CN113151116A - 一株可清除壬基酚的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可清除壬基酚的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1174，此植物乳杆菌CCFM1174能够清除壬基酚，具体体现在：将此植物乳杆菌CCFM1174添加至壬基酚溶液中培养6h，即可使壬基酚溶液中壬基酚的清除率达44.91％，可见，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1174在制备壬基酚清除剂并清除食品体系中的壬基酚中具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株可清除壬基酚的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
壬基酚(Nonylphenol，简称NP)是一种有机化合物，分子式为C15H24O，是重要的精细化工原料和中间体。壬基酚外观在常温下为无色或淡黄色液体，略带苯酚气味，不溶于水，溶于丙酮。主要用于生产表面活性剂、也用于抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。壬基酚属有机污染物，有“精子杀手”之称。
壬基酚(Nonylphenol，NP)作为乳化剂广泛应用于工业、农业、日用品的生产中，其可由污水排入水体环境。NP在环境中难于降解，具有高度脂溶性和生物蓄积性，可通过皮肤、黏膜、呼吸道、胃肠道等进入人体。由于壬基酚具有神经毒性、免疫毒性、生殖毒性和致癌性，这些被吸收的壬基酚通过血液循环系统广泛分布于人体各个组织时，壬基酚因其脂溶性，易在脂肪含量比较高的组织中积累，会对人体造成严重的损害，目前较多关于NP生殖和发育毒性的研究表明，NP的毒性机制主要源于其对内分泌的干扰作用，可对鱼类、两栖动物及哺乳动物多种器官产生不良作用：包括影响生殖、内分泌、免疫、消化、泌尿等系统的功能，因此，为保持机体健康，人群需避免暴露于存在壬基酚的环境中。但是，壬基酚在环境中是广泛存在的，壬基酚扩散在河流、土壤中后经由食物链最终在人类组织中富集。可见，人们在日常生活中几乎无法避免的会暴露于存在壬基酚的环境中。许多研究已经在食品中检测到壬基酚，包括新鲜水果、蔬菜、海鲜和肉类。一项研究调查了台湾北部、中部、南部和东部常见食品中的壬基酚浓度，在该研究中，牡蛎中的壬基酚浓度最高，平均含量达到235.8ng/g。因此有理由推测人类接触壬基酚的主要途径是通过食物摄入的。一项研究检测了食物样品中壬基酚的浓度，其中，144个样品中的143个均检测到了壬基酚，其浓度为30ng/kg至1268μg/kg。在调查的所有省份中，牛奶中壬基酚的含量均远高于其他食品。壬基酚已在食物中广泛暴露，一些人群的日常接触量已经超过了安全值。欧洲食品安全局给出的壬基酚每日耐受摄入量是5μg/kg bw/d，据估计，0-6岁婴儿从配方奶粉中平均摄入壬基酚的范围为300ng/kg bw/d至17μg/kg bw/d。对于0至1岁的婴儿，摄入量为5至17μg/kg bw/d。因此，探索减除食品中壬基酚的有效途径具有重要的意义。
目前对壬基酚的清除技术依赖物理减除、化学氧化和生物降解手段，物理减除、化学氧化无法有效去除食物中的壬基酚，目前对壬基酚的清除技术中的生物降解手段采用的全是非食用菌，不可用于食品。例如，公开号为CN110819353B的中国发明专利当中，公开了一种布氏白僵菌SB010在壬基苯酚生物降解中的应用，公开号为112522131A的中国发明专利共公开了一种根瘤菌，NPLJ-2在好氧条件下对水体中的壬基酚的生物降解率可达到80％以上。但这些非食用菌并不能用于被壬基酚污染的食品，且也无法清除已经被摄入人或动物体内的壬基酚，也就无法对壬基酚造成的毒性起到保护作用。
目前缓解壬基酚中毒症状的药物很少，虽然一些研究发现褪黑素、组氨酸、桑葚提取液等抗氧化物质，可通过抗氧化的途径缓解神经毒性或者肝损伤，但是，这些抗氧化的物质的提取及制备的成本高，不利于大规模的工业生产。
因此，急需找到一种可有效减除环境尤其是食品中壬基酚的产品，在壬基酚被肠道吸收前就清除掉壬基酚，以此来减缓人群过量摄入壬基酚带来的伤害。
发明内容
为解决现有技术当中存在的问题，本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61551。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，是从来源于发酵食品样本中分离得到的。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列为TCATCAGCAATGATCAACAATGGCTTGCCTTGTT
CAACGATGGATTGTAATAGTGGTAAGATATCTTGAATGTTTGAAATCTTCTTATCAGTAATTAAGATATATGGATTGTCAAGATCCGCTTCCATCTTATCATTATCAGTAACCATGTATTGTGATAAGTAGCCGCGGTCGAATTGCATCCCTTCAACAACGTCTAAACTAGTATCAACACCACGTGATTCTTCAATCGTGATAACACCGTCATGACCAACTTTTTCCATGGCTTCGGCAATCAATTTACCAGTTTCTTCACTTGCTGAAGATACAGAAGCGATTTGCGCAATATCTTCTTGCGTCTTAACTTCGTGTGCCATAGCGTGTAATGAGTCAACCGCCGTCTTAGTAGCTTCTTCAATCCCACGACGAATGCCAACAGGGTTAGCACCAGGGG，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174。
所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174在MRS培养基上的菌落呈圆形白色凸起，表面光滑。
