CN113171470A - 聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物、包含它的药物组合物，以及它们的制备和使用方法，所述生物偶联物包含经由任选的接头共价键合到至少一种聚集诱导发光分子的噬菌体。

Description

聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月24日提交的美国临时专利申请号62/995,297的优先权，该美国临时专利申请以引用方式整体并入本文中。
技术领域
本公开一般涉及可将荧光监测、选择性细菌靶向和基于聚集诱导发光(AIE)的光动力学疗法整合在一起针对细菌的聚集诱导发光(AIE)分子—噬菌体生物偶联物，以及这些材料作为体外和体内抗细菌剂的用途。
背景技术
病原性细菌引起的感染性疾病已成为全球面临的最大挑战之一，严重威胁着人类的健康和文明的发展。越来越多的证据表明，病原性细菌还可间接地促进其他多种恶性疾病(诸如癌症)的发生和发展。另一方面，细菌菌落稳态对人体健康来说是不可或缺的，诸如健康的肠道菌群对于食物消化和营养吸收便是不可或缺的，应当免受抗生素的危害并始终受到保护。因此，抗细菌药物的研发一直着眼于追求靶向性和杀灭效率等方面的进步。其中自从发现青霉素以来，廉价的抗生素便成为治疗细菌感染的主流药物。然而，使用抗生素，即使是窄谱抗生素，都可以同时杀灭有害细菌和有益微生物，从而导致诸如腹泻、便秘和肠道发炎等副作用。全球性的抗生素滥用和过度使用导致了病原菌的不断进化并加剧了细菌耐药性的产生。随着新型抗生素的研发难度和生产成本的不断提高，细菌耐药性的状况正在不断恶化。因此，开发具有精准靶向性的抗菌药物来杀灭特定种类的有害病原菌便成为迟滞细菌耐药性产生的有效方式。其中，具有抗菌功能的天然噬菌体已被验证对它们的宿主细菌具有特殊的靶向性，并且其可同步进化以适应细菌感染及其耐药性的产生。因此，在抗生素被发现之前便普遍使用的噬菌体疗法，正经历一场由抗生素耐药性危机所推动的复兴。然而，单独的噬菌体通常显示出有限的抗菌疗效，阻碍了对感染性疾病、尤其是急性感染的治疗。同时由于缺乏成像功能，不能对其与靶标病原菌之间的识别、结合和抗菌途径在内的治疗过程进行实时监测，从而难以对噬菌体疗法进行即时评价。因此，引入具有灵敏探测功能的成像“雷达”，将促进噬菌体疗法这一强大的靶向性“武器”进化到更高级的阶段，即既能可视化跟踪观测其感染过程，又能同时靶向性地消灭有害病原菌。
荧光成像技术以其高灵敏度、低成本、快速响应等优点，已成为用于生物靶标物可视化分析检测的快速、简便和有力工具。超越具有严重光漂白和有限信噪比的传统有机荧光染料，新型的具有聚集诱导发光特性的发光分子(luminogen)(AIEgen)已成为极具潜力的高级生物传感和成像应用的候选物。AIEgen在溶液中表现出微弱的发光，但经由分子内运动的限制，在聚集态时发光得到显著的增强。其极低的背景噪声和超强的光稳定性等优势以及点亮(light-up)型发光方式使AIEgen广泛应用于动态生物学过程监测和长时程生物成像等领域。此外，通过智能分子设计，基于AIE的材料在治疗恶性肿瘤和杀伤病原菌方面展示出优异的光动力学活性。然而，对于特定种类有害病原菌的精准靶向区分尚未被AIEgen证实，使得它们不适于精确地杀灭特定种类的靶细菌。尽管生物正交法尝试应用于细菌的靶向标记，但将外源性反应基团向细菌中进行输送的策略不适合于大规模的生产应用。这些局限性促使我们设计具有精准靶向性的AIEgen，以实现对特定种类细菌的识别，成像和杀灭。
发明内容
本文提供AIE—噬菌体生物偶联物，其将一种或多种AIEgen与噬菌体共价偶合以形成一类新的抗微生物生物偶联物(示例为TVP-PAP)，用于特定种类细菌的成像和杀灭。选择能够靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的噬菌体作为原型。示例性的AIE分子(TVP-S)被设计成具有优异的荧光性质和高效的光动力学杀伤(PDI)活性。通过简单的氨基—羧基反应，AIEgen可直接共价键合到噬菌体的表面。所生成的TVP-PAP有效地保留了AIEgen和噬菌体两者原有的性质，可以实时监测噬菌体—细菌相互作用和对细菌进行靶向识别的功能。此外，通过整合AIEgen的PDI活性和噬菌体本身的对宿主细菌的感染能力，相比于生物偶联物中的两个单独个体抗菌功效相加之后的效果，发光分子—噬菌体生物偶联物实现了效率更高的协同抗菌作用。在由野生型铜绿假单胞菌和多药耐药型(MDR)铜绿假单胞菌两者引起的动物感染性伤口的治疗中，也证实了生物偶联物的优异抗细菌性能。
在第一方面，本文提供一种聚集诱导发光(AIE)分子—噬菌体生物偶联物，其包含经由任选的接头共价键合到至少一种聚集诱导发光分子(AIEgen)的噬菌体。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是光敏剂。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式1：
Figure BDA0002910906360000031
或为其药学上可接受的盐，其中
Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
X是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或共价键；
Y是任选取代的杂芳基或共价键；并且
R1是具有下式的部分：
Figure BDA0002910906360000041
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z是药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头共价键合到Ar1、Ar2、Ar3、X、Y或R1。
在某些实施方案中，Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基；X是任选取代的芳基或共价键；并且Y是杂芳基或共价键。
在某些实施方案中，其中所述至少一种AIEgen具有式2：
Figure BDA0002910906360000051
或为其药学上可接受的盐，其中
p和t中的每一个均独立地为选自1-5的整数；
u是选自1-4的整数；
R1是具有下式的部分：
Figure BDA0002910906360000052
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5、R6和R7中的每一个在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000061
其中w在每种情况下均独立地选自1-5的整数；并且
R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R、R2、R3、R5、R6、R7或R9处共价键合。
在某些实施方案中，m、p、t、u和w的每一个独立地为1或2。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式3：
Figure BDA0002910906360000071
或为其药学上可接受的盐，其中
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000072
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R3、R5或R6或R9处共价键合。
在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CR4 2)nJ-**，其中n是选自0-12的整数；J是-(C＝O)-、-(C＝S)-、-NH(C＝O)-或-NH(C＝S)-；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式1的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CH2)n(C＝O)-**，其中n是选自2-8的整数，其中*表示与具有式1的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CR4 2)n(C＝O)-**，其中n是选自0-12的整数；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式1的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式4：
Figure BDA0002910906360000081
Figure BDA0002910906360000091
或为其药学上可接受的盐，其中
R3是由下式表示的接头：*-(CR4 2)n(C＝O)-**，其中n是选自1-10的整数；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式4的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000092
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
在某些实施方案中，生物偶联物包含1,000-20,000个所述至少一种AIEgen。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen和接头是选自由以下组成的组的部分：
Figure BDA0002910906360000101
或其药学上可接受的盐，其中
n是选自0-4的整数；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000111
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中
Figure BDA0002910906360000113
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen和接头由以下表示：
Figure BDA0002910906360000112
或为其药学上可接受的盐，其中Z是药学上可接受的阴离子；并且
Figure BDA0002910906360000114
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，噬菌体是丝状噬菌体或二十面体噬菌体。
在某些实施方案中，噬菌体是肠杆菌噬菌体P7(PAP)。
在第二方面，本文提供一种药物组合物，其包含本文所述的生物偶联物和至少一种药学上可接受的辅料。
在第三方面，本文提供一种式5化合物：
Figure BDA0002910906360000121
或其药学上可接受的盐，其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000122
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
在第四方面，本文提供一种制备生物偶联物的方法，所述方法包括：使式5化合物或其药学上可接受的盐与噬菌体接触，由此形成所述生物偶联物：
Figure BDA0002910906360000131
其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000141
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
在第五方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物，以及在氧存在下用可见光照射所述细菌感染的部位。
在第六方面，本文提供一种使细菌标记和成像的方法，所述方法包括使本文所述的生物偶联物与所述细菌接触；用可见光照射所述细菌；以及检测来自所述生物偶联物的荧光发光。
附图说明
附图包含某些实施方案的图，以进一步说明和阐明本公开的上述和其他方面、优点和特征，其中相同的附图标记是指相同或功能相似的元件。应当了解，这些附图描绘了本发明的示例性实施方案，因此并不旨在限制其范围。将通过使用附图以附加的特性和细节来描述和解释本发明。
图1描绘TVP-S的示例性合成。
