CN113151601A

CN113151601A - Raa-lfd检测鸡马立克病毒野毒株和sc9-1疫苗株的引物和探针组合及其应用

Info

Publication number: CN113151601A
Application number: CN202110453779.2A
Authority: CN
Inventors: 赵鹏; 周亢; 王一新; 常爽
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一种RAA‑LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9‑1疫苗株的引物和探针组合及其应用，包括：引物探针组合A和引物探针组合B；所述引物探针组合A中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示；所述引物探针组合B中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.6所示。本发明使用不同荧光标记MDV野毒株和SC9‑1疫苗株的探针，从而实现了短时间内同时检测鸡体内疫苗毒和野毒的存在情况，检测的灵敏度可达10copies/μL；检测的重复性好、准确度高，为MDV在鸡群中的净化提供了技术支持。

Description

RAA-LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的引物和探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种RAA-LFD(重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流层析试纸条)检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的引物和探针组合及其应用。

背景技术

鸡马立克病(Marek’s disease，MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV) 引起的一种淋巴增生性疾病，其特征是在内脏、肌肉和皮肤及周围的神经组织形成淋巴瘤。根据抗原性的不同，MDV可分为血清型Ⅰ型(MDV-1)、血清型Ⅱ型(MDV-2)和血清型Ⅲ型(MDV-3)。MDV-1是具有致瘤性的强毒分离株及其致弱毒株，MDV-2是自然无致病性毒株，MDV-3是火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey，HVT)，对鸡无致病性。根据致病性的不同，MDV-1强毒株又可分为温和毒(Mild Marek’s virus，mMDV)、强毒(Virulent M arek’sdisease virus，vMDV)、超强毒(Very virulent Marek’s disease virus，vvMDV)及特超强毒(Very virulent plus Marek’s disease virus，vv+MDV)。

当前，对马立克病的预防和控制主要依靠疫苗免疫，现有的疫苗主要包括血清型Ⅰ型疫苗(CVI988/Rispens、814)、血清型Ⅱ型疫苗(SB-1、Z4)、血清型Ⅲ型疫苗(HVT)和多价苗。CVI988/Rispens是国际市场上公认保护力最好的防控马立克病的疫苗之一，MD疫苗的使用在一定程度上能够有效预防MDV的发生。但由于病毒的不断进化，MDV流行毒株的毒力呈现日益增强的趋势，强毒株、超强毒株不断出现，部分毒株可突破CVI988/Ri spens疫苗的保护屏障，导致免疫鸡群暴发马立克病。

针对CVI988/Rispens疫苗免疫失败的问题，崔治中教授实验室开发了一款名为SC9- 1的新型MDV疫苗，该疫苗是在MDV野毒株GX0101株的基础上改造而来的(专利名称：一株重组鸡马立克氏病疫苗病毒SC9-1株的构建和应用，申请公布号：CN102154224 A)。2001年，研究人员从广西省已免疫过CVI988/Rispens疫苗的某蛋鸡场分离到自然重组有REV-LTR的超强毒GX0101，研究人员利用同源重组技术将GX0101中的两个致瘤m eq基因敲除掉，得到了疫苗株SC9-1。与CVI988/Rispens相比，SC9-1株对SPF鸡不仅不再具有致病性，而且能够提供比CVI988/Rispens更好的对超强毒Md5的免疫保护效果；此外，在SC9-1基因组中整合有REV-LTR片段,该片段可以作为区分疫苗毒和野毒的分子标记。SC9-1株疫苗是国内外第一株鸡马立克氏病基因缺失活疫苗，已获得农业农村部核发的《新兽药注册证书》。目前，SC9-1疫苗的相关产品和技术转让给北京翎羽生物科技有限公司、乾元浩生物股份有限公司、中崇信诺生物制药泰州有限公司等国内外多家动保产品生产企业。

现行的检测鸡马立克氏病的标准主要包括国家标准《鸡马立克氏病诊断技术(GB/T 18643-2002)》，行业标准《马立克氏病检疫技术规范(SN/T 1454-2011)》以及《鸡马立克氏病强毒感染诊断技术(NY/T 905-2004)》。这几个技术中主要应用琼脂扩散技术、病理学诊断技术以及病毒的细胞分离技术等。琼脂扩散技术可以快速诊断马立克氏病的病毒抗原或抗体，但无法区分阳性结果是疫苗毒株还是野毒感染。病理学诊断技术要求操作者熟练掌握病理切片制备技术，并且具备一定的病理学理论知识，该方法具有较强的主观性。使用细胞进行病毒分离虽然准确，但对试验设备和操作人员的技术水平要求较高，并且需要能够区分疫苗毒及野毒的特异性单克隆抗体进行鉴别。因此，在SC9-1马立克氏病疫苗应用的基础上，建立能够区分SC9-1马立克氏病疫苗毒株和野毒株的快速检测方法，具有较高的实用价值。

