CN113144413A - 一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列及其制备方法,属于免疫分析‑过敏性疾病诊断技术领域,所述可溶性复合微针阵列包括基座(1)和位于所述基座(1)上的针体(2);所述针体(2)的针尖(3)上负载有过敏原;所述针体(2)的材质包括水溶性聚合物。本发明的可溶性复合微针阵列通过短暂、可逆地破坏皮肤角质层,高效促透给药,避免触及真皮层丰富的毛细血管和神经末梢,降低或消除传统皮肤点刺过程产生的疼痛,具有快速、无痛、皮肤刺激性小、便捷且准确的优点。本发明的可溶性复合微针阵列给药方式便捷,无需专业人员操作,适用于家庭检测、大规模人群过敏原筛查和临床快速检测等多种检测环境。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析-过敏性疾病诊断技术领域,具体涉及一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列及其制备方法。
背景技术
过敏性疾病是指由变应原(过敏原)引起的机体异常免疫反应,结果导致组织炎症或器官功能障碍。近年来,过敏性疾病发病率在全球呈逐年上升。其诊断和防治引起了广泛研究和关注。目前,过敏性疾病的诊断主要包括患者病史及体检、皮肤点刺试验(SPT)、血清特异性IgE抗体检测和口服食物激发实验(OFC)等。
SPT是将少量高度纯化的致敏原皮试液滴于患者前臂,再用点刺针轻轻刺入皮肤表层,并以组胺作阳性对照。如患者对某种致敏原过敏,则于15min内在点刺部位出现风团样红肿。SPT可用于快速排除IgE介导的过敏反应,其阴性预测值可达95%以上,因其敏感性较高、安全性高、结果重复性好、操作简便以及价格相对低廉而广泛应用于临床诊断和流行病学调查。年龄、点刺时间、部位和全身用药等都可影响SPT检测结果,SPT引起的疼痛和不适感使其在儿童中的应用受到限制。因此探索一种无痛的SPT替代手段势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列及其制备方法,本发明的可溶性复合微针阵列可避免触及真皮层丰富的毛细血管和神经末梢,能够降低或消除传统皮肤点刺过程产生的疼痛。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列,包括基座1和位于所述基座1上的针体2;所述针体2的针尖3上负载有过敏原;所述针体2的材质包括水溶性聚合物。
优选的,所述水溶性聚合物包括透明质酸、乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、蚕丝蛋白、糊精、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、软骨硫磺素、右旋糖酐、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸钠、支链淀粉、麦芽糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚γ-谷氨酸中的一种或几种。
优选的,每个所述可溶性复合微针阵列含有1根以上的针体2;所述针体2的形状为棱锥形、圆锥形、类锥形或蛇齿形。
优选的,所述针体2的长度为70~1200μm,所述针体2的底径为20~800μm,所述针尖3的密度为1~600根/cm2。
优选的,所述过敏原的含量为1~200μg/阵列。
本发明还提供了上述方案所述可溶性复合微针阵列的制备方法,包括以下步骤:
1)将过敏原和部分水溶性聚合物溶液混合,得到过敏原溶液;
2)将步骤1)得到的所述过敏原溶液滴加在微针阴模的内表面,离心或真空使过敏原溶液进入微针阴模的微孔中;
3)将剩余水溶性聚合物溶液再次注入注入了过敏原溶液以后的微针阴模,离心或真空干燥,剥离微针阴模,得到可溶性复合微针阵列。
优选的,所述水溶性聚合物溶液的浓度为100~1000mg/mL。
优选的,所述过敏原的浓度为1~1000mg/mL。
优选的,步骤3)中所述过敏原溶液的滴加量为10~500mg/微针阴模。
优选的,步骤4)中所述水溶性聚合物溶液的注入量为100~1000mg/微针阴模。