图2描绘(a)AIEgen(TVP-S)的分子结构。(b)分别溶解于水、DMSO和氯仿中的TVP-S的归一化UV–vis谱。(c)具有不同体积分数的在DMSO和CHCl3的混合物中TVP-S的AIE曲线。(d)TVP-S的发射最大值相对于DMSO/CHCl3混合物的分数的绘图。(e)在白光照射下含TVP-S的ABDA在水中的光降解。(f)在白光照射下在379nm吸光度指示的ABDA分解速率。
图3是分别溶解于(a)水、(b)DMSO和(c)氯仿中的TVP-S的DLS测量。
图4描绘总ROS生成的化学捕获。含TVP-S的DCFH(a)、玫瑰红(Rose Bengal)(b)和DCFH对照(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光辐照下进行这些测量。(d)在白光照射下的DCFH在524nm处荧光强度指示的活化速率。
图5描绘1O2生成的化学捕获。ABDA对照(a)和含玫瑰红的ABDA(b)的光降解。在白光照射下，在水中进行这些测量。
图6描绘经由监测含TVP-S的ABDA的光降解确定的被不同浓度的NaN3抑制的1O2生成的化学捕获。在白光照射下进行这些测量。在白照射下379nm处的吸光度指示的ABDA分解速率。
图7描绘OH·生成的化学捕获。含TVP-S的HPF(a)、玫瑰红(Rose Bengal)(b)和HPF对照(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光照射下进行这些测量。(d)不同条件下，在白光照射下，515nm处荧光强度指示的HPF的活化速率。
图8描绘O2·-生成的化学捕获。含TVP-S的DHR(a)、玫瑰红(Rose Bengal)(b)和DHR对照(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光照射下进行这些测量。(d)在不同条件下，在白光辐照下524nm处荧光强度所指示的DHR的活化速率。
图9描绘TVP-S的三重态和单态氧发射测量。(a)77K下延迟1ms后的荧光和磷光发射谱。内部图片在365nm紫外光分别开启和关闭后拍摄。(b)650nm处发射光谱的衰变时间，计算寿命为31.3μs。
图10描绘以下的水溶液的UV–vis谱：(a)TVP-PAP(9.375×109PFU·mL-1)、PAP(9.375×109PFU·mL-1)和TVP-S(4.26×10-6mol·L-1)。内部绘图来自16倍浓缩的TVP-PAP(1.5×1011PFU·mL-1)和PAP(1.5×1011PFU·mL-1)。(b)和(c)分别为TVP-S和PAP的标准吸光度曲线。Abs457 nm和Abs256 nm可用它们的浓度线性地拟合。通过将TVP-PAP的Abs457 nm减去PAP的Abs457nm，可计算出TVP-PAP偶联物中修饰的AIEgen的浓度。并且平均有8200个AIEgen结合在一个PAP上。
图11描绘生物偶联物所生成的总ROS的化学捕获。含TVP-PAP的DCFH(a)、DCFH对照(b)和无DCFH指示剂的TVP-S(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光照射下进行这些测量。(d)在不同条件下，在光照射下在524nm处荧光强度所指示的DCFH的活化速率。
图12描绘与TVP-PAP培育30min的铜绿假单胞菌的荧光成像。所有比例尺均为10μm。在488nm处激发TVP-PAP，并在580-680nm处收集发射。
图13描绘与核染料(Hoechst 33342)、膜染料(DiO)和TVP-PAP(AIEgen标记)共培育的铜绿假单胞菌的荧光成像。Hoechst 33342、DiO和TVP-PAP的激发分别为350/50、480/40和546/10nm；并且分别在460/50、527/30和585/40nm处收集发射。所有比例尺均为10μm。
图14描绘通过与TVP-PAP培育的鲍曼不动杆菌(A.baumanni)的荧光成像对TVP-PAP的特异性测试。使用具有蓝色荧光的Hoechst 33342对鲍曼不动杆菌的核进行染色。Hoechst：激发：350/50nm，发射：460/50nm；AIEgen：激发：546/10nm，发射：585/40nm。
图15描绘通过与TVP-PAP培育的金黄色葡萄球菌的荧光成像对TVP-PAP的特异性测试。使用具有蓝色荧光的Hoechst 33342对金黄色葡萄球菌的核进行染色。Hoechst：激发：405nm，发射：420-470nm；AIEgen：激发：488nm，发射：550-680nm。
图16描绘经由在黑暗下与铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌共培育对TVP-PAP的特异性测试。箭头指示未被标记红色荧光染色的鲍曼不动杆菌。
图17描绘(a)在用TVP-PAP处理后的铜绿假单胞菌的细菌存活率。将细菌与TVP-PAP在黑暗中培育0(I-0)、10(I-10)和30(I-30)min，然后通过白光照射将细菌悬浮液分别处理2(L-2)、10(L-10)、30(L-30)和60(L-60)min。(b)基于CFU计数测定的对铜绿假单胞菌的细菌杀灭作用。对照组不添加TVP-PAP或没有白光照射。
图18描绘基于CFU计数测定的TVP-PAP分别对(a)野生型铜绿假单胞菌和(b)MDR型铜绿假单胞菌的细菌杀灭作用。
图19描绘抗细菌评价。(a)野生型(左)和MDR型铜绿假单胞菌(右)在各种处理后的存活率。(b)与TVP-PAP一起培育的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，(c)与TVP-PAP一起培育的相同浓度的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。(b)和(c)中的内部图片是有I-30和L-30处理的相应CFU计数测定。箭头指示经由另一36h培育的菌落形态和菌落颜色鉴定的铜绿假单胞菌(I：培育；L：光照)。
图20描绘各种处理顺序后的细菌存活率。
图21描绘TVP-PAP感染铜绿假单胞菌和PDI作用的实时监测。首先将细菌与TVP-PAP共培育30min，然后在白光下再照射50min。
图22描绘TVP-PAP感染MDR铜绿假单胞菌和PDI作用的实时监测。首先将细菌与TVP-PAP共培育30min，然后在白光下再照射50min。
图23描绘细菌杀灭作用的扫描电子显微术(SEM)图像。(a)无任何处理的铜绿假单胞菌。(b)与TVP-PAP且在白光照射下培育的铜绿假单胞菌。
图24描绘(a)无任何处理的MDR铜绿假单胞菌、(b)与TVP-PAP在黑暗中培育的MDR铜绿假单胞菌和(c)与TVP-PAP且在白光照射下培育的MDR铜绿假单胞菌的SEM图像。
图25描绘在与不同浓度的TVP-PAP培育30min后、然后在黑暗中或在白光照射30min后HaCaT细胞的存活力。
图26描绘与TVP-PAP培育的HaCaT细胞的共焦图像。
图27描绘TVP-PAP在治疗野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌感染的小鼠伤口方面的体内评价。(a)随时间变化的治疗过程示意图。(b)通过TVP-PAP+白光照射不同时段治疗的伤口的照片。(c)不同治疗8天后的相对伤口大小分析。(d)通过TVP-PAP+白光照射不同时段治疗的伤口的照片。(e)不同治疗8天后的相对伤口大小分析。
图28描绘显示(I)噬菌体引导靶向、(II)区别成像和(III)AIE-生物偶联物对细菌的协同杀灭的示意图。
具体实施方式
定义
在本申请通篇中，当组合物被描述为具有、包含特定组分时，或者当方法被描述为具有、包括特定方法步骤时，预期本教导的组合物还可基本上由或者由所叙述的组分组成，并且本教导的方法还可基本上由或者由所叙述的方法步骤组成。
在本申请中，当认为要素或组分被包括于和/或选自所叙述的要素或组分的列表中时，应当理解所述要素或组分可以是任何一种所叙述的要素或组分，或者所述要素或组分可选自由两种或更多种所叙述的要素或组分组成的组。此外，应当理解，不论在本文中是明确的还是隐含的，本文所述的组合物、设备或方法的要素和/或特征都可以多种方式组合而不脱离本教导的精神和范围。
除非另有明确说明，否则术语“包括(include,includes,including)”、“具有(has或having)”的使用通常应当理解为开放式的和非限制性的。
除非另有明确说明，否则本文中使用的单数包括复数(且反之亦然)。另外，除非另有明确说明，否则当在数值前使用术语“约”时，本教导还包括特定数值本身。如本文所用，除非另外指明或推断，否则术语“约”是指与标称值有±10％、±7％、±5％、±3％、±1％或±0％变化。
应当理解，只要本教导仍可操作，则步骤的顺序或进行某些操作的顺序是不重要的。此外，可同时进行两个或更多个步骤或动作。
如本文所用，“卤代”、“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，1-甲基丁基、2-甲基丁基、异戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、新戊基和1-乙基丙基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1到40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如，1-30个碳原子(即，C1-30烷基)。在某些实施方案中，烷基可具有1到6个碳原子，并且可被称为“低级烷基”。低级烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)和丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在某些实施方案中，烷基可如本文所述任选地被取代。烷基通常不被另一烷基、烯基或炔基取代。
术语“芳烷基”是本领域公认的，并且是指被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。
如本文所用，除非另有说明，否则“环烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指在环系中具有3-12个碳原子的单环烃，并且包括氢、直链、支链和/或环状取代基。示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。
如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的示例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯中)或末端的(诸如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，烯基可具有2到40个碳原子(即，C2-C40烯基)，例如，2到20个碳原子(即，C2-C20烯基)。在一些实施方案中，烯基可如本文所述被取代。烯基通常不被另一烯基、烷基或炔基取代。
如本文所用，“稠环”或“稠环部分”是指具有至少两个环的多环环系，其中至少一个环是芳族的，并且此类芳族环(碳环或杂环)具有与至少一个其他环共用的键，所述其他环可以是芳族或非芳族的，以及碳环或杂环的。这些多环环系可以是高度p-共轭的，并且如本文所述任选地被取代。
如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括例如氮、氧、硅、硫、磷和硒。