重组酶介导扩增-侧向流层析技术(Recombinase-aid Amplification Lateralflow dipstic k，RAA-LFD)是在重组酶介导扩增技术(Recombinase-aid Amplification)的基础上，将反应下游引物5’端用生物素(biotin)进行标记，并在反应体系中加入一个长度46bp～52 bp的nfo探针，该探针的5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记，距离5’端超过30bp的位置用四氢呋喃(THF)残基标记，3’端被磷酸化阻断，距四氢呋喃「THF」残基15bp以上。反应后形成带有双标记产物，用包被生物素和FAM抗体的侧流试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)实现现场快速检测。RAA-LFD具有较高的灵敏度，可实现结果可视化，且基本无额外购买其他任何辅助装备，仅需39℃恒温装置即可，极端条件下采用一个保温杯即可完成反应得出试验结果，适合适合病原体现场快速筛查，尤其适合实验设备简陋地区和应急情况，该技术目前已经在多种病原检测领域中获得广泛应用。

但目前还未见有利用RAA-LFD技术检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种RAA-LFD检测鸡马立克病毒野毒株和 SC9-1疫苗株的引物和探针组合及其应用。本发明使用不同荧光标记MDV野毒株和SC9-1疫苗株的探针，从而实现了短时间内同时检测鸡体内疫苗毒和野毒的存在情况，检测的灵敏度可达10copies/μL；检测的重复性好、准确度高，为MDV在鸡群中的净化提供了技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种RAA-LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的引物和探针组合，包括：引物探针组合A和引物探针组合B；

所述引物探针组合A中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，具体如下：

上游引物Meq-LFD-F：5’-CATAGGGCAAACTGGCTCATGACAAGCCAAC-3’；(SE Q IDNO.1)

下游引物Meq-LFD-R：5’-[Biotin]GCAGACGTACTATGTAGACAAACTCCATGAA-3’； (SEQID NO.2)

探针Meq-LFD-P：[FAM]TGCACGCAGGGACGTGCACTCAGTCCTTAGAT[THF]TCGAATTTCCTTACGT[C3-spacer]；(SEQ ID NO.3)

所述引物探针组合B中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示，具体如下：

上游引物LTR-LFD-F：5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATG-3’；(SE Q IDNO.4)

下游引物LTR-LFD-R：5’-[Biotin]CTCCTCTCACTGCCAATCTGAGGATATAG-3’；(S EQID NO.5)

探针LTR-LFD-P：[FAM]AGCCAGGTGCATCTCTTGCTCGGGGTCGCCGTC[THF]TACACATTGTTGTGACGT[C3-spacer]；(SEQ ID NO.6)

本发明的第二方面，提供上述引物和探针组合在制备检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供一种检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物和探针组合。

进一步的，所述试剂盒中还包括：RAA-nfo反应试剂和侧流层析试纸条。

优选的，所述RAA-nfo反应试剂包括：A buffer和B buffer。

本发明的第四方面，提供一种利用上述试剂盒检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的方法，包括如下步骤：

提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测。

优选的，RAA扩增的反应体系为：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物2μL；下游引物2μL；探针0.6μL；模板2μL。

更优选的，RAA-LFD-Meq扩增的反应体系为：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物Meq-LFD-F(0.5μmol)2μL；下游引物Meq-LFD-R(0.5μmol)2μL；探针Meq-LFD-P(0.5μmol)0.6μL；模板2μL；

RAA-LFD-LTR扩增的反应体系：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物LTR-LFD-F (1μmol)2μL；下游引物LTR-LFD-R(1μmol)2μL；探针LTR-LFD-P(1μmol)0.6μL；模板 2μL。

优选的，RAA扩增的条件为：39℃恒温下反应10min。

优选的，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测的方法为：将RAA-LFD扩增产物，用洁净PBS 5倍稀释，吸取10μL滴加到侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条插入到含有200μL缓冲液的EP管中，3min后观察结果。

