CN104288780A - Gfp-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种GFP-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用。本发明的制药应用为感音神经性耳聋和遗传性耳聋的基因治疗提供了安全、高效的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种GFP-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用
背景技术
根据世界卫生组织公布的数据，全世界中度和重度耳聋的患者有2.5亿。据2006年我国第二次残疾人抽样调查显示，我国听力残疾人已达2780万，并且还在不断增加，我国卫生部2000年公布的调查结果显示，感音神经性聋约占耳聋患者的63％。由于内耳毛细胞和螺旋神经的损伤修复和自我再生能力的缺乏，使得毛细胞再生的研究至关重要，近期有报道内耳支持细胞表达Atoh1基因，能使得支持细胞转分化为毛细胞，但此基因的表达是以腺病毒为载体，而腺病毒因为其毒性和整合宿主基因的风险只是限于动物实验，不能被用于人体实验。其他的载体如腺相关病毒等，虽然毒性较腺病毒小，但仍然具有整合宿主细胞的风险。每1000个新生儿中就有1名遗传性耳聋患儿，上百种基因突变可引起遗传性耳聋，目前没有治疗方法。阻碍其治疗的一大障碍也是缺乏安全、有效的载体和矫正产物，如果直接以各种矫正基因进行治疗，基因会长期整合在宿主细胞，会带来基因污染如基因突变、肿瘤以及其他致命性潜在风险。目前，急需要一种安全、高效的载体。并且，理想的治疗产物也应当为基因产物—蛋白质。
蛋白质以其安全性被认为理想的载体。并且蛋白质在体内发生作用后会被降解，也符合基因治疗的要求。但单纯的蛋白质在体内实验中转染效率极其低，从而限制了其应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供GFP-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用。
本发明提供GFP-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用。
本发明中，所述GFP-30蛋白质带负电荷，脂质体带正电荷，两者结合后可直接进入靶细胞发挥作用。
本发明中，GFP-30蛋白质和脂质体制备的治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物可以采用注射用药，其通过纳升级的显微导入系统，以显微操作系统精确的控制导入量和导入速度，显微手术注射蛋白质药物于新生小鼠的内耳发挥作用。
本发明中，GFP-30蛋白质和脂质体制备的治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物进入细胞核，不重组宿主细胞的基因，可以避免以往的腺病毒、腺相关病毒的载体带来的风险，而此风险正是如今限制其应用于临床的主要原因。
本发明中，GFP-30蛋白质和脂质体用于制备毛细胞再生关键基因如Atoh1的蛋白质药物或药物组合物，使得内耳的感觉细胞(支持细胞)转分化为毛细胞，从而使得毛细胞再生，治疗感音神经性耳聋。
本发明的有益效果在于：
(1)GFP-30蛋白质在细胞中是一过性的表达，正符合细胞的生理要求，其发挥作用后会自然降解掉，从而避免目前研究的直接以基因进行干预、整合宿主基因带来的潜在风险，符合临床的治疗要求，是临床基因治疗理想的载体；
(2)GFP-30蛋白质与脂质体结合制备得到的蛋白质药物能进入细胞核安全、高效的发挥作用，从而可以避免目前传统方法如以各种病毒为载体可能引起的基因污染如基因突变、肿瘤以及其他致命性潜在风险。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。考虑到篇幅有限，在此不再一一赘述。
附图说明
图1：以纳升级的显微操作系统对新生鼠耳蜗中阶路径注射转染GFP-30-Cre蛋白质。A：注射前的出生后1天的新生鼠。B：出生后1天的新生鼠经耳蜗中阶注射GFP-30-Cre蛋白质，黑色箭头示白色耳环，白色箭头示镫骨动脉，白色箭形示正在注射的玻璃微电极。C：术后的新生鼠，黑色箭头示右侧耳后切口已缝合，小鼠正常苏醒。
图2：GFP-30-Cre蛋白质和脂质体对Td-Tomato转基因鼠内耳的作用图示；图中箭头为Td-Tomato阳性的外毛细胞，证明GFP-30-Cre蛋白质成功进入细胞核发挥作用。其中：Myosin7a为内耳毛细胞标记抗体，Sox2为内耳支持细胞标记抗体，DAPI为细胞核标记抗体，TdT表示细胞Td-Tomato阳性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中，我们选择将GFP-30蛋白质与常用的的Cre蛋白质结合，以Td-Tomato转基因鼠为模型来测试。将来的蛋白质药物制备，可以把GFP-30蛋白和相对应的治疗蛋白质如Atoh1结合，再与脂质体结合来治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋。
本发明所采用的实验动物和材料，其中：
本发明采用的Td-Tomato鼠购自美国的jackson lab。myosin VIIa抗体购于Proteus Biosciences公司。Sox2抗体购于Abcam公司。
实施例1
一、动物分组和GFP-30-Cre蛋白质的制备