如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系或多环环系，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共用的键)在一起，或至少一个芳族单环烃环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环。芳基在其环系中可具有6到24个碳原子(例如，C6-C24芳基)，其可包含多个稠环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8到24个碳原子。芳基的任何适合的环位置均可共价连接到所定义的化学结构。仅具有芳族碳环的芳基的示例包括苯基、1-萘基(二环)、2-萘基(二环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、并五苯基(五环)和类似基团。其中至少一个芳族碳环稠合到一个或多个环烷基环和/或环杂烷基环的多环环系的示例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-二环环烷基/芳族环系)、环己烷(即，四氢萘基，其为6,6-二环环烷基/芳族环系)、咪唑啉(即，苯并咪唑啉基，其为5,6-二环环杂烷基/芳族环系)和吡喃(即，色烯基，其为6,6-二环环杂烷基/芳族环系)等。芳基的其他示例包括苯并二噁烷基、苯并间二氧杂环戊烯基、色满基、吲哚啉基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述任选地被取代。芳基环可在一个或多个位置处被如本文所述的此类取代基取代，所述取代基如例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可被称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤代芳基，即，其中所有氢原子均被卤素原子替代的芳基(例如，-C6F5)。在某些实施方案中，芳基被另一芳基取代并且可被称为联芳基。联芳基中的每个芳基均可如本文所公开的那样任选地被取代。
如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的环杂原子的芳族单环环系、或其中环系中存在的至少一个环为芳族并且含有至少一个环杂原子的多环环系。多环杂芳基包括具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的那些，以及具有至少一个与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的单环杂芳基环的那些。杂芳基整体上可具有例如5到24个环原子并且含有1-5个环杂原子(即5-20元杂芳基)。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接到所限定的化学结构，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含有O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的示例包括例如以下所示的5-或6-元单环和5-6二环环系：其中T为O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2或Si(烷基)(芳基烷基)。此类杂芳基环的示例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他示例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述任选地被取代。杂环可在一个或多个位置处被如本文所述的此类取代基取代，所述取代基如例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
术语“任选取代的”是指诸如烷基、环烷基、芳基、杂芳基等的化学基团，其中一个或多个氢可被如本文所述的取代基替代，所述取代例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF3、-CN等；或者是指由以下结构表示的化学部分：
Figure BDA0002910906360000221
其中Ar’在每种情况下均独立地为任选取代的苯基。
如本文关于化学基团或部分所用的表示“
Figure BDA0002910906360000231
”意图表示上述化学基团或部分共价键合到另一化学基团、部分或噬菌体的共价键。
如本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指荧光化合物在以无定形或结晶(固体)状态聚集时或经由荧光化合物的共价或非共价相互作用(静电吸引、疏水-疏水相互作用、氢键合等，同时抑制其分子运动)结合到较大的大分子或粒子的表面或内腔时发光增强，而当AIE分子彼此分离时，荧光化合物展现出弱的发光或基本上没有发光。
如本文所用的术语“λex”是指激发波长。
如本文所用的术语“λem”是指发射波长。
术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”在本文中可互换使用以指示细菌病毒，其形成包含蛋白质外壳的包装，所述蛋白质外壳含有所述细菌病毒复制所需的核酸。核酸可以是双链或单链、线性或环状的DNA或RNA。
如本文所用，“受试者”意指个体。因此，“受试者”可包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“受试者”还可包括哺乳动物，诸如灵长类动物或人。
“预防(prevent)”或该词的其他形式，诸如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”，意指阻止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或使特定事件或特征将发生的几率最小化。预防无需与控制进行比较，因为它通常比例如减少更为绝对。如本文所用，有些东西可以减少，但不能预防，但减少的东西也可预防。同样，有些东西可以预防，但不能减少，但预防的东西也可减少。应理解，除非另有特别指明，否则在使用减少或预防时，也明确公开了另一个词的使用。
“治疗(treat)”或该词的其他形式，诸如“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”，意指施用组合物或进行方法以减少、预防、抑制或消除特定特征或事件(例如，肿瘤生长或存活)。术语“控制”与术语“治疗”同义使用。
术语“治疗有效”意指所用组合物的量足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状。此类改善只需要减少或改变，不一定是消除。
如本文所用，术语药学上可接受的盐是指本发明化合物的任何盐，所述盐保留了所述化合物的生物学性质，并且没有毒性或在其他方面对于药物用途不是不期望的。此类盐可衍生自本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子，并且包括它们。此类盐包括：(1)与诸如以下的有机酸或无机酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、羟乙酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡糖庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸和类似酸；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子发生以下情况时形成的盐：(a)被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)、或碱金属或碱土金属的氢氧化物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡)、氨置换，或与诸如以下的有机碱配位：脂族、脂环族或芳族有机胺，诸如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、二乙醇胺、普鲁卡因(procaine)、N-苄基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵等。另外，盐的示例包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当化合物含有碱性官能团时，包括无毒的有机酸或无机酸的盐，诸如卤化物(例如、氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、羟乙酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐；富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate,mesylate)、乙磺酸盐、1,2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate,besylate)、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎尼酸盐、粘康酸盐等。
当本文使用商品名时，申请人旨在独立地包括商品名产品制剂、仿制药(genericdrug)和商品名产品的活性药物成分。
本公开提供一种AIE-噬菌体生物偶联物，其包含经由任选的接头共价键合到至少一种AIEgen的噬菌体。
所述至少一个AIEgen可经由与蛋白质外壳中适合的官能团(诸如一个或多个选自由赖氨酸侧链、半胱氨酸侧链和N末端氨组成的组的官能团)连接而共价键合到噬菌体的蛋白质外壳表面。
可存在1-100,000个经由任选的接头共价键合到噬菌体的AIEgen。在某些实施方案中，生物偶联物包含1-50,000个、1-40,000个、1-30,000个、1-20,000个、1,000-20,000个、1,000-10,000个、1-10,000个、5,000-10,000个或7,000-10,000个经由任选的接头共价键合到噬菌体的AIEgen。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是或包含光敏剂。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式1：
Figure BDA0002910906360000261
或为其药学上可接受的盐，其中
Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
X是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或共价键；
Y是任选取代的杂芳基或共价键；并且
R1是具有下式的部分：
Figure BDA0002910906360000262
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且Z是阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头共价键合到Ar1、Ar2、Ar3、X、Y或R1。
在某些实施方案中，Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基；X是任选取代的芳基或共价键；并且Y是杂芳基或共价键。在某些实施方案中，Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的苯基；并且X是任选取代的苯基。在某些实施方案中，Y是任选取代的噻吩、任选取代的呋喃或共价键。
在某些实施方案中，R1是具有选自由以下组成的组的式的部分：
Figure BDA0002910906360000271
其中m、R2、R3和Z如本文所述的任一个或多个实施方案中所定义，并且其中如果R1是喹啉鎓(quinonlinium)，则每个R2可独立地共价键合到化合价所允许的喹啉鎓的任一碳环原子。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：
Figure BDA0002910906360000272
Figure BDA0002910906360000281
或其药学上可接受的盐，其中
A是O或S；
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000282
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R3、R5或R6或R9处共价键合。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式2：
Figure BDA0002910906360000291
或为其药学上可接受的盐，其中
p和t中的每一个均独立地为选自1-5的整数；
u是选自1-4的整数；
R1是具有下式的部分：
Figure BDA0002910906360000292
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5、R6和R7中的每一个在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000301