本发明的有益效果：

本发明建立了基于RAA-LFD的MDV检测方法，分别可以特异性扩增MDV野毒和 SC9-1疫苗毒。该方法仅需等温扩增设备和制备好的试纸条，操作简便；本方法通过试纸条的条带判断结果，操作简便，可视性好；此外，本方法可以有效区分野毒和SC9-1疫苗毒，为将来实现MDV在中国鸡群中的净化奠定了基础。

附图说明

图1：RAA-LFD引物探针自连情况；图中A为meq基因，B为LTR基因。

图2：RAA-LFD引物探针浓度优化；图中A为meq基因结果；B为LTR基因结果；1、 3、5、7分别为引物探针浓度为0.25、0.5、1、2μM阳性检测结果；2、4、6、8分别为引物探针浓度0.25、0.5、1、2μM阴性对照。

图3：RAA-LFD反应时间优化；图中A为meq基因检测结果；B为LTR基因检测结果；1-5分别为扩增3、5、10、15、20min。

图4：RAA-LFD上样时间优化；1-11分别为试纸条孵育0s、30s、60s、1min30 s、2min、2min30 s、3min、3min30 s、4min、4min30 s、5min。

图5：RAA-LFD特异性考察结果；图中A为meq基因检测结果；B为LTR基因检测结果；1-7分别为MDV SC9-1株、MDV Md5株、CIAV、FAdV、ALV-J、REV、HEV基因组DNA，8为阴性对照。

图6：阳性标准质粒目的片段扩增电泳图；M为DNA Marker；1为meq基因扩增片段；2为LTR基因扩增片段。

图7：RAA-LFD灵敏性考察结果；图中A为meq基因检测结果；B为LTR基因检测结果；1-5分别为10⁴～10⁰copies/μL质粒标准品；6为阴性对照。

图8：RAA-LFD重复性试验结果；图中A为meq基因检测结果；B为LTR基因检测结果；1-3、4-6、7-9分别为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL质粒标准品； 10为阴性对照。

图9：体内样本灵敏度试验；图中A为meq基因RAA-LFD检测结果；B为LTR基因RAA-LFD检测结果；C为meq基因FQ-PCR检测结果；D为LTR基因FQ-PCR检测结果；1-7为3.8×10²ng/μL～3.8×10^-4ng/μL MDV Md5株基因组样本DNA；8-14为4.1 ×10²ng/μL～4.1×10^- ⁴ng/μL MDV SC9-1株基因组样本DNA。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，与CVI988/Rispens相比，SC9-1株对SPF鸡不仅不再具有致病性，而且能够提供比CVI988/Rispens更好的对超强毒Md5的免疫保护效果。因此，在SC9-1马立克氏病疫苗应用的基础上，建立能够区分SC9-1马立克氏病疫苗毒株和野毒株的快速检测方法，具有较高的实用价值。

基于此，本发明建立了检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的RAA-LFD方法。根据RAA引物的试剂要求，本发明设计了两对针对MDV野毒和SC9-1疫苗毒的引物和探针进行RAA扩增。第一对引物用于扩增MDV野毒的Meq基因，上游引物序列Meq-L FD-F为：5’-CATAGGGCAAACTGGCTCATGACAAGCCAAC-3’，下游引物序列Meq-LF D-R为：5’-[Biotin]GCAGACGTACTATGTAGACAAACTCCATGAA-3’，探针Meq-LFD- P序列为：[FAM]TGCACGCAGGGACGTGCACTCAGTCCTTAGAT[THF]TCGAATTTCCT TACGT[C3-spacer]。

第二对引物用于扩增SC9-1疫苗毒的LTR片段，上游引物序列LTR-LFD-F为：5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATG-3’，下游引物序列LTR-LFD-R5为：5’ -[Biotin]CTCCTCTCACTGCCAATCTGAGGATATAG-3’，探针LTR-LFD-P序列为：[FAM] AGCCAGGTGCATCTCTTGCTCGGGGTCGCCGTC[THF]TACACATTGTTGTGACGT[C3- spacer]。

按照RAA-nfo试剂盒配置50μL反应体系：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物2μL；下游引物2μL；探针0.6μL；模板2μL。其中，A buffer和B buffer均为RA A-nfo试剂盒自带的内部缓冲液，为市售产品。