本发明提供了一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列,包括基座1和位于基座1上的针体2;所述针体2的针尖3上负载有过敏原;所述针体2的材质包括水溶性聚合物。本发明的可溶性复合微针阵列是一种新型透皮给药制剂,施用后皮肤能够自行恢复,可通过短暂、可逆地破坏皮肤角质层,插入皮肤,从而高效促透给药,表皮中含有丰富的抗原递呈细胞,可以摄取过敏原后递呈到真皮层,分泌细胞因子,进一步募集肥大细胞、嗜酸性粒细胞等效应细胞聚集到皮肤产生脱颗粒,发生红肿现象,避免触及真皮层丰富的毛细血管和神经末梢,降低或消除传统皮肤点刺过程产生的疼痛,具有快速、无痛、皮肤刺激性小、便捷且较为准确的优点。本发明的可溶性复合微针阵列给药方式便捷,可自行施用,无需专业人员操作,适用于家庭检测、大规模人群过敏原筛查和临床快速检测等多种检测环境,达到了快速、无痛、便捷检测过敏原的目的。
附图说明
图1是本发明的过敏诊断的可溶性复合微针阵列立体结构示意图;其中:1-基座;2-针体;3-针尖;
图2是本发明的过敏诊断的可溶性复合微针阵列剖视图;其中:1-基座;2-针体;3-针尖;
图3是实施例1制备得到的实体微针及针尖称重力测试图;
图4是实施例1应用到皮肤30min后微针图;
图5是实施例1应用到OVA过敏小鼠皮肤后小鼠的皮肤状况图;其中,(a)为施用前、(b)为施用时、(c)为对照小鼠施用后无明显症状、(d)为过敏小鼠施用后皮肤肿胀、(e)为过敏小鼠施用后皮肤肿胀;
图6是应用阵列进行诊断后小鼠在血清中OVA特异性IgE、IgG1浓度的变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列,包括基座1和位于基座1上的针体2;所述针体2的针尖3上负载有过敏原;所述针体2的材质包括水溶性聚合物。本发明的过敏诊断的可溶性复合微针阵列立体结构示意图参见图1。本发明的过敏诊断的可溶性复合微针阵列剖视图参见图2。
在本发明中,所述水溶性聚合物优选的包括透明质酸、乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、蚕丝蛋白、糊精、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、软骨硫磺素、右旋糖酐、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸钠、支链淀粉、麦芽糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚γ-谷氨酸中的一种或几种,更优选的,所述包括选自透明质酸钠、明胶和羧甲基淀粉钠;所述透明质酸钠、明胶和羧甲基淀粉钠的质量比为透明质酸钠:明胶:羧甲基淀粉钠=2:1:1。
在本发明中,所述过敏原包括但不限于食物、真菌、尘螨、花粉、动物毛发、金属、塑料、橡胶、药物和微生物。在本发明具体实施过程中,所述过敏原为卵白蛋白(OVA)。
在本发明中,每个所述可溶性复合微针阵列优选的含有1根以上的针体2;所述针体2的形状优选为棱锥形、圆锥形、类锥形或蛇齿形。
在本发明中,所述针体2的长度优选为70~1200μm,进一步优选为50~1000μm,更进一步优选为300~500μm,这一长度与人皮肤表皮层厚度对应,使微针可以将抗原递送至表皮层,诱导表皮中丰富的抗原递呈细胞对其进行递呈处理,进一步诱导肥大细胞等效应细胞脱颗粒并产生相应症状,而不会使抗原直接进入血液或触碰真皮层神经,因而可以减少受试者的不适并且具有较高的安全性。在本发明中,所述针体2的底径优选为20~800μm,进一步优选为100~500μm,更进一步优选为400μm;所述针尖3的密度优选为1~600根/cm2,进一步优选为10~500根/cm2,更进一步优选为50~300根/cm2,最优选为100~200根/cm2。
在本发明中,所述过敏原的含量优选为1~5000μg/阵列,更优选为5~3000μg/阵列。本发明对单根针尖上过敏原的负载量没有特殊要求。
本发明还提供了上述方案所述可溶性复合微针阵列的制备方法,包括以下步骤:
1)将过敏原和部分水溶性聚合物溶液混合,得到过敏原溶液;
2)将步骤1)得到的所述过敏原溶液滴加在微针阴模的内表面,离心或真空使过敏原溶液进入微针阴模的微孔中;
3)将剩余水溶性聚合物溶液再次注入注入了过敏原溶液以后的微针阴模,离心或真空干燥,剥离微针阴模,得到可溶性复合微针阵。