其中w在每种情况下均独立地选自1-5的整数；并且
R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R、R2、R3、R5、R6、R7或R9处共价键合。
在某些实施方案中，t和p各自为1并且R7是氢。在某些实施方案中，w是1。在某些实施方案中，m是1。
在某些实施方案中，R1是选自由以下组成的组的部分：
Figure BDA0002910906360000311
在某些实施方案中，R2是氢。在某些实施方案中，R9是氢。
在某些实施方案中，R3是烷基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基。
在某些实施方案中，R5和R6中的每一个在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8。在某些实施方案中，R5和R6中的每一个在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基和R8。
在某些实施方案中，R7在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8。在某些实施方案中，R7在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基和R8。
Z可选自由以下组成的组：卤基(例如，氯基、溴基和碘基)、硫酸根、磷酸根、氨基磺酸根、硝酸根、乙酸根、三氟乙酸根、三氯乙酸根、丙酸根、己酸根、环戊基丙酸根、羟乙酸根、戊二酸根、丙酮酸根、乳酸根、丙二酸根、琥珀酸根、山梨酸根、抗坏血酸根、苹果酸根、马来酸根；富马酸根、酒石酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸根、苦味酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、邻苯二甲酸根、月桂酸根、甲磺酸根(methanesulfonate,mesylate)、乙磺酸根、1,2-乙烷-二磺酸根、2-羟基乙烷磺酸根、苯磺酸根(benzenesulfonate,besylate)、4-氯苯磺酸根、2-萘磺酸根、4-甲苯磺酸根、樟脑酸根、樟脑磺酸根、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸根、葡庚糖酸根、3-苯基丙酸根、三甲基乙酸根、叔丁基乙酸根、月桂基硫酸根、葡萄糖酸根、苯甲酸根、谷氨酸根、羟基萘甲酸根、水杨酸根、硬脂酸根、环己基氨基磺酸根、奎尼酸根和粘康酸根。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式3：
Figure BDA0002910906360000321
或为其药学上可接受的盐，其中
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000331
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R3、R5或R6或R9处共价键合。
任选的接头可以是本领域已知的任何接头。任选的接头可以是不稳定接头或非不稳定接头。示例性的不稳定接头包括在生理条件下不稳定的接头，诸如酸不稳定接头、碱不稳定接头、酶不稳定接头。接头可具有线性、环状、支链结构。任选的接头可在接头中包含一个或多个选自由以下组成的组的官能团：醚基、硫化物基团、二硫化物基团、酰胺基、胺基、酮基、碳酸酸基、氨基甲酸酯基、脲基、烷氧基胺基、亚胺基、烷氧基、亚胺基等。
在某些实施方案中，所述接头由下式表示：*-(CR4 2)nJ-**，其中n是选自0-12的整数；J是-(C＝O)-、-(C＝S)-、-NH(C＝O)-、-NH(C＝S)-、-N-琥珀酰亚胺基、-S-、-NH-或苯酚；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式1的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。在某些实施方案中，n是选自1-6、1-5、2-5或2-4的整数。在某些实施方案中，每个R是氢。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式4：
Figure BDA0002910906360000341
或为其药学上可接受的盐，其中
R3是由下式表示的接头：*-(CR4 2)n(C＝O)-**，其中n是选自1-10的整数；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式4的所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000342
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：
Figure BDA0002910906360000351
或其药学上可接受的盐，其中A是O或S；R3是：*-(CH2)n(C＝O)-**，其中n是选自1-6、1-5、1-4或2-4的整数；*表示与所述AIEgen的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点；并且Z是药学上可接受的阴离子。
取决于存在于所述至少一种AIEgen中的反应性官能团，可使用任何数目的官能团使所述至少一种AIEgen与噬菌体偶联。例如，在所述至少一种AIEgen包含反应性胺的情况下，所述至少一种AIEgen可与C末端羧酸或包含羧酸的氨基酸侧链(例如，谷氨酸、天门冬氨酸等)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性羧基的情况下，所述至少一种AIEgen可与N末端胺或包含胺的氨基酸侧链(例如，赖氨酸)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性硫醇的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含硫醇的氨基酸侧链(例如半胱氨酸)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性双键(例如，马来酰亚胺部分)的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含硫醇的氨基酸侧链(例如，半胱氨酸)偶联；并且在所述至少一种AIEgen包含反应性酚羟基的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含苯酚的氨基酸侧链(例如，酪氨酸)偶联。因此，在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：
Figure BDA0002910906360000361
或其药学上可接受的盐，其中n、Z、R5和R6各自独立地如本文所述的任一个或多个实施方案所定义；或n是选自0-12、1-12、0-10、1-10、0-8、1-8、0-6、1-6、0-5、1-5、0-4、1-4、0-3、1-3、0-2、1-2或0-1的整数，并且
Figure BDA0002910906360000362
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是：
Figure BDA0002910906360000371
或其药学上可接受的盐，其中Z是药学上可接受的阴离子；并且
Figure BDA0002910906360000372
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
在某些实施方案中，噬菌体是选自由以下组成的组的病毒科的成员：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、瓶状噬菌体科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、微滴形噬菌体属(Guttavirus)、丝杆噬菌体科(Inoviridae)、光滑丝杆噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、原质噬菌体科(Plasmaviridae)和复层噬菌体科(Tectiviridae)。在某些实施方案中，噬菌体对细菌细胞是裂解性的并且选自由以下组成的组：弯曲杆菌属(Campylobacter)、克洛诺菌属(Cronobacter)、大肠杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、乳球菌属(Lactococcus)、弧菌属(Vibrio)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和杆菌属(Bacilli)。
在某些实施方案中，噬菌体选自由以下组成的组：噬菌体PAP1、PAP2、PAP3、PAP7、噬菌体SWHAb1、SWHAb2、Bφ-C62、
Figure BDA0002910906360000373
噬菌体JSOl、噬菌体T2、T4、噬菌体ΦCrAss001、噬菌体SMP、噬菌体Φm46.1和噬菌体P2。
噬菌体的选择部分基于噬菌体的细菌特异性。例如，λ噬菌体、噬菌体T2和T4可用于靶向和感染大肠杆菌(Escherichia coli)(革兰氏阴性细菌)；phi-104可用于靶向和感染枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；噬菌体PAP1、PAP2、PAP3、PAP7可用于靶向和感染铜绿假单胞菌；噬菌体SWHAb1、SWHAb2、Bφ-C62、
Figure BDA0002910906360000381
可用于靶向和感染鲍曼不动杆菌；噬菌体JSOl可用于靶向和感染金黄色葡萄球菌；噬菌体ΦCrAss001可用于靶向和感染肠道拟杆菌(Bacteroides intestinalis)；噬菌体SMP可用于靶向和感染猪链球菌(Streptococcus suis)；噬菌体Φm46.1可用于靶向和感染化脓性链球菌(Pyogenicstreptococcus)；噬菌体P2可用于靶向和感染具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)。在某些实施方案中，噬菌体是PAP。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本文所述的生物偶联物和至少一种药学上可接受的辅料。
本文所述的生物偶联物和它们的药学上可接受的盐可单独或与药学上可接受的辅料、载体和/或稀释剂在药物组合物中根据标准药学实践施用于受试者。生物偶联物可经口或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下和局部，优选的方法是静脉内和局部施用。
因此，本公开提供药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的辅料、可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种本文所述的生物偶联物。本公开的药物组合物可特别配制成以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)胃肠外施用，例如作为无菌溶液或悬浮液、或持续释放的制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；和(2)口服施用，例如，用于冲服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，旨在用于颊、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、施加到舌的糊剂。
如本文所述，本文所述的生物偶联物的某些实施方案可含有碱性官能团，诸如氨基，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离碱形式的本发明纯化的生物偶联物与适合的有机酸或无机酸反应并且在随后的纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。