本发明还提供了含有上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，上述植物乳杆菌LactobacillusplantarumCCFM1174在微生物菌剂中的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174在降解环境中壬基酚方面的应用，所述环境为非生物体内的环境。
在本发明的一种实施方式中，所述环境包括食品加工环境、食品酿造环境、乳制品环境、果蔬制品环境。
本发明还提供了一种可缓解壬基酚中毒症状的组合物，所述组合物中含有上述所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCCFM1174在组合物中的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物为食品、药品或壬基酚清除剂。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为使用含有上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有植物乳杆菌的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为含有上述植物乳杆菌CCFM1174的饮料或零食。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述植物乳杆菌CCFM1174接种到培养基中在厌氧环境下进行培养，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水或缓冲液清洗后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum CCFM1174、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药品中，上述植物乳杆菌CCFM1174的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述植物乳杆菌CCFM1174、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明还提供了上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174在制备预防和/或治疗壬基酚暴露的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或化学品。
本发明还提供了上述植物乳杆菌或上述产品在清除壬基酚中的应用。
有益效果
本发明提供了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174，此植物乳杆菌CCFM1174能够清除壬基酚，具体体现在：将此植物乳杆菌CCFM1174添加至壬基酚溶液中培养6h，即可使壬基酚溶液中壬基酚的清除率达44.91％，可见，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1174在制备壬基酚清除剂中具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174，分类学命名为Lactobacillus plantarum，已于2021年03月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61551，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同植物乳杆菌清除水溶液中壬基酚的清除率。
图2：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CCFM1174清除发酵果汁中壬基酚的清除率。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的植物乳杆菌QHLJZD13L6、QHLJZD16L2、QHLJZD18L5、QHLJZD29L2、PCQWS1M2、PCQYB1M3、PCQDDK5M2、QHLJZD26L1、QHLJZD23L2、QHLJZD20L2、PCQDJ1M5、PCQKX1M2、QHLJZD4L1、PCQLP6M2、PCQYD1M3、VJLHD14L1、DHuNHHMY3L2、PCQZX1M2、FCQNA32M4、FCQNA35M1、FSCPS6L4、FSCPS8L3、FSCPS35L5、VJLHD12L4、VJLHD16L1、VJLHD18L1、FCQNA23M1、FCQNA27M4、FCQNA28M4、FCQNA29M3、FCQNA30M6、FCQNA31M2、PCQYC1M1、DJXSRYG1L1、QHLJZD24L1、QHLJZD21L1、FSCDJY93L1、FSCDJY69L1、LABCCIMAU70104、ZS2058、LABCC IMAU80120购自于江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心。
下述实施例中所涉及的植物乳杆菌CCFM8661记载于公开号为CN111869735A的中国发明专利申请文本中；植物乳杆菌CCFM8610记载于公开号为CN109498660A的中国发明专利申请文本中；植物乳杆菌CCFM191记载于“植物乳杆菌耐受重金属镉的生理机制解析，肖越，江南大学”论文中；植物乳杆菌CCFM232记载于“泡菜中生物转化共轭脂肪酸的植物乳杆菌，杨波等”论文中；植物乳杆菌CCFM231记载于“具有拮抗肠侵袭性大肠杆菌作用的乳酸菌的筛选和研究，刘文玉，江南大学”论文中；植物乳杆菌CCFM175、植物乳杆菌CCFM408记载于“植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露诱导肠道损伤的效果评价及机制探究，吴江萍，江南大学”论文中；植物乳杆菌CCFM241记载于“生物转化共轭亚油酸乳杆菌的筛选，夏嘉祎等”论文中；植物乳杆菌CCFM242记载于“The synergistic effect of Lactobacillusplantarum CCFM242 and zinc on ulcerative colitis through modulatingintestinal homeostasis”论文中；植物乳杆菌CCFM240记载于“生物转化共轭亚麻酸的植物乳杆菌”论文中；植物乳杆菌CCFM634记载于“Identification of TLR2/TLR6signalling lactic acid bacteria for supporting immune regulation.”论文中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的植物乳杆菌菌体的制备方法如下：