本发明首先将过敏原和部分水溶性聚合物溶液混合,得到过敏原溶液。
在本发明中,所述水溶性聚合物溶液优选的将水溶性聚合物溶解到水中得到。在本发明中,所述水优选为超纯水。在本发明中,所述水溶性聚合物溶液的浓度优选为100~1000mg/mL,进一步优选为200~800mg/mL,更进一步优选为300~500mg/mL。
在本发明中,所述过敏原的浓度优选为1~1000mg/mL,进一步优选为5~800mg/mL,更进一步优选为5~500mg/mL,最优选为5~100mg/mL。本发明将过敏原母液和得到的部分所述水溶性聚合物溶液混合是为了便于过敏原均与分布到微针中。
得到过敏原溶液后,本发明将得到的所述过敏原溶液滴加在微针阴模的内表面,离心或真空使过敏原溶液进入微针阴模的微孔中。在本发明中,所述离心的转速优选为4000rpm;所述离心的温度优选为4~25℃;所述离心的时间优选为30min。在本发明中,所述真空是将溶液加载到模具上后,放入真空冷冻机中降压使溶液加入微孔中。
在本发明中,所述微针阴膜由具有凹槽结构的阴模模具组成,凹槽底部有微针阵列,微针阵列中刻有微针。
在本发明具体实施过程中,所述微针阴膜优选的包括定制的PDMS微针阴模,微针内表面的边长为13.5*13.5mm,凹槽深度为1.5mm,阵列数量为10*10,针尖距离为1mm。
在本发明中,所述过敏原溶液的滴加量优选为10~500mg/微针阴模,更优选为50~300mg/微针阴模,最优选为100~200mg/微针阴模。
本发明将剩余水溶性聚合物溶液再次注入注入了过敏原溶液以后的微针阴模,离心或真空干燥,剥离微针阴模,得到可溶性复合微针阵。在本发明中,所述水溶性聚合物溶液的注入量优选为100~1000mg/微针阴模,进一步优选为200~800mg/微针阴模,更进一步优选为300~500mg/微针阴模。再注入水溶性聚合物溶液的作用是调整微针结构,增加微针厚度。
在本发明中,所述用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列的使用方法优选的包括以下步骤:将所述可溶性复合微针阵列贴于测敏的皮肤处,按压至微针针尖溶解后取下,观察皮肤表面红斑及肿胀情况,判断该物质是否为过敏原,出现红斑和肿胀即判定为过敏;所述按压的时间优选为15~30min;本发明对测敏的皮肤部位没有特殊限制,常规皮肤部位即可。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1鸡蛋(卵白蛋白)过敏诊断的可溶性复合微针阵列的制备
(1)水溶性聚合物溶液:将羧甲基淀粉钠、明胶以1:1的重量比溶解到100mg/mL透明质酸钠中,80℃水浴30min,冷却至室温得到10%w/v的羧甲基淀粉钠/明胶/透明质酸钠溶液;
(2)过敏原溶液的制备:将OVA母液溶解到步骤2所述羧甲基淀粉钠/明胶/透明质酸钠溶液中得到过敏原溶液,浓度为10mg/mL;
(3)取300μL所述步骤2)得到的OVA溶液滴在PDMS微针阴模的内表面,4000rpm,20℃离心30min,使OVA溶液深入PDMS微针阴模的微孔中。取700μL所述步骤1)得到的羧甲基淀粉钠/明胶/透明质酸钠溶液注入PDMS微针阴模,真空干燥,接着将PDMS微针阴模剥离,即得到载OVA过敏原的羧甲基淀粉钠/明胶/透明质酸钠复合微针阵列。制备得到的实体微针及针尖称重力测试图参见图3。
本实施例所选用的微针模板的型号参见表1
表1微针模板的型号参数
上述方法制备的每个微针贴片含有100根微针,微针呈圆锥形,微针的长度为750μm,底径为300μm,相邻针尖间距为1000μm。OVA的含量约为3mg/贴片。
实施例1制备的鸡蛋(卵白蛋白)过敏诊断的可溶性复合微针阵列的体外过敏原释放率测定
利用BCA法测定微针初始OVA含量。将微针插入猪皮,使用真皮胶带固定一段时间(时间间隔10min、15min、30min、45min、1h),去除阵列,用3M TransporeTM胶带将插入部位胶带剥离3次以去除皮肤表面残留的过敏原。将插入前后的微针分别溶于磷酸盐缓冲液中,在4℃浸泡一天,释放残余OVA;剥离的胶带也进行同样操作。用BCA检测蛋白浓度,再乘以PBS体积得到残留OVA含量。体外过敏原释放率=(初始OVA含量-残留OVA含量)/初始OVA含量,得到体外过敏原释放率-时间曲线。