本公开的生物偶联物的药学上可接受的盐包括例如来自无毒有机酸或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规的无毒盐包括衍生自诸如以下的无机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由诸如以下的有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、2-羟乙基磺酸(isothionic)等。
在其他情况下，本文所述的生物偶联物可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机碱加成盐和有机碱加成盐。这些盐同样可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离酸形式的纯化化合物与适合的碱(诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
在组合物中还可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂以及抗氧化剂。
制备这些制剂的方法包括使本文所述的生物偶联物与载体或辅料以及任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过如下方式制备所述制剂：均匀地且紧密地使本公开的生物偶联物与液体载体(液体制剂)缔合、之后冻干(粉末制剂，用于用无菌水等复原)或微细的固体载体或两者，然后如有必要，使产品成形或包装产品。
适于胃肠外施用的本公开的药物组合物包含一种或多种本文所述的生物偶联物与以下中的一种或多种的组合：药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、在使用之前即可被重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，它们可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、螯合剂、使所述制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
本公开的药物组合物中可采用的适合的水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用例如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物对本公开的生物偶联物的作用。还可能期望在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
可使用本领域技术人员已知的任何方法使至少一种AIEgen与噬菌体偶联。本领域普通技术人员可根据至少一种AIEgen中存在的反应性官能团容易地选择适当的合成方法以实现至少一种AIEgen与噬菌体的偶联。
在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：
Figure BDA0002910906360000411
其中
Figure BDA0002910906360000412
表示与噬菌体的共价连接位点；生物偶联物可通过选自以下的化合物、噬菌体和肽偶合试剂(例如下面更详细描述的那些)反应来制备：
Figure BDA0002910906360000413
其中n、Z、R5和R6各自独立地如本文所述的任一个或多个实施方案所定义，该反应导致所述化合物与C末端羧酸或包含羧酸侧链的氨基酸偶联；或与包含胺侧链的氨基酸的N末端胺偶联。
在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：
Figure BDA0002910906360000414
其中
Figure BDA0002910906360000415
表示与噬菌体的共价连接位点；生物偶联物可通过由下式表示的化合物或其药学上可接受的盐和噬菌体在氧化偶合条件下反应来制备：
Figure BDA0002910906360000416
其中n、Z、R5和R6各自独立地如本文所述的任一个或多个实施方案所定义，该反应导致所述化合物经由氧化偶合与包含硫醇侧链的氨基酸偶联。
在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：
Figure BDA0002910906360000421
其中
Figure BDA0002910906360000422
表示与噬菌体的共价连接位点；生物偶联物可通过由下式表示的化合物或其药学上可接受的盐和噬菌体在1,4加成反应条件下(例如，在碱或碱性缓冲溶液存在下)反应来制备：
Figure BDA0002910906360000423
其中n、Z、R5和R6各自独立地如本文所述的任一个或多个实施方案所定义，该反应导致所述化合物经由1,4加成反应与包含硫醇侧链的氨基酸偶联。
在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：
Figure BDA0002910906360000424
生物偶联物可通过由下式表示的化合物或其药学上可接受的盐和噬菌体，通过酶介导的氧化偶合(例如，辣根过氧化物酶或髓过氧化物酶)反应来制备：
Figure BDA0002910906360000431
其中n、Z、R5和R6各自独立地如本文所述的任一个或多个实施方案所定义，该反应导致所述化合物经由氧化偶合与包含苯酚侧链的氨基酸偶联。
本文还提供制备生物偶联物的方法，其中所述至少一种AIEgen具有式5，所述方法包括：使式5化合物或其药学上可接受的盐与噬菌体接触，由此形成所述生物偶联物：
Figure BDA0002910906360000432
其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000441
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
示例性离去基团包括但不限于Cl、Br、I、3,5-二溴水杨酸根、水杨酸根等。
在某些实施方案中，离去基团选自由以下组成的组：
Figure BDA0002910906360000442
Figure BDA0002910906360000451
式5化合物可原位预成形或形成，例如通过相应的酸与羰基活化剂和任选的偶合添加剂的反应。
示例性羰基活化剂包括但不限于碳化二亚胺，诸如DCC、DIC、EDC、CIC、BMC、CPC、BDDC、PIC、PEC和BEM、脲鎓/胺鎓盐，诸如HATU、HBTU、TATU、TBTU、HAPyU、TAPipU、HAPipU、HBPipU、HAMBU、HBMDU、HAMTU、5,6-B(HATU)、4,5-B(HATU)、HCTU、TCTU和ACTU，鏻盐，诸如AOP、BOP、PyAOP、PyBOP、PyOxm、PyNOP、PyFOP、NOP和PyClock，亚胺鎓盐，诸如BOMI、BDMP、BMMP、BPMP和AOMP。
示例性的偶合添加剂包括但不限于HOBt、6-NO2-HOBt、6-Cl-HOBt、6-CF3-HOBt、HOAt、HODhbt、HODhat、HOSu和Oxyma。
式5化合物的制备，包括试剂和反应条件的适当选择，完全在本领域普通技术人员的技能范围内。
可用于制备本文所述的生物偶联物的中间体是式5化合物：
Figure BDA0002910906360000452
或其药学上可接受的盐，其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure BDA0002910906360000461
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且Z在每次出现时均独立地为阴离子。
本文还提供使用本文所述的生物偶联物作为细菌成像剂和/或抗细菌剂的方法。
在某些实施方案中，治疗细菌感染的方法包括向细菌感染施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物，以及在氧存在下用可见光照射细菌感染。细菌细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性。在某些实施方案中，细菌是多重耐药型的。在某些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道拟杆菌、猪链球菌、化脓性链球菌和具核梭杆菌。
所述方法可在体内或体外进行。可见光照射可以是白光。存在的氧可以是内源性氧、外源性氧或其组合。
在某些实施方案中，本文提供了预防性地治疗有此需要的受试者的潜在细菌感染的方法，所述方法包括：使所述潜在细菌感染的部位与治疗有效量的本文所述的生物偶联物接触；以及用可见光照射所述部位。潜在细菌感染的部位可以是极易受细菌感染的损伤，诸如破坏皮肤的外真皮层的划口、动物咬伤、皮肤烧伤、或外科伤口或切口。
本文还提供用本文所述的生物偶联物处理水溶液的方法，使得存在于溶液中的至少一些或所有细菌被杀灭。在某些实施方案中，所述方法包括使怀疑含有细菌的水溶液与治疗有效量的本文所述的生物偶联物接触，以及用可见光照射所述水溶液。对水溶液的处理可降低因水溶液消耗所致细菌感染的几率。在某些实施方案中，水溶液是受到细菌污染的溶液，例如鱼缸中的水或废水，诸如污水。
在治疗细菌感染的方法在体内进行的情况下，本文提供了治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物；以及用可见光照射细菌感染的部位。
受试者可以是猫、狗、牛、马、猪、小鼠、大鼠、灵长类动物或人。
还提供了使细菌细胞成像的方法，所述方法包括使本文所述的生物偶联物与所述细菌细胞接触；用可见光照射所述细菌；以及检测来自所述生物偶联物的发光。可见光可具有250-700nm、400-600nm、400-650nm、450-600nm、450-550nm或475-525nm的激发波长。发光可具有300-750nm、425-700nm、475-650nm、300-500nm、300-450nm或350-450nm或375-425nm的发射波长。可使用任何适合的用于检测发光的装置，诸如光谱仪。
已经描述了本发明，给出以下实施例以说明本发明的具体应用，包括现在已知的进行本发明的最佳模式。这些具体实施例并不旨在限制本申请中所述的本发明的范围。
实验部分
材料和表征
叠氮化钠(NaN3,99％)、二甲亚砜(DMSO,99.7％)、3,3′-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐(DiO)、2′-(4-乙氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5′-二-1H-苯并咪唑三盐酸盐(Hoechst 33342,97％)、2′,7′-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH,97％)、9,10-二甲基蒽(ABDA,99％)和玫瑰红内酯(RB,95％)购自Sigma-Aldrich。羟苯基荧光素(HPF)和二氢罗丹明123(DHR)购自Thermal Fisher Scientific。4-(N,N-二苯基氨基)苯甲醛(98％)、4-甲基吡啶(98.5％)、4-溴丁酸(98％)、N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC,99％)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,98％)、叔丁醇钾(99％)、氯化钠(NaCl,AR)、氯仿(CHCl3)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、乙醇和乙酸乙酯购自J&K。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自Thermo Scientific(HyClone)。其他化合物购自AIEgen Biotech有限公司。所有其他试剂和溶剂均为分析级。溶剂(包括DCM和THF)在使用前被蒸馏。胰蛋白胨、酵母提取物和胰蛋白酶大豆培养液(TSB)购自Oxoid有限公司(London,UK)。从Solarbio life science(Beijing,China)获得琼脂。细胞计数试剂盒-8购自MedChem Express(USA)。从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得铜绿假单胞菌(ATCC27853)、鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)菌株。MDR铜绿假单胞菌由第三军医大学(the Third Military Medical University)临床分离并鉴定。HaCaT细胞系购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(China center for type culturecollection of Wuhan University)。由Milli-Q Direct-8纯化系统(Millipore)供应水(18.2MΩ·cm)。肠杆菌噬菌体P7(噬菌体PAP7，“PAP”)是由第三军医大学(Chongqing,China)馈赠，基于λ噬菌体分离方案分离自西南医院(Chongqing,China)的污水。通过标准噬斑测定来测量噬菌体滴度。
