CN113144178A - 采用精氨酸酶i调节免疫系统的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含能够消耗受试者中血浆精氨酸水平的重组精氨酸酶I蛋白质的方法和组合物。所述方法和组合物可以用来调节受试者中的免疫系统的活动。该免疫系统的调节对于治疗免疫病症和防止移植的器官、组织或细胞的排斥是有用的。所述方法和组合物还可以用来治疗受试者的骨病况。

Description

采用精氨酸酶I调节免疫系统的方法和组合物
本申请是申请日为2015年04月28日、申请号为201580035269.6、发明名称为“采用精氨酸酶I调节免疫系统的方法和组合物”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2015年04月28日、申请号为PCT/CN2015/077654)的分案申请。
交叉引用
本申请要求2014年4月29日提交的美国临时专利申请系列号61/985,924的权益，其通过引用以全文并入本文。
背景技术
免疫系统的功能是保护身体免受有害抗原、细菌、病毒、毒素、来自另一个人或物种的血液或组织和癌细胞的影响。免疫系统病症可以导致免疫系统活动过度或活动减退。在免疫系统活动过度的情况下，身体攻击并损害其自身的组织。在免疫系统活动减退(也称为免疫缺陷)的情况下，身体抗击外来抗原的能力减弱，这通常导致更高的易感染性。
精氨酸酶使L-精氨酸代谢为L-鸟氨酸和尿素。除了该酶在肝的尿素循环中的基本作用以外，精氨酸酶还在一些哺乳动物的免疫系统的一些细胞中表达。然而，还不清楚干扰L-精氨酸代谢是否可用来治疗免疫病况。重要的是，将外源性精氨酸酶配制为适合于临床施用的治疗剂存在若干挑战。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的炎性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用调节所述炎症。
在一些实施方案中，所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶是聚乙二醇化的(pegylated)。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶的功能性片段是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，该聚乙二醇化的重组精氨酸酶是重组人精氨酸酶I或其功能性片段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段，其中所述施用调节所述炎症。
在一些实施方案中，本发明提供了纯化的重组精氨酸酶或其功能性片段在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质或其功能性片段和至少一个聚乙二醇寡聚体的药物组合物。在一些实施方案中，该聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质包含至少两个聚乙二醇寡聚体，其中每个聚乙二醇寡聚体的分子量为约20千道尔顿至约40千道尔顿。在一些实施方案中，该聚乙二醇化的重组精氨酸酶I蛋白质或其功能性片段包含约4个至约13个聚乙二醇寡聚体，其中每个聚乙二醇寡聚体的分子量为约5千道尔顿。
在一些实施方案中，所述纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段通过抑制T细胞极化来调节炎症。在一些实施方案中，所述纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段通过调节细胞因子释放来抑制T细胞极化。在一些实施方案中，所述纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段调节白介素6(IL-6)的表达。在一些实施方案中，所述纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段调节干扰素γ(INFγ)的表达。在一些实施方案中，所述纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段的施用使受试者的血浆中精氨酸的水平消耗至10μM以下。
在一些实施方案中，所述药物组合物和方法提供了一种用于治疗自身免疫病症的方法。在一些实施方案中，该自身免疫病症是多发性硬化。在一些实施方案中，该自身免疫病症是类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗有需要的受试者中的骨病况的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。在一些情况下，该骨病况是骨质疏松症。在其他情况下，该骨病况是炎症。
在一些实施方案中，所述纯化的重组人精氨酸酶I为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，所述重组人精氨酸酶I是聚乙二醇化的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
图1示出了在巨噬细胞中LPS对精氨酸酶I的上调。
图2A和图2B示出了精氨酸酶I表达的增加，伴随着PTEN的损失。
图3示出了在PTEN缺乏的巨噬细胞中C/EBPβ的功能。
图4示出了PI3K的组成性激活促进精氨酸酶I表达和向细胞外空间内的释放。
图5示出了精氨酸酶I对T细胞极化的抑制。
图6A和图6B示出了用重组人精氨酸酶I治疗本领域公认的多发性硬化模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠——的结果。
图7描绘了测量用重组人精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠的多个临床参数的图。
图8示出了在用重组人精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠中的爪肿胀减轻。
图9示出了在用人重组人精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠中的白介素6(IL-6)全身性释放减少。
图10描绘了测量在胶原免疫后促炎性细胞因子的表达的图。
图11是描绘用重组人精氨酸酶I治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的临床评分的图。
图12A和图12B描绘了在用重组人精氨酸酶I治疗的EAE小鼠中免疫细胞群体的荧光激活细胞分选分析。
图13A和图13B描绘了荧光激活细胞分选实验的结果，表明用重组人精氨酸酶I治疗防止了T细胞增殖。
图14是用于优化包含纯化精氨酸酶I的药物组合物的过程的示意图。
图15是示出通过用mPEG-MAL聚乙二醇化(-SH修饰)的纯化的重组人精氨酸酶I消耗血清精氨酸的图。
图16是示出采用在Lys残基上聚乙二醇化的多种纯化的重组人精氨酸酶消耗血清精氨酸的图。
图17是示出多种纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质通过胺(–NH2)缀合的聚乙二醇化程度的图。
图18是示出纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I的表位分析的图。
图19示出了用纯化的人精氨酸酶I抑制的来自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)再刺激的T细胞的IFNγ和IL-17A mRNA表达水平。
图20示出了用纯化的人精氨酸酶I抑制的来自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)再刺激的T细胞的IFNγ和IL-17A蛋白质表达水平。
图21示出了用重组人精氨酸酶I治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的临床评分的改善。
图22是破骨细胞分化试验的示意图。
图23是示出用重组人精氨酸酶I处理的分化野生型骨髓衍生的巨噬细胞的破骨细胞试验的图。
图24是显示在破骨细胞发生过程中精氨酸酶I的表达可能丢失的图。
图25示出了在破骨细胞分化过程中添加重组精氨酸酶I可以调节破骨细胞形成。
图26是示出破骨细胞发生的阻断可依赖于重组人精氨酸酶I(recArgI)的催化功能的图。
图27是示出一项试验的图，在该试验中，将重组精氨酸酶I添加至造血干细胞没有影响破骨细胞形成。
图28是示出在破骨细胞发生的第0天或第6天，不同剂量的重组人精氨酸酶I(recArgI)的影响的图。
图29是示出在与重组人精氨酸酶I(recArgI)一起温育及不温育的情况下，在分化7天后破骨细胞发生基因的mRNA表达水平的图。
具体实施方式
大部分生物每天暴露于许多不同的抗原。然而，一些动物具有能够对这样的抗原作出应答并防止引发或形成疾病的免疫系统。为了正常地起作用，免疫系统必须检测到多种多样的抗原，如病毒、寄生虫或变应原，并在体内引发对外来物质、异常细胞和/或异常组织的应答。在对未知抗原的应答中，健康的免疫系统开始产生抗体。
然而，在一些疾病中，免疫系统可能开始产生攻击身体自身组织而非抗击感染的抗体。这可导致自身免疫疾病。癌性生长，包括恶性癌性生长，也可以被受试者的先天免疫细胞识别并引起免疫应答。先天免疫细胞的激活触发许多细胞内信号传导途径，这些途径需要严格控制以便引起足够的免疫应答。
精氨酸酶I是尿素循环的关键元件，它将精氨酸转化为尿素，并且主要在肝脏中有活性。精氨酸酶I还在免疫系统中发挥功能性作用。例如，T细胞依赖于半必需氨基酸精氨酸而成熟并对感染作出应答。先天免疫细胞中精氨酸酶I的表达导致在炎性病况下生理系统的精氨酸水平的消耗。例如，骨髓细胞中的精氨酸酶I表达可导致T细胞无反应性，并妨碍T辅助细胞功能。
在小鼠中，精氨酸酶I由单核细胞来源的细胞表达。对于人类，精氨酸酶I在粒细胞/嗜中性粒细胞中组成型表达并参与杀真菌活动。表达精氨酸酶I的巨噬细胞被一些人认为是替代性激活的(alternatively activated)，或是M2巨噬细胞，参与组织再生和修复，也参与针对多细胞病原体和寄生虫的免疫防御。鼠骨髓细胞中的精氨酸酶I表达由Th2细胞因子IL-4/IL-13调节。然而，不清楚人精氨酸酶I和鼠精氨酸酶I是否通过类似的作用机理起作用。
PI3K/PTEN信号传导途径在许多生理学上重要的过程如先天免疫、细胞存活、增殖、迁移和代谢中发挥功能性作用。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信号传导途径可以下调一些细胞中促炎性细胞因子的表达和释放。这些信号传导过程被脂质磷酸酶PTEN(PI3K途径的一种拮抗剂)严格调控。PTEN是一种肿瘤抑制物，其负责响应于Toll样受体(TLR)激动剂的细胞因子如白介素6(IL-6)产生量提高。PI3K激活被认为是促炎性的，并且PI3K途径的调节对于将免疫细胞正确引导至感染或炎症部位是不可缺少的。
我们在本文中描述了表征向培养的细胞和小鼠模型中添加重组聚乙二醇化精氨酸酶I的实验。所述实验证实了细胞外精氨酸酶I可以对免疫细胞发挥强效的抗炎作用。含有高含量精氨酸酶I的、来源于幼稚PTEN-/-巨噬细胞的条件培养基的转移实验显示了在培养的细胞和动物模型中促炎性T细胞极化细胞因子的表达减少。
本文公开的发明提供了通过向受试者施用重组精氨酸酶I蛋白质以调节PI3K/PTEN信号传导途径和细胞因子分泌来治疗与免疫系统相关的病况的组合物和方法。在一些实施方案中，本文公开的发明提供了一种通过向受试者施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I来调节炎症的方法。
本公开内容证实，在生理系统中持续的精氨酸酶I表达的功能性结果是在体外和体内由T细胞介导的病理生理效应的减弱功能而形成低炎性环境。该发现提供了一种用于调节免疫系统的强力且有效的方法。这样的调节提供了对于多种免疫病况如多发性硬化和类风湿性关节炎的有效治疗。此外，采用本发明的重组精氨酸酶调节免疫系统可以与外科手术一起使用，例如，以提供在器官移植过程中降低细胞/组织排斥的可能性的低炎性环境。
在一些方面，本公开内容提供了一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段。在一些情况下，该纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段通过抑制T细胞极化来调节炎症。在一些情况下，该纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I通过调节细胞因子释放来抑制T细胞极化。
本公开内容的另一方面提供了一种包含与至少一个聚乙二醇寡聚体缀合的纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质的药物组合物。在一些情况下，所述至少一个聚乙二醇寡聚体为甲氧基聚乙二醇。
本公开内容还证实了精氨酸酶在骨生理学中的功能性作用。骨形成是包括许多个阶段的多重复杂过程，并且每一个阶段呈现为治疗性干预的潜在目标。炎症还可干扰脊椎动物身体修复骨量(bone mass)的能力。在一些方面，本公开内容证实了在破骨细胞发生过程中精氨酸酶I的表达丢失，并且在破骨细胞分化过程中添加重组精氨酸酶I可以至少调节破骨细胞发生。本公开内容还证实了对破骨细胞发生的阻断依赖于重组精氨酸酶I的催化功能。该发现提示对精氨酸酶表达的调节可以提供对于包括骨质疏松症在内的多种骨病况的有效治疗。通过减小骨中的慢性炎症(该慢性炎症可以是骨质疏松症中的恶化因素)，对精氨酸酶I表达的调节还可以提供对于骨质疏松症的有效治疗。