将植物乳杆菌菌液划线于MRS固体培养基上，37℃厌氧条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到植物乳杆菌菌体。
实施例1：植物乳杆菌CCFM1174的获取
具体步骤如下：
1、分离纯化
(1)稀释涂布：以泡菜发酵食品为样本，吸取0.5g保存于30％(v/v)甘油中的样本在无菌环境下加入装有4.5mL生理盐水的10mL离心管中，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；
(2)涂布培养：分别吸取100μL步骤(1)获得的10-4、10-5、10-6三个梯度稀释液涂布于LFMATA固体培养基上，37℃培养48h，得到稀释涂布平板；
(3)一级纯化培养：取步骤(2)获得的菌落数在30～300区间的稀释涂布平板，在每个稀释涂布平板上随机挑选10个乳白色或白色，表面光滑，边缘整齐，大小不一的单菌落在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；
(4)二级纯化培养：取步骤(3)获得的单菌落分别接种至MRS液体培养基中，37℃培养20h，得到菌液。
2、菌种鉴定
将分离纯化的各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)中所记载的步骤进行菌株鉴定、革兰氏染色、生理生化等实验，选取具有植物乳杆菌典型特征的菌株，经实验获得一株菌，将此菌株命名为植物乳杆菌CCFM1174；
其中，菌株鉴定过程如下：
提取植物乳杆菌CCFM1174的基因组，将CCFM1174的16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，将测序分析得到的CCFM1174的16S rDNA序列为TCATCAGCAATGATCAACAATGGCTTGCCTTGTTCAACGATGGATTGTAATAGTGGTAAGATATCTTGAATGTTTGAAATCTTCTTATCAGTAATTAAGATATATGGATTGTCAAGATCCGCTTCCATCTTATCATTATCAGTAACCATGTATTGTGATAAGTAGCCGCGGTCGAATTGCATCCCTTCAACAACGTCTAAACTAGTATCAACACCACGTGATTCTTCAATCGTGATAACACCGTCATGACCAACTTTTTCCATGGCTTCGGCAATCAATTTACCAGTTTCTTCACTTGCTGAAGATACAGAAGCGATTTGCGCAATATCTTCTTGCGTCTTAACTTCGTGTGCCATAGCGTGTAATGAGTCAACCGCCGTCTTAGTAGCTTCTTCAATCCCACGACGAATGCCAACAGGGTTAGCACCAGGGG，在GenBank中进行比对结果显示此菌株确为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CCFM1174。
植物乳杆菌CCFM1174的形态特征为：圆端直杆菌；菌落特征为：圆形白色凸起，表面光滑。
实施例2：植物乳杆菌CCFM1174对壬基酚的清除作用
具体步骤如下：
(1)菌液的制备：
取植物乳杆菌菌液在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h后，得到单菌落；用无菌接种环挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
然后以2％(v/v)的接种量将活化液接入MRS液体培养基，37℃条件下培养18h，得到菌液；此时，菌液的浓度为：3×109cfu/mL。
按照上述方法分别制备得到植物乳杆菌QHLJZD13L6菌液、植物乳杆菌QHLJZD16L2菌液、植物乳杆菌QHLJZD18L5菌液、植物乳杆菌QHLJZD29L2菌液、植物乳杆菌PCQWS1M2菌液、植物乳杆菌PCQYB1M3菌液、植物乳杆菌PCQDDK5M2菌液、植物乳杆菌QHLJZD26L1菌液、植物乳杆菌QHLJZD23L2菌液、植物乳杆菌QHLJZD20L2菌液、植物乳杆菌PCQDJ1M5菌液、植物乳杆菌PCQKX1M2菌液、植物乳杆菌QHLJZD4L1菌液、植物乳杆菌PCQLP6M2菌液、植物乳杆菌PCQYD1M3菌液、植物乳杆菌VJLHD14L1菌液、植物乳杆菌DHuNHHMY3L2菌液、植物乳杆菌PCQZX1M2菌液、植物乳杆菌FCQNA32M4菌液、植物乳杆菌FCQNA35M1菌液、植物乳杆菌FSCPS6L4菌液、植物乳杆菌FSCPS8L3菌液、植物乳杆菌FSCPS35L5菌液、植物乳杆菌VJLHD12L4菌液、植物乳杆菌VJLHD16L1菌液、植物乳杆菌VJLHD18L1菌液、植物乳杆菌FCQNA23M1菌液、植物乳杆菌FCQNA27M4菌液、植物乳杆菌FCQNA28M4菌液、植物乳杆菌FCQNA29M3菌液、植物乳杆菌FCQNA30M6菌液、植物乳杆菌FCQNA31M2菌液、植物乳杆菌PCQYC1M1菌液、植物乳杆菌CCFM1174菌液、植物乳杆菌QHLJZD24L1菌液、植物乳杆菌QHLJZD21L1菌液、植物乳杆菌FSCDJY93L1菌液、植物乳杆菌FSCDJY69L1菌液、植物乳杆菌LABCC IMAU70104菌液、植物乳杆菌CCFM8661菌液、植物乳杆菌CCFM191菌液、植物乳杆菌ZS2058菌液、植物乳杆菌CCFM232菌液、植物乳杆菌CCFM231菌液、植物乳杆菌CCFM175菌液、植物乳杆菌LABCC IMAU80120菌液、植物乳杆菌CCFM241菌液、植物乳杆菌CCFM242菌液、植物乳杆菌CCFM240菌液、植物乳杆菌CCFM408菌液、植物乳杆菌CCFM634菌液、植物乳杆菌CCFM8610菌液，分别对应编号1～52。