性质表征
使用Horiba FluoroLog-3荧光分光光度计记录荧光谱和固体绝对量子产率。在装配有氙弧灯(Xe900)和微秒闪光灯(uF900)的Edinburgh FLSP 980荧光分光光度计上测量延迟的PL谱和磷光寿命。使用Hamamatsu绝对PL量子产率光谱仪C11347 Quantaurus_QY测量绝对PL量子产率。用Shimadzu UV-2550分光光度计(Shimadzu公司，Kyoto,Japan)测量UV-vis谱。用3.0mg干粉末样品在PANalytical X’pert PRO Multiple Crystals(粉末)X射线衍射仪上进行X射线衍射(XRD)测量。在Zetasizer Nano ZS90(Malvern)上以90°散射角和He-Ne激光测量水和粒径大小。通过研究TVP-S在具有不同体积比的DMSO与氯仿的混合物中的荧光光谱，证实TVP-S的AIE性质。每组含有10μM AIEgen并且在460nm激发下采集FL谱。
ROS生成的测量
将DCFH用于测量生成的总ROS。将DCFH母液(1.0mM,10μL)加到于1×PBS缓冲液中的含有AIEgen的悬浮液(5.0μM,2.0mL)中，并且将白光(4.2mW/cm2)用于辐照所述悬浮液。在期望的时间点记录DCFH在524nm(488nm激发)处的FL强度。类似地，将HPF母液(5.0mM,2.0μL)和DHR母液(10mM,1.0μL)加到于1×PBS缓冲液中的含有AIEgen的悬浮液(5.0μM,2.0mL)中，激发波长为490nm和505nm，并且将最大发射强度用于跟踪羟基自由基(OH·)和超氧离子(O2 ·-)生成速率。将ABDA指示剂用于监测1O2生成。将ABDA母液(5.0mM,4.0μL)加到含有AIEgen的悬浮液(5.0μM,2.0mL)中，并且用白光(4.2mW/cm2)用于辐照。在不同的辐照时间记录378nm处的吸光度。
TVP-PAP生物偶联物的制备和摩尔比定量
通常，将4.0μL悬浮于DMSO中的TVP-S溶液(1.0mM)与996μL PAP溶液(8.48×1010PFU·mL-1)混合，之后在4℃反应24h。然后用通过氯仿(PBS:氯仿＝50:100(v/v)，三次)萃取的游离AIEgen来纯化所产生的TVP-PAP生物偶联物。根据AIEgen和PAP的标准吸光度-浓度曲线，然后以457nm处的吸光度差异计算AIEgen分子与PAP的摩尔比定量。
细菌培养、成像和实时跟踪
在LB培养基中在37℃以180rpm的振荡速度培养铜绿假单胞菌、MDR铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。在TSB(胰蛋白酶大豆培养液，OXO)培养基中在37℃培养金黄色葡萄球菌。然后经由离心(5000rpm，6min)以完全去除培养基来收获细菌，并将其再悬浮于PBS缓冲液中，为以下实验做好准备。经由使用细胞密度计(Amersham Bioscience,Ultrospec 10)对600nm波长处吸光度的光密度测量来确定细菌悬浮液的浓度。对于用细胞膜和细胞核染料的共染色实验，首先将1.0mL细菌悬浮液(1.0×108CFU·mL-1)与DiO(30nM)和Hoechst33342(20nM)在37℃培育30min。在洗涤3次后，将收集的沉淀物与1.0mL TVP-PAP探针(1.0×109PFU·mL-1)在PBS中在37℃再混合20min。为了进行细菌的荧光成像，将1.0μL染色的细菌溶液滴到显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖。在实时跟踪靶向染色的整个过程期间，样品均被保持在黑暗中，在期望的时间点拍摄荧光照片。为了长时间跟踪TVP-PAP处理后的杀灭过程，在与TVP-PAP探针混合后，将5.0μL的细菌溶液快速滴到显微镜载玻片上，而无盖玻片固定。并且白光辐照从30min开始且持续到80分钟，在期望的时间点拍摄荧光照片。根据实验要求，使用共焦激光扫描显微镜(CLSM,TCS SP8,Leica,Germany)或带汞灯的倒置荧光显微镜(DMi 8,Leica,Germany)采集图像。在CLSM成像下，采用63×或100×油镜。
体外抗细菌测定
通过传统的平铺方法分别评价PAP、TVP-S和TVP-PAP的抗细菌活性。对于处于黑暗中的TVP-PAP组，用不同浓度的TVP-PAP(分别对于铜绿假单胞菌，为3.18×105、6.36×105、9.54×105、1.272×106、1.59×106PFU·mL-1；对于MDR铜绿假单胞菌，为1.59×107、3.18×107、4.77×107、6.36×107PFU·mL-1)分别将1.0×105CFU·mL-1细菌在37℃处理30min。然后，使用1×PBS缓冲液将细菌悬浮液稀释10倍。将100μL的稀释细菌点样到LB板上，具有一式三份平行组。在37℃培养过夜后，然后通过活菌计数对每个板上菌落形成单位(CFU)的存活数计数。基于公式[B/A]×100％计算存活率，其中A为对照样品(仅细菌)中细菌菌落的平均数，并且B为与TVP-PAP培育后的平均细菌数。对于辐照下的TVP-PAP组，将细菌在37℃培育30min，然后用白光再辐照30min。AIEgen的计算浓度在野生型铜绿假单胞菌中为4.33、8.66、12.99、17.32、21.65pM，分别对应于3.18×105、6.36×105、9.54×105、1.272×106、1.59×106PFU·mL-1TVP-PAP；并且在MDR铜绿假单胞菌组中为217、433、650、866pM，分别对应于1.59×107、3.18×107、4.77×107、6.36×107PFU·mL-1TVP-PAP)。并且用等于各组中相应TVP-PAP浓度的PAP的摩尔浓度分开处理作为对照实验。
处理顺序对TVP-PAP抗细菌活性的影响
对于培育辐照组，分别将不同浓度的TVP-PAP(9.54×105、1.272×106和1.59×106PFU·mL-1)与200μL细菌悬浮液(1.0×105CFU·mL-1)培育30min。然后将它们在白光下辐照30min。对于辐照-培育组，首先将相同浓度的TVP-PAP在白光下辐照30min，然后分别与一定体积的细菌悬浮液混合。然后通过琼脂板稀释法评价抗细菌效率。以一式三份平行组设计每个实验。
扫描电子显微术(SEM)
将100μL(2.0×104CFU mL-1)的细菌悬浮液滴在已灭菌的载玻片上，并放入6孔板中。然后将细菌在37℃培养12h并用PBS洗涤，然后滴加TVP-PAP溶液。在37℃培育30min后，然后使处理的细菌在白光下照射30min。再用PBS洗涤两次后，用4％戊二醛将细菌在4℃固定过夜。然后用无菌水洗涤细菌，依序通过不同含量的乙醇(分别为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％,v/v)脱水。将最终样品在临界点干燥烘箱中干燥，然后通过SEM(Hitachi,SU8010)用5kV工作电压进行表征。
哺乳动物细胞培养和TVP-PAP的细胞毒性测定
在带通气盖(vent cap)的25cm2细胞培养板(Corning)上的补充有10％胎牛血清的DMEM中培养HaCaT细胞。使所有细胞均在含CO2(5％)的37℃加湿培育箱中生长。用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液从表面解离出生长到亚汇合的细胞。然后将细胞等分试样接种于96孔板(每孔5×103个细胞)中，并在实验前在含FBS的细胞培养基中生长所需的持续时间。在移出培养基后，添加100μL不同浓度的TVP-PAP，并与细菌在黑暗中共培育30min。对于辐照组，使TVP-PAP处理的细胞暴露于白光30min。对于对照组，使TVP-PAP处理的细胞在黑暗中保持30min。然后通过CCK-8方法测定细胞存活力。详细地说，将含有10μL CCK-8溶液的100μL新鲜培养基添加到每个孔中，并在37℃培育2h，使用微板读取器(Multiscan GO,ThermoScientific)记录在450nm处的吸光度。将每组中的细胞存活力分别与在黑暗或白光辐照中无TVP-PAP处理的对照组进行比较。
体内抗细菌测定
所有动物实验程序均经重庆医科大学动物护理与使用委员会(Animal Care andUse committee of Chongqing Medical University)批准，并符合所有相关伦理规定。雌性BALB/c小鼠(6-8周)购自重庆医科大学实验动物中心(Experimental Animal Centralof Chongqing Medical University)。将BALB/c小鼠随机分为3组：(1)用TVP-PAP处理和白光辐照的细菌感染组；(2)用单独TVP-PAP处理的细菌感染组；(3)无任何处理的细菌感染组(每组中n＝5)。通过注射1.5％戊巴比妥钠将小鼠麻醉。然后在每只小鼠上造成两处全层损伤(直径约6mm)。通过在伤口表面上接种20μL细菌悬浮液(1.0×109CFU·mL-1铜绿假单胞菌或1.0×108CFU·mL-1MDR铜绿假单胞菌)来建立细菌感染伤口模型。在感染后12h后，将20μLPBS或TVP-PAP(对于铜绿假单胞菌组为1.6×1010PFU·mL-1，且对于MDR铜绿假单胞菌组为6.4×1010PFU·mL-1)添加到伤口上并保持30min。随后，将伤口通过白光(约4.2mW·cm-2)辐照30min或保持在黑暗下。在第一天进行TVP-PAP注射和有或无白光辐照的处理，并且再继续两天，总共三次。通过用游标卡尺测量伤口大小，动态地监测伤口愈合过程。在第8天，收获所有感染组织并将其均质化以用于进一步评价。通过琼脂板稀释法评价每只小鼠感染组织的细菌载量。
合成
根据图1合成化合物TVP-S
化合物1的合成.将DMF溶剂(10mL)加到4-甲基吡啶(800μL,8.1mmol)和叔丁醇钾(200mg,1.78mmol)中并且在室温下搅拌30min。然后向混合物中加入4-(N,N-二苯基氨基)苯甲醛(1.1g,4.02mmol)，并在室温下搅拌过夜。然后向反应物中加入过30mL盐水进行猝灭，并且用乙酸乙酯(EA)萃取化合物。将收集的有机层通过无水硫酸钠干燥，并旋转蒸发干燥。使用EA和正己烷的混合物(1:6,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到呈黄色的化合物1固体(1.29g,3.71mmol)，产率为92.3％。1H NMR(Bruker Avance,400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.56(s,2H),7.41-7.22(m,9H),7.13-7.04(m,7H),6.90-6.86(m,2H)；13CNMR(Bruker Avance,100MHz,CDCl3),δ(ppm):148.5,147.3,132.7,129.8,129.4,128.0,124.9,123.9,123.5,122.8。HRMS(EI)：C25H20N2[M±]的计算值：348.1626；实测值：348.1628。
化合物2的合成.将THF溶剂(50mL)加到4-溴丁酸(2.0g,12.0mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.44g,12.5mmol)和N,N'-二环己基碳化二亚胺(2.97g,14.4mmol)中并且在室温下搅拌12小时。将收集的有机层旋转蒸发干燥。并且使用EA和正己烷的混合物(1:4,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到黄色化合物2粗产物，用于下一步骤反应。