治疗免疫病症、骨病况和癌症的方法
本公开内容的方法、组合物和试剂盒可以包括治疗、抑制、逆转或减轻疾病的方法。在一些情况下，该疾病可以是自身免疫疾病。在一些情况下，该疾病可以是骨病况，如骨质疏松症。在一些情况下，所述调节通过施用治疗有效剂量的重组精氨酸酶蛋白质或其功能性片段而实现。在一些情况下，该蛋白质是重组人精氨酸酶I或其功能性片段。
精氨酸酶I是先天和适应性免疫应答的重要调节剂。许多患有免疫系统病症和癌症的受试者可以受益于重组人精氨酸酶I的使用。受试者可以是人、非人灵长类如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。受试者可以是任意年龄的。受试者可以是例如中老年者、成年者、青少年、青春期前少年、儿童、幼儿(toddler)、婴儿。
本文还认识到了重组精氨酸酶蛋白质在治疗多种骨病况如骨质疏松症或骨炎症中的治疗潜力。脊椎动物骨骼例如人类骨骼的强度和完整性依赖于破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的微妙平衡。在骨质疏松症中，该平衡向有利于破骨细胞的方向移动，并且骨吸收超过骨形成。在一些情况下，重组精氨酸酶蛋白质或其片段可以使破骨细胞与成骨细胞形成之间的平衡移动。
免疫系统中多种细胞的活性可以由重组精氨酸酶I来调节。活性可由重组精氨酸酶I调节的细胞的非限制性实例包括：B细胞；CD4；CD8；血细胞，包括红细胞和白细胞；树突细胞，包括树突状抗原呈递细胞；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；嗜中性粒细胞；T辅助细胞；以及T杀伤细胞。多种其他细胞的活性也可以由重组精氨酸酶I来调节。活性可由重组精氨酸酶I调节的细胞的非限制性实例包括造血干细胞、破骨细胞、成骨细胞、骨原细胞、骨细胞以及它们的前体或衍生物。
可采用本文公开的纯化精氨酸酶治疗的免疫疾病或病况的实例包括类风湿性关节炎、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、银屑病、葡萄膜炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、湿疹、硬皮病、溃疡性直肠炎、重症联合免疫缺陷(SCID)、DiGeorge综合征、共济失调性毛细血管扩张症、季节性变态反应、常年性变态反应、食物变态反应、全身性过敏反应(anaphylaxis)、肥大细胞增多症、变应性鼻炎、特应性皮炎、帕金森病、阿尔茨海默病、脾功能亢进、白细胞粘附缺陷、X连锁淋巴组织增生病、X连锁无丙种球蛋白血症、选择性免疫球蛋白A缺乏、高IgM综合征、HIV、自身免疫性淋巴组织增生综合征、Wiskott-Aldrich综合征、慢性肉芽肿病、普通可变型免疫缺陷(CVID)、高免疫球蛋白E综合征、桥本甲状腺炎、急性炎性病况、慢性炎性病况和癌症。
在一些实施方案中，骨病况可以采用纯化精氨酸酶治疗。骨病况的非限制性实例包括：骨质疏松症、佩吉特病、成骨不全、纤维发育不良(fibrous dysplasis)或骨髓炎。在一些情况下，该骨病况与破骨细胞或成骨细胞功能的误调节有关。
在一些实施方案中，癌症对采用纯化精氨酸酶的治疗敏感。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、成神经细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶未知的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌如非小细胞和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、隐匿原发灶转移性鳞状颈癌、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌瘤综合征、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤形成、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞瘤(妊娠期的)、原发部位不明的癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症
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和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。
所述治疗可以包括采用本公开内容的精氨酸酶治疗受试者(例如患有疾病的患者和/或具有病况的实验室动物)。该疾病可以是自身免疫疾病。该疾病可以是炎性疾病。该受试者可以是人。可在疾病的临床发作之前向受试者提供治疗。可在疾病的临床发作之后向受试者提供治疗。可在疾病的临床发作后1天、1周、6个月、12个月或2年向受试者提供治疗。可在疾病的临床发作之后向受试者提供治疗超过1天、超过1周、超过1个月、超过6个月、超过12个月、超过2年或更长时间。可在疾病的临床发作之后向受试者提供治疗少于1天、少于1周、少于1个月、少于6个月、少于12个月或少于2年。治疗还可以包括在临床试验中治疗人。治疗可以包括向受试者施用药物组合物，诸如本公开内容通篇描述的药物组合物中的一种或多种。治疗可以包括在体内调节内源性精氨酸的水平。
突变的重组精氨酸酶
精氨酸酶I蛋白质的持续表达可在临床上用来在体外和体内提供低炎性环境(例如，在实施例1和图1至图6中进一步描述)。然而，在配制用于治疗目的的纯化精氨酸酶中遇到的一个挑战是在溶液中由于链间二硫键形成而引起的蛋白质聚集体的形成。为了克服在制备适合于临床施用的纯化精氨酸酶中的一些挑战，在野生型人精氨酸酶I的序列中进行了一系列突变。表1描述了为减少纯化重组精氨酸酶I在溶液中的聚集而设计的人精氨酸酶I的多个位点特异性突变体。表1还描述了包含分子标签的多个人精氨酸酶I序列(SEQ IDNO:9-16)。
Figure BDA0002944503160000111
Figure BDA0002944503160000121
Figure BDA0002944503160000131
突变重组精氨酸酶可以包含一个或多个突变。用于改善精氨酸酶I的流变学的适宜的氨基酸修饰可以是保守或非保守突变。可以进行突变使得编码的氨基酸被修饰为极性的、非极性的、碱性的或酸性的氨基酸。本发明的重组精氨酸酶可以是野生型人精氨酸酶。本发明的重组精氨酸酶可以是突变的人精氨酸酶。重组精氨酸酶I可以由重组DNA生成，例如采用生物分子工程化技术。纯化的精氨酸酶I可以是从粗提取物如全细胞裂解物中提取的精氨酸酶。纯化的重组精氨酸酶I可以是从例如为表达该重组精氨酸酶I而设计的生物系统的粗提取物中纯化得到的精氨酸酶I。
表1公开了多种突变重组人精氨酸酶I的蛋白质序列。SEQ ID NO:1对应于野生型人精氨酸酶。SEQ ID NO:2-8是SEQ ID NO:1的突变序列。SEQ ID NO:2包含C303→A303突变。SEQ ID NO:3包含C168→A168突变。SEQ ID NO:4包含C45→A45突变。SEQ ID NO:5包含C303→A303和C168→A168双重突变。SEQ ID NO:6包含C303→A303和C45→A45双重突变。SEQ ID NO:7包含C168→A168和C45→A45双重突变。SEQ ID NO:8包含C303→A303、C168→A168和C45→A45三重突变。
重组人精氨酸酶I可以具有工程化至重组核酸序列中的分子标签。分子标签可有助于从粗表达系统中纯化重组精氨酸酶。分子标签可以是例如，多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签或壳多糖结合蛋白(CBP)标签。在一些实施方案中，分子标签包括多组氨酸标签。分子标签可以存在于例如重组精氨酸酶的氨基末端或羧基末端。
表1还公开了包含分子标签的多种突变重组人精氨酸酶的蛋白质序列。SEQ IDNO:9对应于包含多组氨酸标签的野生型人精氨酸酶。SEQ ID NO:10-16是包含标签的SEQID NO:1的突变序列。SEQ ID NO:10包含多组氨酸标签和C303→A303突变。SEQ ID NO:11包含多组氨酸标签和C168→A168突变。SEQ ID NO:12包含多组氨酸标签和C45→A45突变。SEQID NO:13包含多组氨酸标签、C303→A303和C168→A168双重突变。SEQ ID NO:14包含多组氨酸标签、C303→A303和C45→A45双重突变。SEQ ID NO:15包含多组氨酸标签、C168→A168和C45→A45双重突变。SEQ ID NO:16包含C303→A303、C168→A168和C45→A45三重突变。在一些情况下，治疗性重组人精氨酸酶可以是表1中描述的精氨酸酶的功能性片段。
重组精氨酸酶或其功能性片段可以例如在体内由细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、合成细胞或在体外由不含细胞的系统或化学合成来表达/产生。重组精氨酸酶I可以由简并密码中的密码子的任意组合来编码。在一些实施方案中，核苷酸通过参考遗传密码来替换，使得密码子被改变为编码相同氨基酸残基的不同密码子。在一些实施方案中，如表1所述改变半胱氨酸残基的身份可以导致在溶液中蛋白质聚集减少：约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
在一些实施方案中，如表1所述改变半胱氨酸残基的身份可以导致在溶液中不大于1％的聚集、不大于2％的聚集、不大于5％的聚集、不大于10％的聚集、不大于15％的聚集、不大于20％的聚集、不大于25％的聚集、不大于30％的聚集、不大于35％的聚集、不大于40％的聚集、不大于45％的聚集、不大于50％的聚集、不大于55％的聚集、不大于60％的聚集、不大于65％的聚集、不大于70％的聚集、不大于75％的聚集、不大于80％的聚集、不大于85％的聚集、不大于90％的聚集或不大于95％的聚集。
在一些情况下，改变一个或多个氨基酸的身份可以减少重组精氨酸酶I在溶液中的聚集特性(profile)。在一些情况下，重组精氨酸酶I或其功能性片段包含1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变、7个氨基酸突变、8个氨基酸突变、9个氨基酸突变、10个氨基酸突变、11个氨基酸突变、12个氨基酸突变、13个氨基酸突变、14个氨基酸突变、15个氨基酸突变、16个氨基酸突变、17个氨基酸突变、18个氨基酸突变、19个氨基酸突变、20个氨基酸突变、21个氨基酸突变、22个氨基酸突变、23个氨基酸突变、24个氨基酸突变、25个氨基酸突变、26个氨基酸突变、27个氨基酸突变、28个氨基酸突变、29个氨基酸突变、30个氨基酸突变、31个氨基酸突变、32个氨基酸突变、33个氨基酸突变、34个氨基酸突变、35个氨基酸突变、36个氨基酸突变、37个氨基酸突变、38个氨基酸突变、39个氨基酸突变、40个氨基酸突变、41个氨基酸突变、42个氨基酸突变、43个氨基酸突变、44个氨基酸突变、45个氨基酸突变、46个氨基酸突变、47个氨基酸突变、48个氨基酸突变、49个氨基酸突变或50个氨基酸突变。
重组精氨酸酶或其功能性片段可以从例如细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、合成细胞中纯化或从不含细胞的系统中纯化。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶是部分纯化的。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶基本上是纯的。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶为至少95％纯。在一些实施方案中，该重组精氨酸酶为99％纯。
纯化的重组精氨酸酶或其功能性片段可以为至少1％纯、至少2％纯、至少3％纯、至少4％纯、至少5％纯、至少6％纯、至少7％纯、至少8％纯、至少9％纯、至少10％纯、至少11％纯、至少12％纯、至少13％纯、至少14％纯、至少15％纯、至少16％纯、至少17％纯、至少18％纯、至少19％纯、至少20％纯、至少21％纯、至少22％纯、至少23％纯、至少24％纯、至少25％纯、至少26％纯、至少27％纯、至少28％纯、至少29％纯、至少30％纯、至少31％纯、至少32％纯、至少33％纯、至少34％纯、至少35％纯、至少36％纯、至少37％纯、至少38％纯、至少39％纯、至少40％纯、至少41％纯、至少42％纯、至少43％纯、至少44％纯、至少45％纯、至少46％纯、至少47％纯、至少48％纯、至少49％纯、至少50％纯、至少51％纯、至少52％纯、至少53％纯、至少54％纯、至少55％纯、至少56％纯、至少57％纯、至少58％纯、至少59％纯、至少60％纯、至少61％纯、至少62％纯、至少63％纯、至少64％纯、至少65％纯、至少66％纯、至少67％纯、至少68％纯、至少69％纯、至少70％纯、至少71％纯、至少72％纯、至少73％纯、至少74％纯、至少75％纯、至少76％纯、至少77％纯、至少78％纯、至少79％纯、至少80％纯、至少81％纯、至少82％纯、至少83％纯、至少84％纯、至少85％纯、至少86％纯、至少87％纯、至少88％纯、至少89％纯、至少90％纯、至少91％纯、至少92％纯、至少93％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、至少99.1％纯、至少99.2％纯、至少99.3％纯、至少99.4％纯、至少99.5％纯、至少99.6％纯、至少99.7％纯、至少99.8％纯或至少99.9％纯。