(2)壬基酚标准品母液的制备：
准确称取10mg的壬基酚标准品预先溶于1mL二甲亚砜中，充分混匀溶解后使用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，得到浓度为10mg/mL的壬基酚标准品母液；
准确称取10mg/mL的壬基酚标准品母液100μL用无菌水定容至100mL，得到浓度为10μg/mL的壬基酚标准品母液；
(3)植物乳杆菌对壬基酚的清除
以不添加植物乳杆菌菌体的浓度为10μg/mL的壬基酚标准品母液作为空白对照，将2mL步骤(1)制备得到的菌液离心并清洗得到菌泥后，依次分别与2mL浓度为10μg/mL的壬基酚标准品母液混合后于37℃条件下共培养6h，得到培养液1～52；将培养液1～52在12000rpm下离心10min，取上清用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，得到滤液1～52；
检测滤液1～52中壬基酚的含量，并根据公式：清除率(％)＝[(空白对照中壬基酚的含量-滤液中壬基酚的含量)/空白对照中壬基酚的含量]×100％，计算滤液1～52中壬基酚的清除率，检测结果见图1；表1为不同的植物乳杆菌对壬基酚的减除量，已知空白对照中壬基酚的含量为20μg，减除量＝空白对照中壬基酚的含量-滤液中壬基酚的含量。
表1：不同的植物乳杆菌对壬基酚的减除量
由图1和表1可知，滤液中壬基酚的清除率最高高达44.91％，在初始壬基酚含量为20μg的情况下最大清除量为8.98μg，可见，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1174可有效清除水溶液中的壬基酚。
实施例3：植物乳杆菌CCFM1174对苹果汁中壬基酚的清除作用
具体步骤如下：
(1)苹果汁的制备
苹果经清洗后，由榨汁机榨汁加工。然后，布过滤器过滤果汁后，5000g下离心，收集上清液于-20℃下储存用于后续实验。
(2)植物乳杆菌CCFM1174菌悬液的制备
取植物乳杆菌菌液在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h后，得到单菌落；用无菌接种环挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
然后以2％(v/v)的接种量将活化液接入MRS液体培养基，37℃条件下培养18h，得到菌悬液；此时，菌悬液的浓度为：3×109cfu/mL。
(3)植物乳杆菌CCFM1174对苹果汁中壬基酚的清除率
将步骤(1)得到的苹果汁与一定量的壬基酚标准物质混合(壬基酚终浓度10μg/mL)，制备得到生苹果汁，其中生苹果汁中初始壬基酚含量为500μg。
将步骤(2)制备得到的植物乳杆菌CCFM1174菌悬液以2％(v/v)的接种量接种到50mL生苹果汁中，在37℃下厌氧条件下孵育18h，每6h取一次样。样品经6000g离心30min后，收起上清液，得到发酵果汁；
参照吕岱竹《超声波提取-液相荧光法测定水果中壬基酚聚氧乙烯醚及其降解产物》中的前处理方法对发酵果汁进行前处理后，用高效液相-荧光检测器对壬基酚进行检测。
实验结果如图2所示，植物乳杆菌CCFM1174对苹果汁中的壬基酚的清除率为54.62％。与壬基酚标准物质混合后得到的生苹果汁中初始壬基酚含量500μg，而添加植物乳杆菌CCFM1174菌悬液后，壬基酚在苹果汁中的含量为：226.9μg，壬基酚在苹果汁中减除量为273.1μg。
实施例4：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
实施例5：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备牛乳，发酵乳的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加植物乳杆菌CCFM1174菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到牛乳。
实施例6：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备豆奶，豆奶的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
将大豆在温度80℃下浸泡2h后去除大豆皮，得到去皮大豆；将去皮大豆沥去浸泡水后加沸水磨浆，得到豆浆；将豆浆在高于80℃的温度条件下保温12min，得到熟豆浆；将熟豆浆用150目筛网过滤后离心分离，得到粗豆奶；将粗豆奶加热到温度140～150℃后迅速导入真空冷却室进行抽真空，使得粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出，得到熟豆奶；将熟豆奶降温至约37℃后在熟豆奶中添加植物乳杆菌CCFM1174菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到豆奶。
实施例7：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备果蔬饮料，果蔬饮料的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
将新鲜水果和蔬菜洗净后榨汁，得到果蔬汁；将果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒，得到杀菌后的果蔬汁；将杀菌后的果蔬汁降温至约37℃后在杀菌后的果蔬汁中添加植物乳杆菌CCFM1174菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到果蔬饮料。
