であり、前記所望の寸法は、対象の眼の外面の形状に一致し、
   並びに
   前記対象の眼の前房に治療剤をデリバリするように構成される第１のシリンジ、及び
   前記対象の眼の前房から房水を引き抜くように構成される第２のシリンジ、を含む、注射システム、
   を含む、電場を発生し眼の標的組織に印加するためのデバイス。
2. 前記第１のアーチ状の筐体は、複数の正電極を含み、前記第２のアーチ状の筐体は、複数の負電極を含む、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記複数の正電極および前記複数の負電極は、数が等しい、請求項２に記載のデバイス。
4. 特定の眼の標的組織の電場を印加する間に作動される前記複数の正電極および負電極のパーセンテージに関連するユーザ入力を受け取るように構成される、制御モジュールをさらに含む、請求項２に記載のデバイス。
5. 前記デバイスは、前記対象の眼の線維柱帯網に焦点を合わせた電場を印加するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記デバイスは、前記対照の眼の毛様体に焦点を合わせた電場を印加するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
7. 前記前房の眼圧を評価するように構成される圧力変換器をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
8. 前記治療剤のデリバリの体積、濃度、速度、頻度、または圧力のうち１つまたは複数が、前記評価された眼圧に基づき選択される、請求項９に記載のデバイス。
9. 前記治療剤を約１０から約１０００マイクロリットルの体積で．デリバリするように構成される、請求項７に記載のデバイス。
10. 前記引き抜かれた房水の体積は、前記デリバリされた体積と等しい、請求項７に記載のデバイス。
11. 前記房水の引き抜きは、前記治療剤のデリバリの前に実施される、請求項７に記載のデバイス。
12. 前記デリバリおよび引き抜きは、２回と１０回の間実施される、請求項７に記載のデバイス。
13. 前記治療剤の濃度は、１ミリリットル当たり核酸約１０マイクログラムから１ミリリットル当たり５０００マイクログラムの間である、請求項７に記載のデバイス。
14. 前記デバイスは、１分当たり約０．１マイクロリットルと１分当たり約１００マイクロリットルの間の速度で、前記治療剤をデリバリするように構成される、請求項７に記載のデバイス。
15. 前記治療剤は、４週間毎に１回と２年毎に１回の間の頻度でデリバリされる、請求項７に記載のデバイス。
16. 水銀柱における約１０と約４０ｍｍの間の圧力で、前記治療剤をデリバリするように構成される、請求項７に記載のデバイス。
17. 前記治療剤は、リジルオキシダーゼ様１（ＬＯＸＬ１）、ＣＹＰ１Ｂ１、ミオシリン、ＴＧＦ−ベータ潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）、プロスタグランジンＦ合成酵素、Ｃ３転移酵素、カルデスモンまたはそれらのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のデバイス。
18. 前記眼の標的組織は、線維柱帯網であり、前記電場は、１００ｍＶと１００Ｖとの間の電圧で印加され、前記電場は、１パルスと２０パルスの間でパルス出力され、前記パルスは、１パルス当たり０．５ミリ秒と１０ミリ秒の間の持続時間で印加され、前記パルスは、約２０ミリ秒から１５０ミリ秒の間の間隔で隔てられている、前述の請求項のいずれか１項に記載のデバイス。

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