聚乙二醇化的重组精氨酸酶
精氨酸酶或其功能性片段可以采用一个或多个聚乙二醇分子(PEG)进行修饰。PEG寡聚体共价附接至药物或治疗性蛋白质可以降低来自受试者的免疫系统的重组精氨酸酶I的免疫原性和抗原性。PEG寡聚体共价附接至药物或治疗性蛋白质可以增大重组精氨酸酶的流体动力学大小，这可以延长聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I在溶液中的半衰期。用于本发明的PEG寡聚体可以为，例如，—(CH2CH2O)n—或—(CH2CH2O)n—CH2CH2—，但还可以包括聚亚烷基二醇，包括但不限于聚丙二醇或聚丁二醇、甲氧基聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇丙酸(mPEG-酸)，其中n可以为约1至约400。
精氨酸酶或其功能性片段可以采用多种类型的PEG分子进行修饰。在一些实施方案中，PEG寡聚体是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)。在一些实施方案中，PEG寡聚体是甲氧基聚乙二醇丙酸(mPEG-酸)。在一些情况下，本公开内容提供了包含纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质和至少一个聚乙二醇寡聚体的药物组合物。在一些情况下，该聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质包含至少两个聚乙二醇寡聚体。在一些情况下，该聚乙二醇寡聚体的分子量为约20千道尔顿至约40千道尔顿。在一些情况下，该聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质包含约4个聚乙二醇分子至约13个聚乙二醇寡聚体。在一些情况下，该聚乙二醇寡聚体的分子量为约5千道尔顿。
精氨酸酶或其功能性片段共价附接至感兴趣的聚乙二醇聚合物可以改变该精氨酸酶的物理化学特性。可以通过与PEG结合而改变的物理化学特性的实例包括免疫原性、体外和体内生物活性、吸收速率和生物利用度、生物分布、药代动力学(PK)和药效学谱(PD)和毒性。在一些实施方案中，聚乙二醇化的精氨酸酶具有降低的免疫原性。–NH2、–COOH、–OH、–SH和二硫键是精氨酸酶的氨基酸侧链中可以与PEG寡聚体反应的化学基团的实例。N-末端中的胺和C-末端中的羧基基团也可以与PEG寡聚体反应。
用于蛋白质聚乙二醇化的PEG试剂可以是活化的PEG。活化的PEG可以用于胺聚乙二醇化、硫醇聚乙二醇化或N-末端聚乙二醇化。PEG试剂能够以不同长度、形状和化学性质商购获得，以使它们与蛋白质的特定官能团反应以用于它们的共价附接。PEG的商业供应商的非限制性实例包括NOF Corporation(日本)；SunBio(韩国)；Chirotech TechnologyLimited(英国)；JenKem(中国)；Creative PEGWorks(美国)、Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)、Dendritech(Midland,MI)或PolysciencesTM(Warrington,PA)。
适用于本发明的商购可得的PEG的非限制性实例包括但不限于可从NektarTherapeutics,San Carlos,CA获得的那些PEG，诸如mPEG-NH2(分子量约10kDa，约20kDa)、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯(SMB)、SMB-PEG-SMB、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、支链PEG N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)、mPEG-CM-HBA-NHS、NHS-HBA-CM-PEG-CM-HBA-NHS、mPEG-ButyrALD、ButyrALD-PEG-ButyrALD、支链PEG ButyrALD(mPEG2-ButyrALD)、邻吡啶基硫酯(mPEG-OPTE)、mPEG马来酰亚胺(MAL)、MAL-PEG-MAL、支链PEG马来酰亚胺(mPEG2-MAL)、叉形马来酰亚胺(mPEG-MAL2和mPEG2-MAL2)、mPEG-邻吡啶基二硫化物(mPEG-OPSS)、OPSS-PEG-OPSS、mPEG-SH、SH-PEG-SH、胺-PEG-酸、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、MAL-PEG-NHS、乙烯基砜-PEG-NHS、丙烯酸酯-PEG-NHS酯。
可在胺聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性实例包括例如由Jenken TechnologyUSA制造的PEG，诸如：Y形PEG NHS酯、Y形PEG羧基、葡萄糖PEG NHS酯、半乳糖PEG NHS酯、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基羧甲基酯、甲氧基PEG羧基、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基己酸酯、甲氧基PEG己酸、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基戊二酰胺、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯、甲氧基PEG硝基苯基碳酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亚胺基戊二酸酯。可在硫醇聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性实例包括Y形PEG马来酰亚胺、甲氧基PEG马来酰亚胺、甲氧基PEG乙烯基砜、甲氧基PEG硫醇。可在N-末端聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性实例包括例如由Jenken Technology USA制造的PEG，诸如：Y形PEG醛、Y形PEG乙醛、Y形PEG丙醛、甲氧基PEG丙醛。
在一些情况下，重组精氨酸酶或其功能性片段可具有与它所附接的PEG寡聚体相比更小的分子量。PEG寡聚体的分子量可以为例如不大于100千道尔顿(kDa)、不大于95千道尔顿、不大于90千道尔顿、不大于85千道尔顿(kDa)、不大于80千道尔顿(kDa)、不大于75千道尔顿(kDa)、不大于70千道尔顿(kDa)、不大于65千道尔顿(kDa)、不大于60千道尔顿(kDa)、不大于55千道尔顿(kDa)、不大于50千道尔顿(kDa)、不大于45千道尔顿(kDa)、不大于40千道尔顿(kDa)、不大于35千道尔顿(kDa)、不大于30千道尔顿(kDa)、不大于25千道尔顿(kDa)、不大于20千道尔顿(kDa)、不大于15千道尔顿(kDa)、不大于10千道尔顿(kDa)、不大于5千道尔顿(kDa)、不大于1千道尔顿(kDa)或不大于500道尔顿(Da)。
在一些情况下，PEG分子的分子量可以为大于500道尔顿(Da)、大于1千道尔顿(kDa)、大于5千道尔顿(kDa)、大于10千道尔顿(kDa)、大于15千道尔顿(kDa)、大于20千道尔顿(kDa)、大于25千道尔顿(kDa)、大于30千道尔顿(kDa)、大于35千道尔顿(kDa)、大于40千道尔顿(kDa)、大于45千道尔顿(kDa)、大于50千道尔顿(kDa)、大于55千道尔顿(kDa)、大于60千道尔顿(kDa)、大于65千道尔顿(kDa)、大于70千道尔顿(kDa)、大于75千道尔顿(kDa)、大于80千道尔顿(kDa)、大于85千道尔顿(kDa)、大于90千道尔顿(kDa)、大于95千道尔顿(kDa)、大于100千道尔顿(kDa)。
在一些情况下，PEG寡聚体的分子量可以为约1千道尔顿(kDa)至约5千道尔顿(kDa)、约1千道尔顿(kDa)至约10千道尔顿(kDa)、约10千道尔顿(kDa)至约20千道尔顿(kDa)、约10千道尔顿(kDa)至约30千道尔顿(kDa)、约10千道尔顿(kDa)至约40千道尔顿(kDa)、约10千道尔顿(kDa)至约50千道尔顿(kDa)、约20千道尔顿(kDa)至约30千道尔顿(kDa)、约20千道尔顿(kDa)至约40千道尔顿(kDa)、约20千道尔顿(kDa)至约50千道尔顿(kDa)、约30千道尔顿(kDa)至约40千道尔顿(kDa)、约30千道尔顿(kDa)至约50千道尔顿(kDa)。
在一些实施方案中，PEG寡聚体的分子量为约5千道尔顿(kDa)。在一些实施方案中，PEG寡聚体的分子量为约20千道尔顿(kDa)至约40千道尔顿(kDa)。
采用PEG寡聚体修饰的重组精氨酸酶
本公开内容提供了可附接至诸如SEQ ID NO:1-16的重组精氨酸酶以改变或改善流变学性质的PEG寡聚体。PEG寡聚体还可以附接至所述重组精氨酸酶的功能性片段。所述改善可以导致改进的制剂。PEG寡聚体可以共价附接至重组精氨酸酶。PEG寡聚体可以附接至重组精氨酸酶的N-末端、C-末端或通过其侧链附接。例如，PEG寡聚体可以附接至重组精氨酸酶的氨基酸序列的末端，或者可以附接至侧链，诸如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基的侧链。可以经由酰胺键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键或硫醚键进行所述附接。
在一些情况下，聚乙二醇分子与纯化的重组人精氨酸酶I的半胱氨酸残基缀合。在一些情况下，聚乙二醇分子与纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质的胺残基缀合。在一些情况下，聚乙二醇分子与纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质的N-末端缀合。图14示出了一种用来评估重组人精氨酸酶I的聚乙二醇化的过程。
药物组合物
本发明的药物组合物可以是本文所述的任何重组精氨酸酶与其他化学组分如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的组合。该药物组合物将促进所述重组精氨酸酶向生物体的施用。药物组合物可作为药物组合物以治疗有效量通过多种形式和途径施用，所述形式和途径包括例如静脉内、皮下、肌肉内、直肠、气雾剂、肠胃外、眼部、经肺、经皮、阴道、经眼、经鼻和局部施用。药物组合物可以以局部或全身性方式施用，例如，通过将重组精氨酸酶直接注射至器官，任选地在储库(depot)中。
肠胃外注射剂可以被配制用于团注或连续输注。所述药物组合物可以是适合于肠胃外注射的形式，作为油性或水性媒介物(vehicle)中的无菌悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的重组精氨酸的水溶液。可将重组精氨酸的悬浮液配制为油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。该悬浮液还可以含有增加重组精氨酸酶的溶解度和/或减少重组精氨酸酶的聚集以允许制备高度浓缩溶液的适宜的稳定剂或试剂。或者，该重组精氨酸酶可以是冻干的或为粉末形式，以供在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水来重建。在一些实施方案中，静脉内施用本发明的纯化的聚乙二醇化的重组精氨酸酶。
所述重组精氨酸酶可以局部施用，并且可以被配制成多种可局部施用的组合物，诸如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药棒、香膏、乳膏和软膏。这样的药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张度增强剂、缓冲液和防腐剂。
在实施本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文所述的重组精氨酸酶以药物组合物的形式施用于罹患影响免疫系统的病况的受试者。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物，如人。根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力和其他因素，治疗有效量可以大范围地变化。
药物组合物可以利用一种或多种生理学上可接受的包含赋形剂和助剂的载体来配制，所述载体有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。制剂可以根据所选择的给药途径来改进。包含本文所述化合物的药物组合物可以通过例如混合、溶解、造粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋或压缩工艺来制备。所述药物组合物可以包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以及游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。