将Td-Tomato鼠分为GFP-30-Cre蛋白质和脂质体结合组和单纯的脂质体注射组，每组分别8只。GFP-30蛋白质带负电荷，Cre蛋白质带正电荷，两者结合后仍带负电荷。
二、GFP-30-Cre蛋白质和脂质体结合
GFP-3-Cre蛋白质原始浓度为225μM,以Optimem稀释5倍后，按1:1(体积比(v/v)，)的比例和脂质体RNA iMax或脂质体2000混合，常温下混合30分钟后进行注射。
三、内耳显微注射
1、所有手术器械经高温高压消毒后烘干；
2、新生鼠采用冰麻，麻醉后，术区以70％酒精消毒；
3、取左侧卧位，在手术显微镜下，以显微剪于距耳后沟1mm处剪开皮肤；
4、皮下组织稍向两侧分离后，以微型动物撑开器撑开皮肤，即可见到胸锁乳突肌，稍向下分离下颌下腺后可见面神经；
5、暴露镫骨动脉和白色耳环，轻轻挑开少许覆盖在耳蜗侧壁靠近镫骨动脉的膜性组织，暴露耳蜗；
6、以已连接玻璃微电极的纳升级显微操作系统吸取约400nLGFP-30-Cre蛋白质和脂质体结合体或单纯的脂质体；
7、以连接的玻璃微电极尖端轻轻刺破耳蜗(玻璃微电极尖端的大小约为15-20μm)，以3nl/sec的速度注射，共注射约200nL；
8、注射完毕后停留约1分钟后拔出玻璃微电极尖，把耳蜗侧壁的膜性组织复位，缝合切口；
9、消毒后迅速把小鼠置于37℃保温袋复温，待其苏醒(见图1)。
四、内耳组织的获取和免疫组化染色(下面涉及的溶液浓度百分比以及其它配比未特别说明，均为体积比)
术后第5、10天处死动物，迅速取出听泡，于解剖显微镜下暴露耳蜗，然后将耳蜗置于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中4℃避光固定过夜，10天组的标本则于10％EDTA脱钙2天，之后在解剖显微镜下分离出基底膜，在荧光显微镜下观察有无Td-Tomato的表达。具体免疫组化染色方法采用免疫双标染色，具体如下：
1、取出固定后标本，使用0.01M PBS漂洗5分钟×3次；
2、使用含10％驴血清，1％BSA，及含0.1％Triton的0.01M PBS室温下封闭30分钟；
3、加入一抗：
1:300 Rabbit anti-Myo7A或1:100 Rabbit anti-Espin；
1：300 Goat anti-Sox2；
4、一抗稀释于含5％驴血清，1％BSA，及0.1％Triton的0.01M PBS中,4℃过夜；
5、0.01M PBS漂洗5分钟×3次；
6、加入相对应的二抗溶液：
1:1000 Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit；
1:1000 Alexa Fluor 647 Donkey anti-Goat；
7、二抗稀释于含1％BSA，及0.1％Triton的0.01M PBS溶液中，室温避光静置1小时；
8、DAPI染细胞核：将DAPI 1:200溶于0.01M PBS中，室温静置5分钟；
9、0.01M PBS漂洗5分钟×3次；
10、抗淬灭封片剂封片。
五、激光共聚焦显微镜扫描
1、使用Zeiss荧光显微镜与Leica SP5激光共聚焦显微镜观察并拍摄图像；
2、Adobe PhotoshopCS3、ImageJ进行后期图像处理。
六、细胞计数和统计分析
1、以耳蜗底圈注射点为中心计数200μm的长度的基底膜；
2、在激光共聚焦图像中计算每一段中表达Td Tomato阳性的外毛细胞数和总的外毛细胞数；
3、以Td Tomato阳性的外毛细胞数除以总的外毛细胞数；
4、以Prism软件对各组之间进行统计分析。
七、实施结果分析
1、动物基本情况
术后动物均成活，生长良好，术后未见小鼠有歪头、行走不稳等前庭功能受损表现。
2、耳蜗解剖基本情况
术后耳蜗解剖结构正常，无受损。术后10天取材时见中耳腔清洁、干净。固定后在荧光显微镜下观察，GFP-30-Cre蛋白质和脂质体结合组的术耳的基底膜见有红色Td-Tomato明显表达，而脂质体组及未注射耳未见Td-Tomato表达。
3、内耳毛细胞的Td-Tomato表达
注射5天后，GFP-30-Cre蛋白质和脂质体RNA iMax结合组中，约33±3％(P<0.001；n＝4)的耳蜗外毛细胞为Td-Tomato表达阳性，而在脂质体组和未注射耳组中，未见到任何Td-Tomato阳性的毛细胞，有显著性差异(见图2)。为了了解GFP-30-Cre蛋白质和脂质体是否对毛细胞有损伤作用，我们对其中4只小鼠保留了较长的时间，即在注射后10天处死动物，未见到毛细胞缺失，毛细胞的纤毛正常(见图2)。在GFP-30-Cre蛋白质和脂质体2000结合组，有91±5％的外毛细胞Td-Tomato表达阳性，而在脂质体组和未注射耳组中，未见到任何Td-Tomato阳性的毛细胞，有显著性差异(见图2)。
综上，GFP-30蛋白质和脂质体可用于制备治疗神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物。
Claims (2)
1.GFP-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用。
2.根据权利要求1的所述应用，其特征在于，所述GFP-30蛋白质带负电荷，脂质体带正电荷。
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| CN201410605212.2A CN104288780A (zh) | 2014-10-30 | 2014-10-30 | Gfp-30蛋白质和脂质体于制备治疗感音神经性耳聋或遗传性耳聋蛋白质药物中的应用 |
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