TVP-S的合成.将乙腈溶剂(10mL)加到化合物1(200mg,0.58mmol)和化合物2(226mg,0.86mmol)中并且在室温下搅拌24小时。通过旋转蒸发干燥，沉淀出产物。使用DCM和甲醇的混合物(95:5,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到呈红色的TVP-S固体(299.5g,0.49mmol)，产率为84.5％。1H NMR(Bruker Avance,400MHz,CDCl3),δ(ppm):9.16(s,2H),7.98(s,2H),7.71-7.67(m,1H),7.50-7.47(m,3H),7.31-7.20(m,6H),7.12-6.96(m,8H),4.92(s,2H),2.88-2.85(m,6H),2.48(s,2H)；13C NMR(Bruker Avance,100MHz,CDCl3),δ(ppm):169.6,167.9,154.0,150.6,146.4,144.1,142.0,130.0,129.6,127.3,125.8,124.6,123.7,121.0,119.3,58.3,27.8,26.7,25.8。HRMS(EI)：C33H30BrN3O4[M-Br]+的计算值：532.2231；实测值：532.2218。
AIEgen性质表征和与噬菌体的生物偶联
由于结构中存在带正电荷的吡啶鎓基团和亲水性羧基，TVP-S可很好地溶解于包括水在内的极性溶剂中。更重要的是，TVP-S结构中的活化羧基使其能够与生物有机体中广泛存在的氨基直接进行共价偶联反应。TVP-S在400-600nm范围内的明显吸光度(最大值在457nm处)显示出其强的可见光吸收能力(图2b)。由于TVP-S可很好地溶解于大极性的溶剂中，因此我们经由改变CHCl3的体积分数，研究其在二甲亚砜(DMSO)/氯仿(CHCl3)混合溶剂中的AIE特征。如图2c中所示，TVP-S展现出明显的AIE性质。当其溶解于良好的溶剂DMSO中时，几乎不能观察到荧光，而当氯仿的体积分数达到99％时，出现强度增强47倍的聚集态荧光发射(图2d)。它们在聚集态下的最大发射位于630nm处，表明其长波长发射性质和大的斯托克斯位移(Stokes shift)。TVP-S在氯仿中的绝对荧光量子产率(33.3％)相对于在DMSO中的绝对荧光量子产率(1.6％)的显著增加进一步证明了其典型的AIE特征。此外，通过，动态光散射(DLS)结果中明显增加的水和粒径同样证明降低溶剂极性所导致的分子聚集过程的发生(图3)。
TVP-S在可见光区中的强吸收可导致利用白光作为用于基于PDI的抗细菌应用的光源。最初通过使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH)作为指示剂确定TVP-S的ROS生成效率，该指示剂可通过ROS触发的“开启”过程发射荧光。如图4中所示，单独的DCFH是非发射性的，并且在10min的白光照射(约4.2mW·cm-2)期间几乎保持恒定。相比之下，在TVP-S存在下，暴露于白光辐照的同一时期内，DCFH的发射强度逐渐增强并达到23倍。另外，使用9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)作为指示剂和1O2量子产率为约75％的玫瑰红(RB)作为标准品，确定了TVP-S高达72.3％的单态氧(1O2)产率(图2e和图2f以及图5)。在TVP-S存在下，进一步将作为1O2猝灭剂的叠氮化钠(NaN3)添加到ABDA溶液中。如图6中所示，随着NaN3浓度的增加，ABDA分解速率逐渐减慢，2.0mg/mL的NaN3可完全抑制ABDA分解，证实TVP-S确实生成了1O2。同时，羟自由基(OH·)指示剂的羟苯基荧光素(HBF)和超氧自由基(O2 ·-)指示剂的二氢罗丹明(DHR)的荧光信号则无明显变化，表明1O2几乎占据所有比例的TVP-S生成的ROS(图7和图8)。由于1O2应来源于三重态氧与三重激发态光敏剂之间的能量转移过程，因此我们进一步检查了TVP-S中三重态激子的存在。如图9中所示，TVP-S展现出较强的磷光发射，在77K下的寿命长达31.3μs，清楚地证实了其三重激发态的存在。理论上，因为TVP-S含有Br原子，其通常促进有机分子的系间跨越(ISC)过程(著名的重原子效应)。
TVP-S的分子结构中带有活化的羧基，TVP-S可容易地与噬菌体外部蛋白质中的氨基反应，并形成具有AIE特征的噬菌体生物偶联物(TVP-PAP)。如图10a中所示，在AIEgen修饰后，PAP噬菌体在400-500nm范围内所增强的吸光度证明了TVP-S和PAP之间成功的生物偶联反应。根据浓度滴定，计算出TVP-S和PAP的摩尔消光系数分别为1.94×104和3.41×1010M-1·cm-1(图10b和图10c)。并且根据TVP-PAP与单独的PAP在457nm处增强的吸光度差值，TVP-PAP生物偶联物中的TVP-S与PAP的摩尔比约为8200：1。由于所制备的AIE-噬菌体生物偶联物具有高效的ROS生成能力(图11)，因此细菌的识别、实时跟踪和细菌的协同杀伤是可预期的。
特别通过TVP-PAP进行靶向细菌成像
利用噬菌体的特异性识别特征和来自TVP-S的独特AIE性质，首先使用TVP-PAP对其靶细菌(铜绿假单胞菌，缩写为P.a.)进行了细菌成像标记。如图12中所示，在与TVP-PAP培育30min后，铜绿假单胞菌可被亮荧光染色，并且标记效率可达到100％。与商业细胞膜染色染料(DiO)相比，铜绿假单胞菌可被TVP-PAP探针以更高的效率进行荧光点亮标记(图13)。为了测试TVP-PAP中源于噬菌体固有识别能力的特定靶向性，两种类型的细菌，即G-鲍曼不动杆菌(缩写为A.b.，图14)和G+金黄色葡萄球菌(图15)分别被作为对照组。结果显示，即使染色过程延长至60min，TVP-PAP也不能对两种细菌进行染色，两者在AIE荧光通道中都不发出明显的荧光信号。
基于此，TVP-PAP对混合微生物(包括鲍曼不动杆菌(G-)和宿主细菌铜绿假单胞菌(G-))中的细菌染色过程被进一步实时跟踪，以验证其对靶标铜绿假单胞菌的特定选择性。显然，通过监测明场图片和荧光场图片，在整个培育过程中鲍曼不动杆菌均不会被染色。相比之下，TVP-PAP与铜绿假单胞菌之间在共培育10min后开始识别和附着，发出荧光信号。随着时间流逝到30min，荧光信号逐渐变强。并且还进行了更详细的TVP-PAP跟踪，其中细菌的荧光信号在30min后增强达到最大平台值，这与噬菌体靶向结合和感染宿主所需的时间基本一致(图16)。所有的铜绿假单胞菌都被成功染色，而非靶向的鲍曼不动杆菌则不被荧光标记，这些结果证实了TVP-PAP探针对其靶细菌的精确靶向性。AIEgen单独用于经由非特异性静电或疏水—疏水相互作用的细菌成像表明，不可能实现对特定种类细菌的绝对区分。并且由于G-细菌复杂的双层细胞壁的封锁，其稳定有效的标记始终面临挑战。噬菌体作为传感“雷达”，可引导AIEgen实现对靶细菌的区分性点亮成像。并且TVP-PAP携带AIEgen可锚定并聚集在靶细菌的表面上，导致大量AIEgen在局部位点富集，增强其用于细菌的点亮成像的荧光发射。因此，与先前报道的选择性有限的AIEgen相比，通过TVP-PAP生物偶联物可实现对特定类型细菌靶向特异性识别的显著提高。
经由噬菌体引导的光动力学杀伤的靶向抗菌效应
在PAP优异的细菌靶向能力和AIEgen的高效1O2生成效率的基础上，它们对野生型和临床分离的多重耐药型(MDR)铜绿假单胞菌的协同抗菌性能被进一步证实。首先通过检查铜绿假单胞菌的存活率，优化用于培育和白光照明的时间。为避免细菌存活率的瞬间降低，在每组中均添加少量TVP-PAP(9.54×105PFU·mL-1)。如图17中所示，随着培育时间从0延长到30min，细菌存活率从98.3％降低到74.7％，与上述成像过程中的时间一致(图16)。接下来，我们将培育时间固定在30min，然后用白光(4.2mW·cm-2)将细菌悬浮液分别照射2、10、30、60min。在30min的照射后，接近79％的铜绿假单胞菌被根除。延长辐照至60min，功效基本保持不变，表明在该条件下ROS生成效率已达到饱和。此外，调整培育和照明顺序后，细菌存活率显著增加，表明在TVP-PAP引导的ROS在细菌表面上的生成之前，噬菌体靶向和感染的关键作用(图18)。因此，在随后的抗菌试验中，均采用30分钟共培育后再实施光照。
接下来，通过与相同摩尔浓度的单个AIEgen和PAP实体进行比较，测试TVP-PAP的协同抗细菌作用。如图19a中所示，对于野生铜绿假单胞菌来说，在黑暗中培育(对照I-30、对照I-60)与进一步白光辐照(对照I-30和L-30)均不能对细菌存活率构成明显影响。同样，无论有无光照射，单独的TVP-S在所测试的浓度范围(4.33～21.65pM，根据3.18:1～15.9:1摩尔比)内均不能抑制细菌生长。非特异性AIEgen和其在细菌表面上相对低的浓度可能削弱其对细菌的破坏作用。相比之下，在PAP处理后，当其浓度在黑暗下升高到9.54×105PFU·mL-1(根据9.54:1摩尔比)时，开始产生抗菌作用(PAP I-60)。并且当浓度以剂量依赖性方式增加到15.9×105PFU·mL-1(根据15.9:1摩尔比)时，细菌存活率进一步降低到48.3％。这一结果表明TVP-PAP生物偶联物从PAP继承的感染能力。在AIEgen的协助下，TVP-PAP在所测试的浓度范围内在黑暗中的抗菌效率与单独的PAP相比略高(TVP-PAP I-30相对于PAP I-30)，这可能源于富集在铜绿假单胞菌表面上的AIEgen的暗毒性。随着相互作用时间再延长30min(TVP-PAP I-60)，这种暗毒性变得更强，并且在9.54×105PFU·mL-1的浓度下可导致细菌存活率再降低20％。此外，通过利用白光照射下产生的额外PDI活性，可观察到显著增强的抗菌效率(TVP-PAP I-30和L-30)。随着TVP-PAP的浓度增加到1.59×106PFU·mL-1，细菌存活率快速降低到6.9％。细菌菌落涂板进一步证实了TVP-PAP生物偶联物的优异抗菌作用，其远优于单独的TVP-S和PAP(图18)。延伸到临床分离的MDR铜绿假单胞菌，TVP-PAP处理后呈现出类似的剂量依赖性抗菌效果。当TVP-PAP的浓度升高到6.36×107PFU·mL-1时，细菌杀伤效率可达到64.8％(TVP-PAP I-60)。并且在白光照射下，效率升高至99.5％(TVP-PAP I-30和L-30)。相比之下，相同浓度的单独AIEgen(TVP-S I30和L-30)和PAP(PAP I30和L-30)分别只能杀灭7.0％和46.5％的细菌，证实了由AIEgen的PDI活性于噬菌体本身的侵染性所引起的显著协同抗菌效应。
靶向杀灭是抗菌测试中所需考虑的另一关键因素。在本文中，引入PAP的特性，用于细菌区分和靶向杀灭。在双组分系统中，通过分别培养宿主细菌(铜绿假单胞菌(G-))与非宿主细菌(鲍曼不动杆菌(G-)或金黄色葡萄球菌(G+))来检查TVP-PAP。如图19b和图19c中所示，在白光照射下，铜绿假单胞菌被有效地杀灭，并且在TVP-PAP处理后形成了很少的菌落。而鲍曼不动杆菌或金黄色葡萄球菌的菌落量几乎未受影响，这与TVP-PAP针对其靶标的染色结果一致。噬菌体引导靶向在实现上述超级抗菌性能中发挥了关键作用。PAP首先通过其与宿主细菌脂多糖结合的尾部蛋白质来特异性地识别野生铜绿假单胞菌或MDR铜绿假单胞菌。然后，AIEgen(在1.59×106PFU mL-1TVP-PAP中低到21.65pM)在细菌表面上富集。在噬菌体自身的感染过程发生后，在白光照射下AIEgen原位高效生成的1O2可进一步促进对靶细菌的破坏。与先前报道的同样基于PDI但需要高达数μM的AIEgen相比，本文报道的噬菌体引导方法显示出更高的功效，并且将显著减轻类似于传统光敏剂与周围生物分子的非特异性相互作用而导致的细胞毒性隐患。
噬菌体引导的靶向和杀灭过程的跟踪
AIEgen独特的荧光性质也被用于实时监测这一靶向和杀灭过程。如图21中所示，首先通过与TVP-PAP生物偶联物培育实现对铜绿假单胞菌的成功染色，并发出强烈的荧光信号。从30min的时间点开始暴露于白光之后，细菌形态随着光照时间的持续而逐渐变得模糊，在明场中可明显观察到细菌碎片的出现。在荧光场中，在10min照射后，大部分细菌中的荧光信号消失，并且细菌细胞形态呈现明显聚集。细菌形貌和流动性的变化证实了靶细菌遭受的破坏。对于MDR铜绿假单胞菌，在与较高浓度的TVP-PAP(6.36×107PFU·mL-1)的相互作用后进行实时成像跟踪(图22)。同样，在30min共培育后，可观察到细菌碎片，并随着白光照射时间的延长而显著增加，表明MDR细菌遭受的损害逐渐加重。