用于制备包含本文所述化合物的重组精氨酸酶的方法包括将该重组精氨酸酶与一种或多种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。液体组合物包括例如溶解有重组精氨酸酶的溶液、包含重组精氨酸酶的乳液或含有脂质体、微束或包含本文所公开的重组精氨酸酶的纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。所述组合物可以是液体溶液或悬浮液，适合于在使用前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或作为乳液。这些组合物还可以含有少量的无毒、辅助性物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其他药学上可接受的添加剂。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可见于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第十七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，所述每一篇文献均通过引用以其全文并入。
给药方法
可以施用本文所述的含有重组精氨酸酶或重组精氨酸酶的功能性片段的药物组合物以用于预防性和/或治疗性处理。在治疗性应用中，可将所述组合物以足以治愈或至少部分控制疾病或病况的症状或足以治好、治愈、改善或减轻病况的量施用于已患有该疾病或病况的受试者。还可以施用重组精氨酸酶以减小病况发展、罹患(contracting)或恶化的可能性。用于这一应用的有效量可根据疾病或病况的严重程度和病程、既往疗法、受试者的健康状况、体重和对药物的反应以及治疗医生的判断而不同。在一些实施方案中，本文描述的发明提供了一种治疗受试者中的炎性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的纯化的重组精氨酸酶。在一些实施方案中，该炎性疾病是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，该炎性疾病是多发性硬化。在一些实施方案中，该炎性疾病是骨中的慢性或急性炎症。在一些实施方案中，该纯化的重组精氨酸酶是聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I。在一些实施方案中，该人精氨酸酶I是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，该聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
多种重组精氨酸酶可以以任意顺序或同时施用。在一些情况下，重组精氨酸酶的多个功能性片段可以以任意顺序或同时施用。如果同时施用，多种重组精氨酸酶可以以单次、统一的形式如静脉内注射剂提供，或者以多次的形式例如作为多次静脉内注射剂或丸剂提供。可以将所述重组精氨酸酶共同或分别地包装在单个包装或多个包装中。可以以多剂量给予一种或全部重组精氨酸酶。如果不同时施用，多个剂量之间的时间选择可以变化长达约一个月。
可以将本发明的化合物和组合物包装为试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括关于所述化合物和组合物的用法的书面说明。在一些实施方案中，本发明提供了一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I，其中所述施用调节所述炎症。在一些实施方案中，施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I至少24小时。在一些实施方案中，施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I至少一周。在一些实施方案中，施用治疗有效量的纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I至少两周。
可以在疾病或病况发生之前、过程中或之后施用本文所述的重组精氨酸酶或其功能性片段，并且施用含有重组精氨酸酶的组合物的时机选择可以不同。例如，该重组精氨酸酶可以用作预防剂，并且可以向具有病况或疾病倾向的受试者连续施用以便减少该疾病或病况发生的可能性。可在症状发作过程中或在症状发作之后尽快将所述重组精氨酸酶施用于受试者。可在症状发作时立即、症状发作的前3小时内、症状发作的前6小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前48小时内或从症状发作起的任何时间段内开始施用所述重组精氨酸酶。最初施用可以经由任何实用途径，诸如通过利用本文所述的任何制剂的本文所述的任何途径。在一些实施方案中，本公开内容的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I的施用是静脉内施用。可以在检测到或怀疑免疫疾病或病况的发作之后，一旦可行就施用重组精氨酸酶，并且施用治疗该免疫疾病所需的时间长度，例如，约24小时至约48小时，约48小时至约1周、约1周至约2周、约2周至约1个月、约1个月至约3个月。在一些实施方案中，可以施用重组精氨酸酶至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。治疗的长度可对于每一个受试者而不同。在一些实施方案中，所述重组精氨酸酶的聚乙二醇化调节重组精氨酸酶的体内半衰期。
剂量
本文所述的药物组合物可以是适合于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型中，所述制剂被分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。该单位剂量可以是含有离散量的所述制剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊剂以及小瓶或安瓿中的粉剂。可以将水性悬浮液组合物包装在单剂量的不能重复密封的容器中。多剂量的能重复密封的容器可以例如与防腐剂或不与防腐剂联合使用。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含防腐剂。用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型例如在安瓿中提供，或在具有防腐剂的多剂量容器中提供。
本文所述的重组精氨酸酶或其功能性片段可以以约1mg至约2000mg、约5mg至约1000mg、约10mg至约500mg、约50mg至约250mg、约100mg至约200mg、约1mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约150mg、约150mg至约200mg、约200mg至约250mg、约250mg至约300mg、约300mg至约350mg、约350mg至约400mg、约400mg至约450mg、约450mg至约500mg、约500mg至约550mg、约550mg至约600mg、约600mg至约650mg、约650mg至约700mg、约700mg至约750mg、约750mg至约800mg、约800mg至约850mg、约850mg至约900mg、约900mg至约950mg或约950mg至约1000mg的范围存在于组合物中。
本文所述的重组精氨酸酶或其功能性片段可以以约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg或约2000mg的量存在于组合物中。
本发明的聚乙二醇化的重组精氨酸酶或其功能性片段的治疗有效剂量可以为约1ng/kg至约10ng/kg、约1ng/kg至约100ng/kg、约1ng/kg至约1mg/kg、约1ng/kg至约10mg/kg、约1ng/kg至约100mg/kg、约1ng/kg至约250mg/kg、约1ng/kg至约500mg/kg、约1ng/kg至约750mg/kg、约1ng/kg至约1,000mg/kg、约1ng/kg至约1,250mg/kg、约1ng/kg至约1,500mg/kg、约1ng/kg至约1,750mg/kg、约1ng/kg至约2,000mg/kg、约10ng/kg至约100ng/kg、约10ng/kg至约1mg/kg、约10ng/kg至约10mg/kg、约10ng/kg至约100mg/kg、约10ng/kg至约500mg/kg、约10ng/kg至约750mg/kg、约10ng/kg至约1,000mg/kg、约10ng/kg至约1,250mg/kg、约10ng/kg至约1,500mg/kg、约10ng/kg至约2,000mg/kg、约100ng/kg至约1mg/kg、约100ng/kg至约10mg/kg、约100ng/kg至约100mg/kg、约100ng/kg至约250mg/kg、约100ng/kg至约500mg/kg、约100ng/kg至约750mg/kg、约100ng/kg至约1,000mg/kg、约100ng/kg至约1,250mg/kg、约100ng/kg至约1,500mg/kg、约100ng/kg至约1,750mg/kg、约100ng/kg至约2,000mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约100mg/kg、约1mg/kg至约500mg/kg、约1mg/kg至约750mg/kg、约1mg/kg至约1,000mg/kg、约1mg/kg至约1,250mg/kg、约1mg/kg至约1,500mg/kg、约1mg/kg至约1,750mg/kg、约1mg/kg至约2,000mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约500mg/kg、约10mg/kg至约750mg/kg、约10mg/kg至约1,000mg/kg、约10mg/kg至约1,250mg/kg、约10mg/kg至约1,500mg/kg、约10mg/kg至约1,750mg/kg、约10mg/kg至约2,000mg/kg、约100mg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约750mg/kg、约100mg/kg至约1,000mg/kg、约100mg/kg至约1,250mg/kg、约100mg/kg至约1,500mg/kg、约100mg/kg至约1,750mg/kg、约100mg/kg至约2,000mg/kg、约500mg/kg至约750mg/kg、约500mg/kg至约1,000mg/kg、约500mg/kg至约1,250mg/kg、约500mg/kg至约1,500mg/kg、约500mg/kg至约1,750mg/kg、约500mg/kg至约2,000mg/kg、约750mg/kg至约1,000mg/kg、约750mg/kg至约1,250mg/kg、约750mg/kg至约1,500mg/kg、约750mg/kg至约1,750mg/kg、约750mg/kg至约2,000mg/kg、约1,000mg/kg至约1,250mg/kg、约1,000mg/kg至约1,500mg/kg、约1,000mg/kg至约1,750mg/kg或约1,000mg/kg至约2,000mg/kg。
在一些实施方案中，纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段的治疗有效量为约1mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I的治疗有效量为约10mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，纯化的聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I或其功能性片段的治疗有效量大于100mg/kg。
药代动力学和药效学测量
药代动力学和药效学数据可以通过多种实验技术获得。描述特定组合物的适当的药代动力学和药效学谱组分可由于不同受试者中的药物代谢的差异而不同。药代动力学和药效学谱可以基于一组受试者的平均参数的测定。这组受试者包括适合于测定代表性平均值的任何合理数目的受试者，例如，5个受试者、10个受试者、15个受试者、20个受试者、25个受试者、30个受试者、35个受试者或更多。通过计算全部受试者的每个所测参数的测量值的平均值来确定该平均值。
如本文所述，可以调节剂量以获得所需的药代动力学或药效学谱，诸如所需的或有效的血液谱。为了在体外更好地表征重组人精氨酸酶I的酶动力学，测量了五种不同的重组精氨酸酶的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km。
表2显示了五种人重组精氨酸酶的酶动力学研究的总结。
Figure BDA0002944503160000271