实验结果表明,在30min时微针的体外过敏原释放率达到85%,满足快速检测的要求。
实施例1制备的鸡蛋(卵白蛋白)过敏诊断的可溶性复合微针阵列的动物实验
以实施例1为例,用载10μg贴片的鸡蛋(卵白蛋白)过敏诊断的可溶性复合微针阵列对已构建OVA过敏的BALB/c小鼠模型进行诊断。20只BALB/c小鼠按体重随机分成2组,分别为阴性对照组、OVA致敏组,每组10只。OVA过敏组外各组小鼠分别在第0,7,14,21,28、35天分别经口灌胃1mg OVA+10μg CT佐剂(溶于200μLPBS),阴性对照组灌胃等体积PBS。第35天内眦取血测定小鼠血液中OVA特异性IgE含量判断建模是否成功。在第42天利用含过敏原的微针对小鼠进行处理,应用到皮肤30min后微针图参见图4。处理后观察小鼠皮肤表面红肿情况,并收集血液测定特异性IgE、IgG1。应用到OVA过敏小鼠皮肤后小鼠的皮肤状况图参见图5。应用阵列进行诊断后小鼠在血清中OVA特异性IgE、IgG1浓度(sIgE、sIgG1)的变化参见表2、表3及图6。
表2施用微针前后小鼠血清OVA-sIgE浓度变化
表3施用微针前后小鼠血清OVA-sIgG1浓度变化
实验结果:
负载有OVA的复合微针阵列能有效诊断小鼠过敏原,并且诊断过程中无严重不良反应发生,说明该复合微针用于过敏诊断时安全有效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于过敏诊断的可溶性复合微针阵列,包括基座(1)和位于所述基座(1)上的针体(2);所述针体(2)的针尖(3)上负载有过敏原;所述针体(2)的材质包括水溶性聚合物。
2.根据权利要求1所述的可溶性复合微生物阵列,其特征在于,所述水溶性聚合物包括透明质酸、乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、蚕丝蛋白、糊精、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、软骨硫磺素、右旋糖酐、葡聚糖、壳聚糖、海藻酸钠、支链淀粉、麦芽糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚γ-谷氨酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的可溶性复合微针阵列,其特征在于,每个所述可溶性复合微针阵列含有1根以上的针体(2);所述针体(2)的形状为棱锥形、圆锥形、类锥形或蛇齿形。
4.根据权利要求1或3所述的可溶性复合微针阵列,其特征在于,所述针体(2)的长度为70~1200μm,所述针体(2)的底径为20~800μm,所述针尖(3)的密度为1~600根/cm2。
5.根据权利要求1所述的可溶性复合微针阵列,其特征在于,所述过敏原的含量为1~200μg/阵列。
6.权利要求1~5任意一项所述可溶性复合微针阵列的制备方法,包括以下步骤:
1)将过敏原和部分水溶性聚合物溶液混合,得到过敏原溶液;
2)将步骤1)得到的所述过敏原溶液滴加在微针阴模的内表面,离心或真空使过敏原溶液进入微针阴模的微孔中;
3)将剩余水溶性聚合物溶液再次注入注入了过敏原溶液以后的微针阴模,离心或真空干燥,剥离微针阴模,得到可溶性复合微针阵列。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述水溶性聚合物溶液的浓度为100~1000mg/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述过敏原的浓度为1~1000mg/mL。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中所述过敏原溶液的滴加量为10~500mg/微针阴模。
10.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,步骤4)中所述水溶性聚合物溶液的注入量为100~1000mg/微针阴模。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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