在39℃水浴下反应8-15min后，在侧流层析试纸条上滴加10μL RAA扩增产物，将试纸条插入含有100μL缓冲液(洁净PBS)的EP管中，3min后观察结果。当出现2条红色带时(一条在质控区，另一条在测试区)为阳性，说明样品中含有待检测的核酸片段；如果只出现一条红色带(在质控区)，则为阴性，说明其中不含有待检测片段。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株RAA-LFD检测方法的优化与建立

1.RAA引物与探针的设计

RAA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。不同于常规的PCR检测，有关RAA 引物和探针设计的相关数据较少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。为设计能够用于鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株检测的RAA引物与探针，本发明主要考虑了以下因素：

(1)对于RAA-LFD反应引物的设计：

由于重组酶作用原理的特性，RAA引物设计长度通常在30～35bp之间，引物Tim值不作为设计时主要考虑因素，应尽量避免引物自身形成二级结构、引物与引物互作和发卡结构等，同时避免4个以上的连续单碱基出现，引物5’端前5个碱基优选胞嘧啶(C) 同时应避免鸟嘌呤(G)，引物3’末端3个碱基增加G和C有助于提升引物扩增特性，引物GC含量处于30％-70％区间能保持引物自身的稳定性也更适合RAA扩增。最佳引物要求其扩增产物单一、扩增产物在100-300bp之间最佳、无非特异性扩增、无明显引物二聚体。将反应下游引物5’端用生物素(Biotin)进行标记。

(2)RAA-LFD反应体系中的探针设计：

nfo探针长度为46bp～52bp，该探针的5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记，距离5’端超过30bp的位置用四氢呋喃(THF)残基取代一个碱基，3’端被磷酸化阻断防止探针自延伸，距四氢呋喃(THF)残基15bp以上。

(3)RAA-LFD反应体系引物探针自连性分析

由于RAA扩增产物需要上样侧流层析试纸条(LFD)，而在侧流层析试纸条上的反应本质上是以RAA扩增产物为抗原，与侧流层析试纸条上包被的抗体进行反应，这种抗原抗体结合显色的反应极其灵敏，即便是极其微小的非特异性扩增产物出现也能造成检测的假阳性。因此在引物探针设计之初就应核实探针和引物之间的结合状态。

基于上述因素(1)和(2)的考虑，本发明设计了系列用于鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株检测的引物和探针组合。然后将所设计的引物和探针组合进行自连性分析，原则上被Biotin标记的下游引物序列与RAA-LFD探针的5’端至四氢呋喃(THF)中间的序列互补性要足够低。本发明最终设计得到两对针对MDV野毒和SC9-1疫苗毒的引物和探针。第一对引物用于扩增MDV野毒的Meq基因，上游引物序列Meq-LFD-F为：5’-CATAGGGCAAACTGGCTCATGACAAGCCAAC-3’，下游引物序列Meq-LFD-R为：5’-[Biot in]GCAGACGTACTATGTAGACAAACTCCATGAA-3’，探针Meq-LFD-P序列为：[FAM] TGCACGCAGGGACGTGCACTCAGTCCTTAGAT[THF]TCGAATTTCCTTACGT[C3-space r]。

本发明优化设计的2对引物和探针中，被Biotin标记的下游引物序列(Meq-LFD-R/L TR-LFD-R)与RAA-LFD探针(Meq-LFD-P/LTR-LFD-P)的5’端至四氢呋喃(THF)中间的序列互补性足够低(图1)，从而提高了检测的特异性。

2.RAA-LFD检测体系的优化

在优化设计得到RAA引物与探针之后，本发明进一步对RAA-LFD检测体系进行了优化，具体为：

(1)RAA-LFD引物探针浓度筛选：

以构建的pMD18-Meq和pMD18-LTR质粒标准品10⁵copies/μL为模版，在不改变添加引物探针体积的情况下，改变引物及探针的浓度(0.25、0.5、1、2μM)，优化引物探针终浓度，避免假阳性的产生。结果见图2。