所述药代动力学参数可以是适合于描述本发明的重组精氨酸酶I或其功能性片段的血浆谱的任何参数。例如，可以在给药例如约零分钟、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约31分钟、约32分钟、约33分钟、约34分钟、约35分钟、约36分钟、约37分钟、约38分钟、约39分钟、约40分钟、约41分钟、约42分钟、约43分钟、约44分钟、约45分钟、约46分钟、约47分钟、约48分钟、约49分钟、约50分钟、约51分钟、约52分钟、约53分钟、约54分钟、约55分钟、约56分钟、约57分钟、约58分钟、约59分钟、约60分钟、约零小时、约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、约10.5小时、约11小时、约11.5小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约16.5小时、约17小时、约17.5小时、约18小时、约18.5小时、约19小时、约19.5小时、约20小时、约20.5小时、约21小时、约21.5小时、约22小时、约22.5小时、约23小时、约23.5小时或约24小时之后的一个时刻获得药代动力学谱。
所述药代动力学参数可以是适合于描述重组精氨酸酶I或其功能性片段的任何参数。Cmax可以为例如，不小于约1μg/mL；不小于约5μg/mL；不小于约10μg/mL；不小于约15μg/mL；不小于约20μg/mL；不小于约25μg/mL；不小于约50μg/mL；不小于约75μg/mL；不小于约100μg/mL；不小于约200μg/mL；不小于约300μg/mL；不小于约400μg/mL；不小于约500μg/mL；不小于约600μg/mL；不小于约700μg/mL；不小于约800μg/mL；不小于约900μg/mL；不小于约1000μg/mL；不小于约1250μg/mL；不小于约1500μg/mL；不小于约1750μg/mL；不小于约2000μg/mL；或适合于描述本文所述的精氨酸酶的药代动力学谱的任何其他Cmax。Cmax可以为例如，约1μg/mL至约5,000μg/mL；约1μg/mL至约4,500μg/mL；约1μg/mL至约4,000μg/mL；约1μg/mL至约3,500μg/mL；约1μg/mL至约3,000μg/mL；约1μg/mL至约2,500μg/mL；约1μg/mL至约2,000μg/mL；约1μg/mL至约1,500μg/mL；约1μg/mL至约1,000μg/mL；约1μg/mL至约900μg/mL；约1μg/mL至约800μg/mL；约1μg/mL至约700μg/mL；约1μg/mL至约600μg/mL；约1μg/mL至约500μg/mL；约1μg/mL至约450μg/mL；约1μg/mL至约400μg/mL；约1μg/mL至约350μg/mL；约1μg/mL至约300μg/mL；约1μg/mL至约250μg/mL；约1μg/mL至约200μg/mL；约1μg/mL至约150μg/mL；约1μg/mL至约125μg/mL；约1μg/mL至约100μg/mL；约1μg/mL至约90μg/mL；约1μg/mL至约80μg/mL；约1μg/mL至约70μg/mL；约1μg/mL至约60μg/mL；约1μg/mL至约50μg/mL；约1μg/mL至约40μg/mL；约1μg/mL至约30μg/mL；约1μg/mL至约20μg/mL；约1μg/mL至约10μg/mL；约1μg/mL至约5μg/mL；约10μg/mL至约4,000μg/mL；约10μg/mL至约3,000μg/mL；约10μg/mL至约2,000μg/mL；约10μg/mL至约1,500μg/mL；约10μg/mL至约1,000μg/mL；约10μg/mL至约900μg/mL；约10μg/mL至约800μg/mL；约10μg/mL至约700μg/mL；约10μg/mL至约600μg/mL；约10μg/mL至约500μg/mL；约10μg/mL至约400μg/mL；约10μg/mL至约300μg/mL；约10μg/mL至约200μg/mL；约10μg/mL至约100μg/mL；约10μg/mL至约50μg/mL；约25μg/mL至约500μg/mL；约25μg/mL至约100μg/mL；约50μg/mL至约500μg/mL；约50μg/mL至约100μg/mL；约100μg/mL至约500μg/mL；约100μg/mL至约400μg/mL；约100μg/mL至约300μg/mL；或约100μg/mL至约200μg/mL。
本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的Tmax可以为例如，不大于约0.5小时、不大于约1小时、不大于约1.5小时、不大于约2小时、不大于约2.5小时、不大于约3小时、不大于约3.5小时、不大于约4小时、不大于约4.5小时、不大于约5小时或适合于描述本文所述化合物的药代动力学谱的任何其他Tmax。Tmax可以为例如，约0.1小时至约24小时；约0.1小时至约0.5小时；约0.5小时至约1小时；约1小时至约1.5小时；约1.5小时至约2小时；约2小时至约2.5小时；约2.5小时至约3小时；约3小时至约3.5小时；约3.5小时至约4小时；约4小时至约4.5小时；约4.5小时至约5小时；约5小时至约5.5小时；约5.5小时至约6小时；约6小时至约6.5小时；约6.5小时至约7小时；约7小时至约7.5小时；约7.5小时至约8小时；约8小时至约8.5小时；约8.5小时至约9小时；约9小时至约9.5小时；约9.5小时至约10小时；约10小时至约10.5小时；约10.5小时至约11小时；约11小时至约11.5小时；约11.5小时至约12小时；约12小时至约12.5小时；约12.5小时至约13小时；约13小时至约13.5小时；约13.5小时至约14小时；约14小时至约14.5小时；约14.5小时至约15小时；约15小时至约15.5小时；约15.5小时至约16小时；约16小时至约16.5小时；约16.5小时至约17小时；约17小时至约17.5小时；约17.5小时至约18小时；约18小时至约18.5小时；约18.5小时至约19小时；约19小时至约19.5小时；约19.5小时至约20小时；约20小时至约20.5小时；约20.5小时至约21小时；约21小时至约21.5小时；约21.5小时至约22小时；约22小时至约22.5小时；约22.5小时至约23小时；约23小时至约23.5小时；或约23.5小时至约24小时。
本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的AUC(0-inf)可以为例如，不小于约100μg·hr/mL、不小于约125μg·hr/mL、不小于约150μg·hr/mL、不小于约175μg·hr/mL、不小于约200μg·hr/mL、不小于约250μg·hr/mL、不小于约300μg·hr/mL、不小于约350μg·hr/mL、不小于约400μg·hr/mL、不小于约500μg·hr/mL、不小于约600μg·hr/mL、不小于约700μg·hr/mL、不小于约800μg·hr/mL、不小于约900μg·hr/mL、不小于约1000μg·hr/mL、不小于约2000μg·hr/mL、不小于约3000μg·hr/mL、不小于约4000μg·hr/mL、不小于约5000μg·hr/mL、不小于约6000μg·hr/mL、不小于约7000μg·hr/mL、不小于约8000μg·hr/mL、不小于约9000μg·hr/mL、不小于约10000μg·hr/mL、不小于约11000μg·hr/mL、不小于约12000μg·hr/mL、不小于约13000μg·hr/mL、不小于约14000μg·hr/mL、不小于约15000μg·hr/mL、不小于约16000μg·hr/mL、不小于约17000μg·hr/mL、不小于约18000μg·hr/mL、不小于约19000μg·hr/mL、不小于约20000μg·hr/mL、不小于约21000μg·hr/mL、不小于约22000μg·hr/mL、不小于约23000μg·hr/mL、不小于约24000μg·hr/mL、不小于约25000μg·hr/mL、不小于约26000μg·hr/mL、不小于约27000μg·hr/mL、不小于约28000μg·hr/mL、不小于约29000μg·hr/mL、不小于约30000μg·hr/mL、不小于约31000μg·hr/mL、不小于约32000μg·hr/mL、不小于约33000μg·hr/mL、不小于约34000μg·hr/mL、不小于约35000μg·hr/mL或适合于描述本文所述精氨酸酶的药代动力学谱的任何其他AUC(0-inf)。
本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的AUC(0-inf)可以为例如，约1,000μg·hr/mL至约1,250μg·hr/mL；约1,250μg·hr/mL至约1,500μg·hr/mL；约1,500μg·hr/mL至约1,750μg·hr/mL；约1,750μg·hr/mL至约2,000μg·hr/mL；约2,000μg·hr/mL至约2,500μg·hr/mL；约2,500μg·hr/mL至约3,000μg·hr/mL；约3,000μg·hr/mL至约3,500μg·hr/mL；约3,500μg·hr/mL至约4,000μg·hr/mL；约4,000μg·hr/mL至约4,500μg·hr/mL；约4,500μg·hr/mL至约5,000μg·hr/mL；约5,000μg·hr/mL至约5,500μg·hr/mL；约5,500μg·hr/mL至约6,000μg·hr/mL；约6,000μg·hr/mL至约6,500μg·hr/mL；约6,500μg·hr/mL至约7,000μg·hr/mL；约7,000μg·hr/mL至约7,500μg·hr/mL；约7,500μg·hr/mL至约8,000μg·hr/mL；约8,000μg·hr/mL至约8,500μg·hr/mL；约8,500μg·hr/mL至约9,000μg·hr/mL；约9,000μg·hr/mL至约9,500μg·hr/mL；约9,500μg·hr/mL至约10,000μg·hr/mL；约10,000μg·hr/mL至约20,000μg·hr/mL；约20,000μg·hr/mL至约30,000μg·hr/mL；约30,000μg·hr/mL至约40,000μg·hr/mL；约40,000μg·hr/mL至约50,000μg·hr/mL；约50,000μg·hr/mL至约60,000μg·hr/mL；约60,000μg·hr/mL至约70,000μg·hr/mL；约70,000μg·hr/mL至约80,000μg·hr/mL；约80,000μg·hr/mL至约90,000μg·hr/mL；或约90,000μg·hr/mL至约100,000μg·hr/mL。
本文所述的重组人精氨酸酶I或其功能性片段的血浆浓度可以为例如，不小于约1μg/mL、不小于约2μg/mL、不小于约3μg/mL、不小于约4μg/mL、不小于约5μg/mL、不小于约6μg/mL、不小于约7μg/mL、不小于约8μg/mL、不小于约9μg/mL、不小于约10μg/mL、不小于约11μg/mL、不小于约12μg/mL、不小于约13μg/mL、不小于约14μg/mL、不小于约15μg/mL、不小于约16μg/mL、不小于约17μg/mL、不小于约18μg/mL、不小于约19μg/mL、不小于约20μg/mL、不小于约21μg/mL、不小于约22μg/mL、不小于约23μg/mL、不小于约24μg/mL、不小于约25μg/mL、不小于约26μg/mL、不小于约27μg/mL、不小于约28μg/mL、不小于约29μg/mL、不小于约30μg/mL、不小于约31μg/mL、不小于约32μg/mL、不小于约33μg/mL、不小于约34μg/mL、不小于约35μg/mL、不小于约36μg/mL、不小于约37μg/mL、不小于约38μg/mL、不小于约39μg/mL、不小于约40μg/mL、不小于约41μg/mL、不小于约42μg/mL、不小于约43μg/mL、不小于约44μg/mL、不小于约45μg/mL、不小于约46μg/mL、不小于约47μg/mL、不小于约48μg/mL、不小于约49μg/mL、不小于约50μg/mL、不小于约51μg/mL、不小于约52μg/mL、不小于约53μg/mL、不小于约54μg/mL、不小于约55μg/mL、不小于约56μg/mL、不小于约57μg/mL、不小于约58μg/mL、不小于约59μg/mL、不小于约60μg/mL、不小于约61μg/mL、不小于约62μg/mL、不小于约63μg/mL、不小于约64μg/mL、不小于约65μg/mL、不小于约66μg/mL、不小于约67μg/mL、不小于约68μg/mL、不小于约69μg/mL、不小于约70μg/mL、不小于约71μg/mL、不小于约72μg/mL、不小于约73μg/mL、不小于约74μg/mL、不小于约75μg/mL、不小于约76μg/mL、不小于约77μg/mL、不小于约78μg/mL、不小于约79μg/mL、不小于约80μg/mL、不小于约81μg/mL、不小于约82μg/mL、不小于约83μg/mL、不小于约84μg/mL、不小于约85μg/mL、不小于约86μg/mL、不小于约87μg/mL、不小于约88μg/mL、不小于约89μg/mL、不小于约90μg/mL、不小于约91μg/mL、不小于约92μg/mL、不小于约93μg/mL、不小于约94μg/mL、不小于约95μg/mL、不小于约96μg/mL、不小于约97μg/mL、不小于约98μg/mL、不小于约99μg/mL、不小于约100μg/mL、不小于约105μg/mL、不小于约110μg/mL、不小于约115μg/mL、不小于约120μg/mL、不小于约125μg/mL、不小于约130μg/mL、不小于约135μg/mL、不小于约140μg/mL、不小于约145μg/mL、不小于约150μg/mL、不小于约155μg/mL、不小于约160μg/mL、不小于约165μg/mL、不小于约170μg/mL、不小于约175μg/mL、不小于约180μg/mL、不小于约185μg/mL、不小于约190μg/mL、不小于约195μg/mL、不小于约200μg/mL、不小于约205μg/mL、不小于约210μg/mL、不小于约215μg/mL、不小于约220μg/mL、不小于约225μg/mL、不小于约230μg/mL、不小于约235μg/mL、不小于约240μg/mL、不小于约245μg/mL、不小于约250μg/mL或本文所述化合物的任何其他血浆浓度。