实施例8：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得植物乳杆菌CCFM1174的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基。
实施例9：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
将植物乳杆菌CCFM1174菌粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂；将糖添加至鲜奶中至浓度为50g/L，得到混合液；将混合液在65℃、20MPa的条件下进行均质后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03％(v/v)的接种量将发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16h，得到发酵乳；将发酵乳于42℃下放置4h进行凝乳后，在4℃下冷藏24h进行后熟，得到发酵乳成品。
实施例10：植物乳杆菌CCFM1174的应用
具体步骤如下：
植物乳杆菌CCFM1174可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
植物乳杆菌CCFM1174划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000g离心15min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到植物乳杆菌CCFM1174菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。
称取植物乳杆菌CCFM1174菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为：2021年03月09日，保藏编号为GDMCC No：61551。
2.含有权利要求1所述植物乳杆菌的微生物菌剂。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌在降解环境中壬基酚方面的应用，其特征在于，所述环境为非生物体内的环境。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环境包括食品加工环境、食品酿造环境、乳制品环境、果蔬制品环境。
5.一种可缓解壬基酚中毒症状的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的植物乳杆菌。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌在组合物中的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
7.如权利要求5或6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品、药品或壬基酚清除剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述植物乳杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有所述植物乳杆菌CCFM1174的饮料或零食。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述植物乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
10.权利要求1所述植物乳杆菌在制备预防和/或治疗壬基酚暴露的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110606088.1A CN113151116B (zh) | 2021-05-24 | 2021-05-24 | 一株可清除壬基酚的植物乳杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110606088.1A CN113151116B (zh) | 2021-05-24 | 2021-05-24 | 一株可清除壬基酚的植物乳杆菌及其应用 |
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-
2021
- 2021-05-24 CN CN202110606088.1A patent/CN113151116B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2001087317A1 (fr) * | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Adsorbant d'agents perturbateurs du systeme endocrinien, et aliments et boissons contenant cet adsorbant |
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HSU WT等: "The effect of nonylphenol on the growth of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum", 《J MICROBIOL IMMUNOL INFECT》 * |
| 张美珍等: "壬基酚降解菌产酶条件的优化", 《环境污染与防治》 * |
| 李旭春等: "1株壬基酚降解菌的分离鉴定及其降解特性研究", 《环境科学》 * |
| 蒋俊等: "2株分别降解壬基酚和双酚A细菌的分离、鉴定和降解特性", 《环境科学研究》 * |
| 马娟等: "壬基酚降解菌的分离筛选及其降解条件的优化", 《江苏科技大学学报(自然科学版)》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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