结果表明：对于meq基因而言，在试纸条质控线全部成立的情况下，引物及探针浓度均为0.25μM时，阳性模版检测线不清晰，阴性对照无检测线；引物及探针浓度均为2μ M时，阳性模版检测线清晰，但阴性对照出现假阳性；引物探针浓度为0.5μM和1μM 时，阳性模版检测线显色一致且阴性对照无显色，因此，从节约成本的角度考虑，Meq-R AA-LFD方法最终引物探针浓度选用0.5μM进行后续试验。对于LTR基因而言，在试纸条质控线全部成立的情况下，引物探针浓度为0.25μM和0.5μM时，虽然阴性对照无检测线，但阳性模版检测线不清晰；引物探针浓度为1μM时，阳性模版检测线清晰且阴性无显色；引物探针浓度为2μM时，阴性对照出现假阳性显色，因此，RAA-LFD-LTR方法最终引物探针浓度选用1μM进行后续试验。

(2)RAA-LFD鉴别方法扩增时间优化：

为确定RAA-LFD鉴别方法最佳反应时间，以构建的pMD18-Meq和pMD18-LTR质粒标准品10⁵copies/μL为模版进行RAA-LFD扩增。配置多个RAA-LFD反应管，在扩增反应进行3、5、10、15、20min时分别取出反应管置于冰上终止反应，结合侧向层析免疫试纸条检测，观察不同扩增时间的结果变化，结果见图3。结果显示，RAA-LFD鉴别方法所有试纸条均可以看到清晰的质控线，当扩增3min时未出现检测线，扩增5min时检测线有条带但不足够清晰，扩增10min后检测线显色清晰明显，证明扩增反应时间虽然从5min开始就有很好的检测效果，但若能适当延长反应时间到10min，则能获得更好的显色效果，最终针对meq/LTR的RAA-LFD鉴别方法均以10min作为反应的扩增时间。

(3)RAA-LFD鉴别方法上样孵育时间优化

LFD孵育时间是影响试纸条中抗原抗体相互作用的重要因素。以相同反应体系、最佳反应时间下优化扩增产物上样时间，观察不同孵育时间(0s、30s、60s、1min30 s、2 min、2min30 s、3min、3min30 s、4min、4min30 s、5min)检测线的显色状态，最终确定最快速准确的孵育时间，结果见图4。结果显示在3min以后液体层析完全结束，可显示清晰明显的检测线和质控线，因此选用3min作为阳性判定时间，挼在3分钟内检测结果显示为双线的样品为阳性，若在3min内只有控制线显色，则判定为阴性。RAA- LFD鉴别方法最终反应条件和体系。

通过对RAA-LFD鉴别方法反应条件和体系优化后，最终确定Meq-RAA-LFD检测方法最佳反应体系条件为：引物、探针浓度均为0.5μM，39℃反应10min，上样显色时间为 3min；LTR-RAA-LFD检测方法最佳反应条件为：引物、探针浓度均为1μM，39℃反应 10min，上样显色时间为3min。

实施例2：RAA-LFD检测方法的方法学考察

1、特异性考察：

以提取的MDV SC9-1株与MDV Md5株、CIAV、FAdV、ALV-J、REV、HEV的病毒DNA或反转录合成的cDNA为模版，同时设置无菌双蒸水作为阴性对照，以建立的R AA-LFD鉴别方法进行检测，结果见图5。

结果显示，所有试纸条均有质控线且阴性对照成立，检测结果有效，只有当模版为M DV SC9-1株和MDV Md5株基因组DNA时试纸条会出现清晰的检测线，而其他DNA 或cDNA模版试纸条检测线无显色，且所有的试纸条质控条带正常显示，说明建立的RA A-LFD鉴别方法具有良好的特异性。

2.灵敏度考察：

以MDV SC9-1株和MDV Md5株基因组DNA为模版，参照文献中MDV引物(见表2-4)(段伦涛等，2014)，扩增得到meq基因569bp和LTR基因512bp的特异性PCR 产物(见图6)，将扩增片段纯化后克隆至pMD18-T载体，制备重组质粒，经测序鉴定正确，命名为pMD18-Meq和pMD18-LTR。重组质粒pMD18-Meq和pMD18-LTR碱基数分别为3261bp和3204bp，经紫外分光光度计测定三次浓度取平均值分别为109.043ng /μL和109.942ng/μL，并按照公式计算拷贝数分别为3.05×10¹⁰copies/μL和3.25×10¹⁰ copies/μL，10倍梯度稀释为10⁹copies/μL～10⁰copies/μL的质粒标准品备用。