血浆浓度可以为例如，约1μg/mL至约2μg/mL；约1μg/mL至约5μg/mL；约5μg/mL至约10μg/mL；约10μg/mL至约25μg/mL；约25μg/mL至约50μg/mL；约50μg/mL至约75μg/mL；约75ng/mL至约100μg/mL；约100μg/mL至约150μg/mL；约100μg/mL至约200μg/mL about 150μg/mL至约200μg/mL；约200μg/mL至约250μg/mL；约250μg/mL至约300μg/mL；约300μg/mL至约350μg/mL；约350μg/mL至约400μg/mL；约400μg/mL至约450μg/mL；约450μg/mL至约500μg/mL；约500μg/mL至约600μg/mL；约600μg/mL至约700μg/mL；约700μg/mL至约800μg/mL；约800μg/mL至约900μg/mL；约900μg/mL至约1,000μg/mL；约1,000μg/mL至约1,100μg/mL；约1,100μg/mL至约1,200μg/mL；约1,200μg/mL至约1,300μg/mL；约1,300μg/mL至约1,400μg/mL；约1,400μg/mL至约1,500μg/mL；约1,500μg/mL至约1,600μg/mL；约1,600μg/mL至约1,700μg/mL；约1,700μg/mL至约1,800μg/mL；约1,800μg/mL至约1,900μg/mL；或约1,900μg/mL至约2,000μg/mL。
实施例1.采用重组精氨酸酶I调节免疫系统。
进行以下实验来表征纯化精氨酸酶在调节免疫病况如与炎症相关的病况中的功能。
材料与方法
小鼠：floxed PTEN小鼠由Tak W.Mak(Suzuki,A.等人2001.T cell-specificloss of Pten leads to defects in central and peripheral tolerance.Immunity14:523-534)描述。LysM cre小鼠最初由Clausen等人(Clausen,B.E.等人TransgenicRes.8:265-277)描述。采用回交至少10代的C57Bl/6背景的8-12周龄野生型、floxed PTENcre阳性和cre阴性小鼠进行同窝出生仔畜对照实验。在胶原诱发的关节炎实验中使用DBA小鼠。所有动物均被饲养和安置在维也纳医科大学(Medical University of Vienna)的12h/12h昼/夜循环和恒温的SPF设施中。使用两种性别的小鼠，并且没有发现性别特异性的差异。
基因型分型：小鼠在出生后3-4周做耳切(earmarking)。来自裂解的(蛋白酶K裂解缓冲液)耳组织的DNA利用GoTaq聚合酶(PromegaTM)进行直接PCR。采用以下引物进行特定的PCR：PTEN引物：正向，5′-CTCCTCTACTCCATTCTTCCC-3′，反向，5′-ACTCCCACCAATGAACAAAC-3′；cre引物：正向，5′-TCGCGATTATCTTCTATATCTTCAG-3′，反向，5′-GCTCGACCAGTTTAGTTACCC-3′。
原代巨噬细胞的制备和培养：通过将2ml 4％巯基乙酸盐(SigmaTM)注射入腹膜腔，然后在3天后用空培养基进行腹腔灌洗，来产生巯基乙酸盐引发的腹膜巨噬细胞。将分离出的巨噬细胞以1x 106个细胞/ml的浓度接种在补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素/两性霉素B、1％L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(InvitrogenTM)中，并在37℃下5％CO2的气氛中培养。使细胞复原过夜，并通过给巨噬细胞培养物补充以下试剂和细胞因子进行体外刺激：100ng/ml超纯大肠杆菌(E.coli)O111:B4脂多糖(LPS)(InvivogenTM)、100nM渥曼青霉素(wortmannin)(SigmaTM)、10或200μM N-羟基-L-精氨酸(CalbiochemTM)或5ng/ml重组小鼠IL-4/IL-13(R&D SystemsTM)。刺激进行3、8或24hr以分别用于RNA提取、ABCD测定或蛋白质分离和细胞因子测量。
骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的制备和培养：从标示的小鼠的股骨和胫骨冲洗出骨髓细胞，并在37℃下5％CO2的气氛中在补充有20ng/ml重组小鼠GM-CSF(R&D SystemsTM)的完全RPMI培养基中培养。在分离后的第3天和第6天用补充有20ng/ml GM-CSF的新鲜培养基更换所述培养基的一半。收获树突细胞(DC)并在第7天激活，且利用针对CD80(PE-Cy5TM)和MHC-II(PerCP-eFluor 710TM)(eBioscienceTM)的荧光缀合抗体通过流式细胞术测定成熟状态。将样品与抗体混合物在4℃下一起温育15min，随后将其捕获在LSRII流式细胞仪(Beckton DickinsonTM)上。利用FlowJoTM Software 10.0(TreestarTM)软件来分析数据。
免疫印迹分析：将细胞均质化并在Laemmli缓冲液中裂解。在10％变性聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白质，在电泳之后用考马斯亮蓝(Thermo ScientificPierceTM)染色。将蛋白质印迹到聚偏氟乙烯膜(PVDFTM,MilliporeTM)上，并且在用5％奶粉/0.1％吐温20封闭之后与第一抗体温育过夜。使用以下抗体：鸡抗精氨酸酶1(由Dr.Morris惠赠)，针对iNOS(NEBTM)、PTEN、STAT6、pSTAT6(Cell Signaling TechnologyTM)、C/EBPβ(Santa Cruz Biotech)或β-肌动蛋白(SigmaTM)的兔抗体。在与相应的过氧化物酶缀合的第二抗体在室温(RT)下一起温育2hr且随后采用SuperSignal West Femto(PierceTM)显色之后，利用化学发光法(FluorChem HD2化学发光成像仪，Alpha InnotechTM)来检测信号。根据它们的分子量分析条带。
抗生物素蛋白-生物素复合物DNA(ABCD)测定：将细胞用裂解缓冲液(10mM TrispH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA pH 8.0，10％甘油，0.5％NP-40，1mM DTT，蛋白酶抑制剂)裂解，超声处理(6次脉冲2秒)，离心，并将上清液与缓冲液H(20mM HEPES pH 7.9，50mM KCl，20％甘油，1mM DTT，0.1％NP-40)、2.μg 5'-生物素化的寡核苷酸和20.μg鲱精DNA在37℃下一起温育5min，然后在冰上温育1h。对于竞争对照(comp)，添加了10倍过量的非生物素化的寡核苷酸。阴性对照(nc)含有细胞裂解物、鲱精DNA和缓冲液H。将缓冲液H平衡的链霉抗生物素-琼脂糖珠子(NovagenTM)添加至pull-down和对照，随后在旋转器上于4℃温育30nin。将珠子离心，用缓冲液H洗涤数次，在Laemmli缓冲液中煮沸，并通过SDS-PAGE分离。通过Western印迹法(Santa Cruz BiotechTM)检测C/EBPβ。5'-生物素化的和非生物素化的寡核苷酸从MicroSynth定购：C/EBPβ_for：TAT TAG CCA ATA TTA GCC AAT ATT AGC CAA TATTAG CCA，C/EBPβ_rev：TGG CTA ATA TTG GCT AAT ATT GGC TAA TAT TGG CTA ATA。
总RNA分离、反转录和定量反转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR)：按照制造商的说明将细胞均质化并用Trifast Reagent(PEQLAB Biotechnology GmbHTM)进行分离。如指导手册中所述，使用高容量cDNA反转录试剂盒(FermentasTM)转录cDNA。使用Fast SYBR GreenMaster Mix(Applied BiosystemsTM)，采用StepOne Real-Time PCR系统(AppliedBiosystemsTM)和表3中的引物，通过实时PCR对mRNA的表达予以量化。根据它们的解链曲线的质量一式两份地测定样品。将靶基因的水平相对于HPRT或GAPDH进行归一化，并描述为相对于未受刺激的细胞的诱导倍数。
Figure BDA0002944503160000361
酶联免疫吸附测定(ELISA)：由淋巴细胞或巨噬细胞分泌的选定细胞因子的上清液水平通过利用商购可得的酶联免疫吸附测定(ELISA)(全部来自eBioscience)来测定，以供根据制造商的方案量化IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12/23(p40/共同亚单位)和IL-17A。在用LPS刺激后24h，分析巨噬细胞上清液中的IL-6和IL-12/23。对在第4天收集的同种异体的混合白细胞反应的和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫的小鼠的再刺激的脾细胞和淋巴细胞的上清液，测定IL-2、IFN-γ和IL-17A。简而言之，培养板用捕获抗体包被、封闭，并加载经稀释的样品和标准品以供过夜温育。接着，将培养板与检测抗体，且随后与链霉抗生物素-HRP(R&D SystemsTM)一起温育，以用于显色TMB 2-组分微孔过氧化物酶。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的诱发和离体再刺激：将小鼠分为4组，每组由4至8只小鼠组成(参见表4中的研究设计)。简而言之，为免疫小鼠注射150μl乳液，该乳液含有等份MOG35-55(1mg/ml,Charite BerlinTM)和IFA(SigmaTM)，补充有10mg/ml结核分枝杆菌H37Ra(DifcoTM)。
在免疫时和免疫后第二天，通过腹膜内途径施用200ng百日咳毒素(CalbiochemTM)。对于纯化的重组人精氨酸酶I的体内施用，小鼠在免疫前第-4天和第-2天静脉内注射10mg/kg体重的剂量，或在免疫前第-4天、第-2天和免疫后第5天和第7天静脉内注射10mg/kg体重或1mg/kg体重的剂量。每天观察小鼠的临床体征。将EAE的进展分为4个临床阶段：0期：无体征，1期：完全软尾(floppy tail)，2期：严重的轻截瘫，3期：四肢轻瘫，4期：垂死状态。对于离体刺激，将淋巴细胞和脾细胞分离并用30μg/ml同源MOG-肽刺激3天，以用于增殖分析和细胞因子测定。
混合白细胞反应(MLR)：如上所述生成野生型DC。在分化的第6天将所述细胞的一部分用30μg/ml纯化重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)刺激24小时，另一部分用作未受刺激的对照。在不存在纯化重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)的情况下(通过准确洗涤而去除)，在分化的第7天进行MLR。简而言之，将所有细胞激活并加载LPS(100ng/ml，InvitrogenTM)和卵清蛋白(50μg/ml，SigmaTM)4小时，洗涤，并与OT-II细胞共同培养。采用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi BiotecTM)经由阳性磁法细胞分选(positive magnetic cell sorting)从OT-II小鼠的脾中分离出应答的(responder)T细胞，根据制造商的说明书(SigmaTM)用7μMCFSE/1x107细胞进行标记。洗涤DC(100 000个细胞)并与应答的T细胞(500 000个细胞)以500μl总体积接种在48孔中。在共同培养的第3天，收获细胞、固定并使之经历细胞内染色。为了增殖，将细胞收获在TruCount管中并针对CFSE稀释进行分析。
通过流式细胞术进行的CD4*T细胞表型分析：从第3天的MLR体外培养物中分离出细胞并用PMA/离子霉素(SigmaTM)与Golgi-Stop(BD BiosciencesTM)共同再刺激，且针对细胞内细胞因子进行分析。以下抗体用于细胞因子染色：抗小鼠CD4–PerCP(克隆RM4-5，BDPharmingenTM)、CD25-PE-Cy7(克隆PC61.5)、