为了更深入地研究TVP-PAP的抗菌作用，采用SEM成像来监测野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌的形态变化。如图23a中所示，未经TVP-PAP处理，铜绿假单胞菌具有光滑表面、完整的细胞壁和健康的三维形态。相比之下，经TVP-PAP和白光辐照后，铜绿假单胞菌的细胞壁明显变得粗糙，甚至破裂，原有的三维形态消失。此外，细菌表面上出现了大量孔道。这些被噬菌体刺穿的孔将加速1O2渗透到细菌胞质中，并对铜绿假单胞菌造成进一步损害(图23b)。在MDR铜绿假单胞菌的实验组中，也可观察到粗糙细胞表面和塌陷形态的结果，从而验证了来自TVP-PAP生物偶联物的协同作用产生的巨大破坏效应(图24)。
皮肤感染的体内协同根除
受TVP-PAP高效的体外细菌靶向和消除活性启发，我们进一步将抗菌试验扩展到有野生铜绿假单胞菌或MDR铜绿假单胞菌感染性皮肤伤口的小鼠模型上。首先检查TVP-PAP在正常细胞上的生物相容性。如图25中所示，对于黑暗组和白光照射组，即使TVP-PAP浓度上升到8.45×1010PFU·mL-1，HaCaT细胞的存活力仍高达83％。与TVP-PAP培育的HaCaT细胞的成像因不能检测到明显的荧光信号，而进一步证实了其低毒性(图26)。并且这一结果表明TVP-PAP对正常皮肤细胞的优异生物相容性，进一步为其体内抗菌应用提供了基础。
在建立模型后，将野生铜绿假单胞菌感染小鼠和MDR铜绿假单胞菌感染小鼠随机分为3组进行不同处理(如图27a中所示)。伤口的愈合过程清晰表明用TVP-PAP处理的小鼠在处理后第8天伤口接近痊愈(图27b和图27d)。并且野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌感染的伤口相对大小都降低到10％以下，并且均显著小于PBS对照组或单独的TVP-PAP组(图27c和图27e)。在G-细菌感染的实验组中，伤口愈合速度比先前报道的使用AIE聚合物和AIEgen-抗生素偶联物均明显加快，证实了噬菌体所引导的进一步提升的细菌杀灭效率。总之，这些突出的体内试验结果表明TVP-PAP生物偶联物在靶细菌杀灭和感染性疾病治疗中具有巨大的应用潜力。

Claims (21)

1.一种聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物，其包含经由任选的接头共价键合到至少一种聚集诱导发光分子的噬菌体。
2.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种AIEgen是光敏剂。
3.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子具有式1：
Figure FDA0002910906350000011
或其药学上可接受的盐，其中
Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
X是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或共价键；
Y是任选取代的杂芳基或共价键；并且
R1是具有下式的部分：
Figure FDA0002910906350000012
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z是药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头共价键合到Ar1、Ar2、Ar3、X、Y或R1。
4.根据权利要求3所述的生物偶联物，其中Ar1、Ar2和Ar3中的每一个均独立地为任选取代的芳基；X是任选取代的芳基或共价键；并且Y是杂芳基或共价键。
5.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子具有式2：
Figure FDA0002910906350000021
或其药学上可接受的盐，其中
p和t中的每一个均独立地为选自1-5的整数；
u是选自1-4的整数；
R1是具有下式的部分：
Figure FDA0002910906350000031
其中m是选自1-4的整数；
R2在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5、R6和R7中的每一个在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000032
其中w在每种情况下均独立地为选自1-5的整数；并且
R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R、R2、R3、R5、R6、R7或R9处共价键合。
6.根据权利要求5所述的生物偶联物，其中m、p、t、u和w中的每一个独立地为1或2。
7.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子具有式3：
Figure FDA0002910906350000041
或其药学上可接受的盐，其中
R3是烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基、任选取代的杂芳基或-(CH2)nN(R4)3 +Z-，其中n是选自2-8的整数；并且R4在每次出现时均独立地为烷基；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000042
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R3、R5或R6或R9处共价键合。
8.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述任选的接头由下式表示：*-(CR4 2)nJ-**，其中n是选自0-12的整数；J是-(C＝O)-、-(C＝S)-、-NH(C＝O)-或-NH(C＝S)-；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式1的所述发光分子的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
9.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述任选的接头由下式表示：*-(CH2)n(C＝O)-**，其中n是选自2-8的整数，其中*表示与具有式1的所述发光分子的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
10.根据权利要求7所述的生物偶联物，其中所述任选的接头由下式表示：*-(CR4 2)n(C＝O)-**，其中n是选自0-12的整数；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式1的所述发光分子的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点。
11.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子具有式4：
Figure FDA0002910906350000061
或其药学上可接受的盐，其中
R3是由下式表示的接头：*-(CR4 2)n(C＝O)-**，其中n是选自1-10的整数；并且R4在每次出现时均独立地选自由氢和烷基组成的组；或两个R4与它们所共价键合的一个或多个碳一起形成3-7元环烷基，其中*表示与具有式4的所述发光分子的共价连接位点；并且**表示所述噬菌体的共价连接位点；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000062
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
12.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述生物偶联物包含1,000-20,000个所述至少一种发光分子。
13.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子和接头是选自由以下组成的组的部分：
Figure FDA0002910906350000071
或其药学上可接受的盐，其中
n是选自0-4的整数；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000081
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中
Figure FDA0002910906350000084
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
14.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述至少一种发光分子和接头由以下表示：
Figure FDA0002910906350000082
或为其药学上可接受的盐，其中Z是药学上可接受的阴离子；并且
Figure FDA0002910906350000083
表示与所述噬菌体的共价连接位点。
15.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述噬菌体是丝状噬菌体或二十面体噬菌体。
16.根据权利要求1所述的生物偶联物，其中所述噬菌体是肠杆菌噬菌体P7(PAP)。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的生物偶联物和至少一种药学上可接受的辅料。
18.一种式5化合物，
Figure FDA0002910906350000091
或其药学上可接受的盐，其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000092
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；并且
Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
19.一种制备根据权利要求11所述的生物偶联物的方法，所述方法包括：
使式5化合物或其药学上可接受的盐与噬菌体接触，由此形成根据权利要求11所述的生物偶联物：
Figure FDA0002910906350000101
其中
n是选自1-10的整数；
LG是离去基团；
R5和R6中的每一个均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂芳基和R8；
R8表示具有以下结构的部分：
Figure FDA0002910906350000102
其中R9在每种情况下均独立地选自由以下组成的组：氢、卤基、氰基、硝基、-OR、-SR、-N(R)2、-(C＝O)R、-(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2、-N(R)(C＝O)R、-O(C＝O)R、-N(R)(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)2、-SO2R、-SO2N(R)2、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；
R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。
20.一种治疗有需要的受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的生物偶联物，以及在氧存在下用可见光照射所述细菌感染的部位。
21.一种使细菌标记和成像的方法，所述方法包括使根据权利要求1所述的生物偶联物与所述细菌接触；用可见光照射所述细菌；以及检测来自所述生物偶联物的荧光发光。
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