以构建的pMD18-Meq和pMD18-LTR质粒标准品10⁴copies/μL～10⁰copies/μL浓度梯度为模版，同时设置无菌双蒸水作为阴性对照，以建立的RAA-LFD鉴别方法进行检测，确定最小检出量，评价该方法的灵敏性，结果如下(见图7)。结果显示，所有试纸条均有质控线且阴性对照成立，检测结果有效，阳性模版从10⁴copies/μL～10¹copies/μL浓度区间的检测线清晰可见，并且发现有检测线随浓度模版的增大而颜色逐渐变深的现象。因此，针对meq基因和LTR基因的RAA-LFD鉴别方法检测下限均为10¹copies/μL的质粒标准品。

3.重复性考察：

以构建的pMD18-Meq和pMD18-LTR质粒标准品10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL浓度为模版，同时设置无菌双蒸水作为阴性对照，进行RAA-LFD鉴别方法重复性试验，每个浓度梯度重复3次，评价方法的稳定性和重复性，结果见图8。结果显示，所有试纸条质量控线均能正常显色且阴性对照成立，检测结果有效，3个不同梯度的阳性模版均能稳定显示检测线，可以稳定检出，证实该方法具有良好的重复性。

实施例3：临床样本检测

1、动物实验设计：

设计动物实验通过实验室环境模拟鸡群SC9-1疫苗免疫后感染野毒，获取体内样本验证建立方法可靠性。从济南斯帕法斯公司购买20只1日龄SPF雏鸡，饲养于负压隔离器内。1日龄免疫SC9-1疫苗株颈部皮下免疫剂量为每只鸡0.2mL(一羽份)，5日龄腹腔注射超强毒株Md5感染剂量为每只鸡0.2mL(500PFU)，在超强毒株感染后5、10、14、 21d采集羽毛和抗凝血，随机选取50份样本，提取羽毛囊和淋巴细胞DNA备用。

2、四种鉴别方法体内样品检出率试验

以动物实验获取的羽毛囊和淋巴细胞50份DNA样本为模版，使用本发明建立的针对 meq基因的RAA-LFD和FQ-PCR方法检测，两种方法的阳性率均为54％；使用建立的针对LTR基因的RAA-LFD和FQ-PCR方法检测，两种方法的阳性率均为76％。FQ-PCR结果与RAA-LFD检测阳性结果完全一致，说明建立的RAA-LFD在临床样品检测中同样具有适用性。

3、鉴别方法基因组样本灵敏性试验

使用FQ-PCR鉴别方法验证过的体内样品，从中选择meq基因Cq值为20.42、浓度为3.8×10²ng/μL的样本，10倍稀释后作meq基因基因组样本模版，从中选择LTR基因 Cq值为20.1、浓度为4.1×10²ng/μL的样本，10倍稀释后作为LTR基因基因组样本模版，同时使用RAA-LFD和FQ-PCR鉴别方法进行检测，结果如下(见图9)。结果显示，针对meq基因建立的FQ-PCR和RAA-LFD方法基因组样本最低检测下限为3.8×10^-2ng/μL；针对LTR基因建立的FQ-PCR和RAA-LFD方法基因组样本最低检测下限为4.10×10^-2 ng/μL，结果证实建立的RAA-LFD与FQ-PCR鉴别方法灵敏度相同。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> RAA-LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的引物和探针组合及其应用

<130> 2021

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catagggcaa actggctcat gacaagccaa c 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagacgtac tatgtagaca aactccatga a 31

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcacgcagg gacgtgcact cagtccttag attcgaattt ccttacgt 48

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catactgagc caatggttgt aaagggcaga tg 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcctctcac tgccaatctg aggatatag 29

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agccaggtgc atctcttgct cggggtcgcc gtctacacat tgttgtgacg t 51

Claims

1.一种RAA-LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的引物和探针组合，其特征在于，包括：引物探针组合A和引物探针组合B；

所述引物探针组合A中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；

所述引物探针组合B中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的试剂或试剂盒中的应用。

3.一种检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：RAA-nfo反应试剂和侧流层析试纸条。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA-nfo反应试剂包括：A buff er和B buffer。

6.一种利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒检测鸡马立克病毒野毒株和SC9-1疫苗株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的反应体系为：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物2μL；下游引物2μL；探针0.6μL；模板2μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的条件为：39℃水浴下反应10min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测的方法为：将RAA扩增产物滴加到侧流层析试纸条上，然后将侧流层析试纸条插入到含有缓冲液的EP管中，3min后观察结果。