Figure BDA0002944503160000381
450(克隆JES6-5H4)、IL-10-Alexa
Figure BDA0002944503160000382
647(克隆JES5-16E3)、IL-17A-PE-Cy7(克隆17B7)、IFNγ-PE(克隆XMG1.2，全部来自eBioscienceTM)。在LSR 2流式细胞仪(BD BiosciencesTM)和FlowJoTM软件第10.0版(TreestarTM)上进行细胞捕获和数据分析。
统计学：通过使用非配对双尾Student’s t检验计算数据的统计显著性。使用两因素ANOVA分析来随时间分析两个组。利用GraphPad Prism软件(GraphPadTM Software,LaJolla,USA)进行统计分析。结果表示为平均值+/-标准差。p值<0.05被认为是统计上显著的(p值表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
结果
为了更好地表征精氨酸酶I表达与免疫细胞激活之间的生物串扰(crosstalk)，研究了精氨酸酶I mRNA在不同条件下的表达概况。在缺乏PTEN的树突细胞和同窝出生仔畜来源的对照细胞的全基因组筛选中，我们鉴定出了提高的精氨酸酶I mRNA水平。图1示出了在巨噬细胞中LPS对精氨酸酶I的上调。在图1中，巯基乙酸盐引起的腹膜巨噬细胞(tPM)用大肠杆菌O111:B4 LPS诱导8h和24h。精氨酸酶I表达在LPS刺激后8小时在mRNA水平上(图1，A图)和在LPS诱导后24小时内在蛋白质水平上(图1，B图)增加。选择这些时间点以用于进一步分析巨噬细胞中独立于PI3K/PTEN信号传导途径的LPS介导的精氨酸酶I表达。
缺乏PTEN的巨噬细胞中精氨酸酶I的高表达提示，参与先天免疫的信号转导途径的一个或多个组分可以调节或精氨酸酶I表达或被精氨酸酶I表达调节。图2示出了精氨酸酶I表达的增加，伴随着PTEN的损失。图2中的A图示出了在未受刺激的、缺乏PTEN的幼稚腹膜巨噬细胞中精氨酸酶I mRNA的显著上调。这些实验在固有的腹膜巨噬细胞和无菌炎症诱导的腹膜巨噬细胞中进行(图2，B图和C图)。根据上调的精氨酸酶I mRNA表达，观察到在未受刺激的PTEN-/-tPM中stabilin1的mRNA水平增加(图2，D图)和YM1和FIZZ的表达减少(图2，E图和F图)。还证实了在PTEN阴性细胞中精氨酸酶I的蛋白质表达的增加。
为了进一步评估精氨酸酶I响应于LPS诱导的信号传导事件的功能，在LPS激活后24小时分析了精氨酸酶I在mRNA和蛋白质水平上的表达水平(图2，H图和I图)。从同窝出生仔畜对照小鼠中收获的野生型巨噬细胞显示精氨酸酶I的轻微上调。值得注意的是，在LPS刺激的缺乏PTEN的巨噬细胞中，突出的M1标志物iNOS的表达也得到增强。
进行以下实验以进一步研究免疫细胞中精氨酸酶I的更广泛的免疫调节功能的机理：1)用LPS刺激野生型巨噬细胞；2)用真菌PI3K抑制剂渥曼青霉素抑制刺激，据报道该抑制剂在体外和体内LPS诱导时增强细胞因子合成(Guha,M.和N.Mackman.2002.Thephosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway limits lipopolysaccharideactivation of signaling pathways and expression of inflammatory mediators inhuman monocytic cells.J.Biol.Chem.277:32124-32132)；Schabbauer,G.等人2004.PI3K-Akt pathway suppresses coagulation and inflammation in endotoxemicmice.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24:1963-1969)；以及采用3)精氨酸酶抑制剂N-羟基-去甲-L-精氨酸(L-nor-Arg)。精氨酸酶I的抑制显著增强了巨噬细胞中IL-6的产生量(图2，J图)。还评估了与野生型巨噬细胞相比，精氨酸酶特异性抑制剂对PTEN-/-巨噬细胞的减少的细胞因子产生量的影响。经采用L-nor-Arg处理，在缺乏PTEN的tPM中确实发现了野生型IL-6产生量的显著但仅部分的恢复(图2，K图)。
在缺乏PTEN的过表达精氨酸酶的tPM中，药理学精氨酸酶抑制和抗炎性表型的消融支持精氨酸酶I有助于炎性应答的PI3K介导的调节的观点。
巨噬细胞中的PTEN缺失上调转录因子C/EBPβ，该转录因子对于精氨酸酶I启动子激活是至关重要的。为了阐明负责精氨酸酶I的PTEN介导的基因调节的分子机制，分析了若干潜在的候选转录因子(TF)。精氨酸酶I的最突出的调节剂是STAT 6，它在巨噬细胞中被IL-4和/或IL-13激活(Gordon,S.和F.O.Martinez.2010.Alternative activation ofmacrophages:mechanism and functions.Immunity 32:593-604)。未受刺激的tPM——来源于同窝出生仔畜对照动物的缺乏PTEN的细胞或野生型细胞——没有显示出通过磷酸特异性STAT6抗体测得的STAT6总蛋白质含量或激活的STAT6的任何明显变化。另一种候选转录因子是C/EBPβ，它已显示出有助于精氨酸酶I的模式识别受体介导的调节(El Kasmi,K.C.等人2008.Toll-like receptor-induced arginase 1in macrophages thwartseffective immunity against intracellular pathogens.Nat.Immunol.9:1399-1406)。
为了表征通过调节上游因子调节精氨酸酶I表达的机理，分析了PTEN对C/EBPβ的调节和随后C/EBPβ对精氨酸酶I的组成性上调。图3示出了C/EBPβ在缺乏PTEN的巨噬细胞中的功能。图3中的小图A示出了在缺乏PTEN的tPM中C/EBPβ蛋白质的上调。图3中的小图B示出了C/EBPβ、LAP和LAP*的两个同种型获得了相同的结果。在LPS诱导后8小时内观察到转录因子的进一步诱导。然而，至少在我们已经评估的时间点处(8h)，我们无法鉴定到当TLR4激活时PTEN缺失对C/EBPβ的额外的上调。因为在LPS诱导后24h观察到最大的精氨酸酶I表达，因此我们不能排除C/EBPβ差异表达可能在激活的缺乏PTEN的巨噬细胞中更早地发生。
由于C/EBPβ是作用于特定DNA元件的转录因子，所以研究了C/EBPβ与含有若干不同TF共有结合位点的精氨酸酶增强子元件的结合。利用跨越位于转录起始位点上游3.8kb的精氨酸酶增强子内的C/EBPβ共有位点的生物素化的寡核苷酸，用抗生物素蛋白生物素偶联DNA(ABCD)结合试验评估C/EBPβDNA结合性质。在过表达C/EBPβ的HEK细胞中测试该实验系统的适宜性。过表达的C/EBPβ有效地结合能够与结合它的转录因子(特别是LAP*同种型)共同沉淀的寡核苷酸。接着，分析在巨噬细胞中PTEN缺乏对C/EBPβDNA结合的影响。首先，验证用于ABCD结合试验的裂解物中C/EBPβ的存在。通过相对于GAPDH进行再检验来确定ABCD试验的相等输入(图3，小图C)。TF与精氨酸酶寡核苷酸的结合的分析表明，除了增加的蛋白质水平外，还发生了增强的C/EBPβ的结合。LAP*被鉴定为与精氨酸酶增强子寡核苷酸结合的主要同种型(图3，小图D)。
这些数据提示了精氨酸酶I表达经由C/EBPβ的PI3K/PTEN调节的潜在机理。
实施例2.精氨酸酶I的细胞外活性
为了研究精氨酸酶I的细胞作用位点，分析了腹膜巨噬细胞的上清液(SN)。出乎意料地，精氨酸酶I被释放到细胞外空间内。这与精氨酸酶I对应物iNOS相反。
为了进一步评估精氨酸酶I在细胞因子产生中的作用和抗原呈递细胞极化T细胞的潜力，转移了针对野生型骨髓衍生的GM-CSF分化的树突细胞调适的培养基，并分析它们对LPS的炎性应答。图4示出了PI3K的组成性激活促进精氨酸酶I表达和向细胞外空间内的释放。令人惊讶地，数据显示了T细胞极化细胞因子IL-6和IL-12p40的蛋白质水平的下调，该p40是IL-12和IL-23的共同亚单位(也表示为IL-12/23)(图4，小图D)。接着，利用纯化的重组人精氨酸酶I(recArgI)，我们尝试用来自缺乏PTEN的巨噬细胞的精氨酸酶I条件培养基的高表达模拟生理环境。为此，将由LPS刺激的树突细胞与纯化的重组人精氨酸酶I一起预温育。检测到与用条件培养基处理类似的IL-6和IL-12/23的降低的表达水平。与IL-6相比，表达的减少在IL-12/23表达上更显著(图4，小图E)。
为了进一步表征精氨酸酶I表达与PTEN表达之间的生物串扰，测定了缺乏PTEN的细胞中精氨酸酶I和IL-4/IL-13的表达。PTEN的缺乏导致精氨酸酶I的高度增加的表达水平，甚至在未受刺激的腹膜巨噬细胞tPM中亦是如此(图4，小图A)。这些发现令人惊奇且出乎意料。为了量化这些结果，分析了来源于5只野生型同窝出生仔畜和PTEN-/-动物的巨噬细胞。在PTEN-/-巨噬细胞中检测到细胞外精氨酸酶I表达的大于10倍的增加(图4，小图B和C)。此外，我们评估了响应于LPS和平行于IL-4和IL-13的组合激活的精氨酸酶I分泌。在这两种情况下，我们观察到在缺乏PTEN的巨噬细胞中分泌增加，这在有限程度上还可以在野生型细胞中看到(图4，小图B底部)。
结果表明，巨噬细胞的细胞外环境中精氨酸酶I的存在可能以旁分泌方式表现出抗炎性质。
实施例3.游离精氨酸酶I强效地抑制T细胞极化。
为了分析重组人精氨酸酶I对抗原呈递和T细胞极化性质的影响，骨髓衍生的GM-CSF分化的野生型树突细胞用重组精氨酸酶I预调适过夜，然后向细胞加载卵清蛋白(Ova)和用LPS刺激。为了避免对T细胞的潜在影响，通过多个洗涤步骤从DC中去除recArgI，然后将它们与分离的OT-II T细胞以5:1的比例一起培养。如通过流式细胞术测得的，以30μg/ml浓度的重组精氨酸酶I处理树突细胞并未改变原型DC激活标志物CD80和MHCII的表面表达。
在共同培养DC和T细胞3天之后评估MLR的结果。图5示出了精氨酸酶I对T细胞极化的抑制。我们观察到表达Th1和Th17特征细胞因子IFNγ(图5，小图A和B)和IL17A(图5，小图D和E)的CD4+T细胞的显著减少。我们注意到存在产生IL-17的细胞，但是数目低。在LPS/Ova引发(priming)之后在MLR过程中分泌的T细胞细胞因子的分析显示IFNγ的释放的显著差异，而IL-17A则没有显著不同(图5，小图C和F)。评估了在分裂的T细胞中如通过CFSE稀释测得的增殖。然而，在重组精氨酸酶I的存在下我们没有发现显著变化(图5，小图G和H)。数据表明，在抗原呈递细胞的存在下细胞外精氨酸酶I减轻(ameliorate)T细胞引发，从而降低在Th1细胞中优先极化的能力。
为了进一步证实这一假设，对在T细胞介导的自身免疫疾病的临床相关模型中重组精氨酸酶I在体内抑制T细胞极化的能力进行了表征。
实施例4.重组精氨酸酶I在多发性硬化的治疗中的作用
自身免疫疾病的特征在于失调的免疫系统。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型是本领域公认的多发性硬化的动物模型。为了研究重组精氨酸酶I调节免疫应答的能力，对用纯化精氨酸酶治疗的多发性硬化小鼠模型的应答进行了表征。EAE小鼠反映出一些但非全部的人自身免疫病理学特征(Lassmann,H.和H.J.van.2011.The molecularbasis of neurodegeneration in multiple sclerosis.FEBS Lett.585:3715-3723)。通过用CFA中的MOG35-55肽免疫在野生型小鼠中诱发EAE(Lassmann,H.和H.J.van.2011.Themolecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis.FEBS Lett.585:3715-3723)。此外，施用百日咳毒素。
如下对重组精氨酸酶I在减轻疾病进展中的潜在功效进行表征：为了确定治疗的时间表，当抗原呈递和T细胞极化仍然进行时，如表4所示，精氨酸酶以两种不同浓度在免疫之前施用及免疫之后立刻施用。
Figure BDA0002944503160000431
Figure BDA0002944503160000441
图6示出了用重组人精氨酸酶I治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的结果。对照组在12天后发生了EAE的可见体征，进一步增加直到第17天。用重组精氨酸酶I(10mg/kg)预治疗对疾病的进程没有任何影响(图6，小图C)。与之相对，用重组精氨酸酶I(10mg/kg)进行预治疗和后治疗表征为疾病发作以及等级的显著降低(图6，小图A)。在相同的实验设置下，测试聚乙二醇化的精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)的最小治疗有效剂量(1mg/kg)。治疗延缓了疾病的发作，但是用较低剂量的聚乙二醇化的精氨酸酶I治疗则没有显著抑制疾病进展和严重程度(图6，小图B)。
为了在分子水平上分析MOG特异性T细胞应答，我们收获了脾和引流淋巴结(腹股沟的)，并在体外用MOG35-55肽再刺激来源于重组人精氨酸酶治疗的和对照的EAE小鼠的脾细胞和淋巴结细胞。在没有被外源性刺激进一步激活的情况下再刺激细胞导致IFNγ和IL-17A向上清液中的分泌显著增加(参见图6，小图D-G中的对照相对于对照+MOG)。有趣的是，我们发现在预治疗和后治疗组(1mg/kg以及10mg/kg重组精氨酸酶I)中减少的IFNγ(图6，小图D和E)和IL-17A(图6，小图F和G)水平的高度显著性差异，特别是在引流淋巴结中。这些数据表明，通过减弱CD4+T细胞产生对于发展成EAE不可缺少的细胞因子IFNγ和IL-17A的能力，在抗原呈递阶段至少较高浓度的重组精氨酸酶I治疗有效地减弱了小鼠中的EAE病理学。
实施例5.重组精氨酸酶I在类风湿性关节炎的治疗中的作用
关节炎是与不同水平的疼痛、肿胀、关节僵直和有时与关节周围的持久疼痛相关的自身免疫病况。存在超过100种不同形式的关节炎，包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎和相关自身免疫疾病。脓毒性关节炎由关节感染引起。
患有关节炎的个体的主诉是关节痛。疼痛通常是持久的并且可局限于受影响的关节。来自关节炎的疼痛是由关节周围发生的炎症、因疾病对关节的损伤、关节的日常磨损、炎症引起的肌肉紧张而导致的。为了评估重组人精氨酸酶I在治疗关节炎中的作用，我们测量了用重组蛋白治疗的关节炎小鼠的若干临床参数。图7描绘了测量用重组人精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠的多个临床参数的图。图7中的小图A示出了接受盐水、1mg/kg/w或10mg/kg/w重组人精氨酸酶I的小鼠的体重变化百分比。图7中的小图B是标绘接受先前所述治疗的小鼠的II型α-胶原抗体滴度(任意单位)的图。图7中的小图C和小图D是上述相同小鼠的两个不同临床参数即爪肿胀和握力的测量值。结果表明，用重组人精氨酸酶I每周治疗关节炎小鼠减轻了疾病但不阻止疾病进展。图8是示出用人重组人精氨酸酶I减轻关节炎小鼠的爪肿胀的照片。图8中的小图A示出了仅接受盐水处理的关节炎小鼠的肿胀。图8中的小图B示出了接受10mg/kg聚乙二醇化的人重组精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠的肿胀。如通过腕关节直径的减小所测得的，数据的统计定量表明，以1mg/kg和10mg/kg的重组人精氨酸酶I治疗关节炎小鼠均减轻了爪肿胀。
图9对应于示出关节炎小鼠中不同细胞因子的定量的图。图9和图10中的动物用胶原免疫进行处理，这促进小鼠中的关节炎。图9中的小图A和小图B显示在用重组人精氨酸酶I治疗的小鼠中仅观察到IL17A和IL12/23水平的适度降低。图9中的小图C示出了在用重组人精氨酸酶I治疗的关节炎小鼠中炎性细胞因子白介素6(IL-6)的全身性释放的减少。图10中的-小图A-C表明在DBA小鼠的胶原诱发的关节炎(CIA)中促炎性细胞因子的水平没有改变。作为与关节炎治疗的比较，图11示出了用人重组人精氨酸酶I治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的临床评分(关于进一步的细节，参见实施例1)。结果表明纯化的重组人精氨酸酶I可以有效地治疗免疫系统的病况。
为了测试重组精氨酸酶在包括抗原呈递、细胞因子释放和T细胞极化的体内环境中的作用，采用荧光激活细胞分选实验来表征EAE小鼠中免疫细胞的群体。在疾病进展为部分后肢瘫痪的表型之后进行精氨酸酶治疗，并且表明了至少用SEQ ID NO.9的重组精氨酸酶治疗可以促进较快的恢复。图12描绘了在用重组人精氨酸酶I治疗的EAE小鼠中免疫细胞群体的荧光激活细胞分选分析。图13描绘了荧光激活细胞分选实验的结果，表明用重组人精氨酸酶I治疗防止了T细胞增殖。
实施例6.聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I制剂
体外和体内实验指出细胞外精氨酸酶I的免疫调节性质。为了配制、在体内评估和优化用于施用重组人精氨酸酶I的药物组合物，进行了表征重组精氨酸酶I的聚乙二醇化的若干实验。聚乙二醇化是聚乙二醇(PEG)聚合物链共价附接至另一个分子的过程。PEG共价附接至药物或治疗性蛋白质可以降低来自受试者的免疫系统的重组精氨酸酶I的免疫原性和抗原性，并且增大重组精氨酸酶的流体动力学大小，这可以延长聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I的体内半衰期。
图14是用于优化包含重组人精氨酸酶I的药物组合物的过程的示意图。测试了不同大小的PEG分子共价附接至重组精氨酸酶I分子的三种不同方法。出于说明性的目的，图14描述了不同PEG分子通过不同方法附接至SEQ ID NO:1，但是应当理解，聚乙二醇化的优化策略适用于SEQ ID NOS.1-16中的任何一个。图14示出了将PEG聚合物链共价附接至例如SEQ ID No.1的三种方法，即胺-NH2缀合、半胱氨酸(-SH)缀合和N-末端修饰。如图14所述，优化了多种突变重组人精氨酸酶在特定残基处的聚乙二醇化。
表5总结了多种突变重组人精氨酸酶通过半胱氨酸(-SH)缀合的聚乙二醇化。图15显示了以3mg/kg的单次静脉内剂量用表5所示聚乙二醇化的精氨酸酶获得的SpragusDawley大鼠中的血清精氨酸消耗水平。
Figure BDA0002944503160000461
Figure BDA0002944503160000471
半衰期T1/2，药物施用之后的峰值血浆浓度Cmax，和施用单剂量之后的浓度-时间曲线的积分，聚乙二醇化的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的AUC。表6中显示了在六只不同的大鼠中-SH修饰的聚乙二醇化的精氨酸酶。在施用3mg/kg的单次静脉内剂量之后获得每个测量值(平均值±SD；n＝6)。
Figure BDA0002944503160000472
表7总结了多种突变重组人精氨酸酶通过胺(–NH2)缀合的聚乙二醇化。图16是示出采用在Lys残基上聚乙二醇化的多种精氨酸酶通过重组人精氨酸酶I消耗血清精氨酸的图。图17是示出多种重组人精氨酸酶I蛋白质通过胺(–NH2)缀合的聚乙二醇化程度的图。
Figure BDA0002944503160000473
Figure BDA0002944503160000481
表8中显示了在六只不同大鼠中的半衰期T1/2，药物施用之后的峰值血浆浓度Cmax，和施用单剂量之后的浓度-时间曲线的积分，多种胺(–NH2)修饰的聚乙二醇化的精氨酸酶的AUC。在施用3mg/kg的单次静脉内剂量之后获得每个测量值(平均值±SD；n＝6)。大鼠中的药代动力学数据表明，重组人精氨酸酶I在多个位点处用低分子量PEG如甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)进行聚乙二醇化可以在体内提供有效的精氨酸消耗。
Figure BDA0002944503160000482
此外，如表9所述测量了多种突变精氨酸酶的酶动力学参数。总之，用小分子量PEG修饰重组人精氨酸酶未导致酶活性的降低。
Figure BDA0002944503160000491
图18是示出聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I的表位分析的图。
实施例7.重组精氨酸酶I在人自身免疫病况的治疗中的作用
如在前面的实施例中所公开的，精氨酸酶I用作细胞内和细胞外水平上的免疫调节蛋白质。在本领域公认的多发性硬化和类风湿性关节炎模型中，精氨酸酶介导的L-精氨酸消耗的药理学干预可以有效地减轻肿胀、疼痛和关节僵直(实施例4和5)。
类风湿性关节炎(RA)的特征为慢性的炎性疾病，其中免疫系统破坏滑膜关节和附属结构。由于RA的进行性性质，该自身免疫病况可在若干器官系统内导致关节外的并发症。本公开内容的重组精氨酸酶I的施用可以用于治疗人类中的类风湿性关节炎。
SEQ ID NO:1至16中公开的任意一种重组人精氨酸酶可以用于治疗人类中的自身免疫病况，诸如多发性硬化或类风湿性关节炎。所述纯化的精氨酸酶可以被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述纯化的精氨酸酶经由胺与分子量约5kDa的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)寡聚体缀合而被聚乙二醇化(实施例6)。在其他实施方案中，所述纯化的精氨酸酶可以采用任何其他合适的PEG寡聚体来聚乙二醇化。
纯化的精氨酸酶的聚乙二醇化可以提供具有低免疫原性的用于治疗RA的药物组合物，例如，重组人精氨酸酶I用低分子量PEG如(5kDa mPEG-SPA寡聚体)在多个位点处的聚乙二醇化有效地降低了表位的暴露，从而导致具有低免疫原性的有效治疗。本文公开的各种PEG寡聚体可以用来有效地降低本公开内容的精氨酸酶的表位的暴露。
实施例8.重组精氨酸酶I在器官移植中的作用
免疫抑制减少在自身免疫疾病中的异常免疫应答，但是它也可以降低正常免疫应答以防止移植的器官或细胞的排斥。免疫调节药物在器官移植的控制中是重要的。SEQ IDNO:1-16中公开的任意一种重组人精氨酸酶可以在器官移植控制中用作免疫调节药。在一些实施方案中，所述重组精氨酸酶被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述重组精氨酸酶经由胺与分子量约5kDa的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)寡聚体缀合而被聚乙二醇化。在其他实施方案中，所述纯化的精氨酸酶可以用任何其他合适的PEG寡聚体来聚乙二醇化。重组精氨酸酶的聚乙二醇化可以提供具有低免疫原性的用于治疗RA的药物组合物：重组人精氨酸酶I用低分子量PEG如(5kDa mPEG-SPA寡聚体)在多个位点处的聚乙二醇化可以有效地降低表位的暴露，从而导致免疫原性的降低。本文公开的各种PEG寡聚体可以用来有效地降低本公开内容的精氨酸酶的表位的暴露。
实施例9.用重组人精氨酸酶I治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠是本领域公认的多发性硬化模型。EAE还广泛地用作T细胞介导的自身免疫疾病的动物模型。
为了研究用治疗有效量的重组精氨酸酶治疗受试者中的炎性疾病的有效性，研究了聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I SEQ ID NO:9在调节受刺激的T细胞中干扰素γ和IL-17A的mRNA和蛋白质表达中的有效性(治疗方案和T细胞分离如实施例1中所述)。图19示出了用纯化的人精氨酸酶I抑制的来自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)再刺激的T细胞的IFNγ和IL-17A mRNA表达水平。图20示出了用纯化的人精氨酸酶I抑制的来自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)再刺激的T细胞的IFNγ和IL-17A蛋白质表达水平。图19和20示出了在MOG刺激的T细胞中IFNγ和IL-17A的mRNA和蛋白质水平的显著降低。
图21示出了用重组人精氨酸酶I治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的临床评分的改善。在该实验中，抗原呈递细胞用聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I SEQ IDNO:9进行离体处理并被移植回EAE小鼠中。图21中的小图A示出了在接受离体刺激的抗原呈递细胞之前未受到CFA和百日咳毒素攻击的EAE小鼠的临床评分。图21中的小图A示出了未受到CFA和百日咳毒素攻击的小鼠的临床评分的延迟改善。图21中的小图B示出了在接受离体刺激的抗原呈递细胞之前受到CFA和百日咳毒素攻击的EAE小鼠的临床评分。图21中的小图B示出了更迅速的临床评分改善。
实施例10.用重组人精氨酸酶I调节破骨细胞分化
在健康的骨中，骨形成和骨吸收是正常的骨重建所涉及的过程。在重建的过程中，称为破骨细胞的细胞再吸收骨组织，而称为成骨细胞的细胞则沉积新的骨组织。破骨细胞在脊椎动物(vertebral)骨骼的骨的重建、维护和修复中是重要的。例如，破骨细胞功能障碍与骨质疏松症相关。
采用破骨细胞分化试验来评估SEQ ID NO:9中公开的重组人精氨酸酶调节破骨细胞分化的能力。图22是破骨细胞分化试验的示意图。在分化试验的第0天，采用标准技术从雄性小鼠中分离出骨髓细胞，即，用PBS从胫骨(fibia)中冲洗出骨髓细胞，将其接种在10cm组织培养皿中并用100ng/ml的M-CSF处理。在用M-CSF诱导分化3天后，收获细胞并以100,000个细胞/ml的密度接种。随后用50ng/ml RANKL和30ng/ml M-CSF处理所接种的细胞。在分化方案的第7-8天，对破骨细胞进行TRAP染色并计数。图23中的小图A是列举在破骨细胞分化试验中计数的具有至少三个细胞核的破骨细胞的数目的图。如图23中的小图A所示，在分化方案的第3天和第6天以及与RANKL一起温育，用重组精氨酸酶I处理骨髓细胞。图23中的小图B是示出用酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)染色对照培养皿中的细胞(未处理的)和用300ng/ml的重组人精氨酸酶SEQ ID NO:9处理的细胞的代表性显微镜照片。TRAP染色是破骨细胞的标记。数据以平均值±SEM显示且每组n＝两只小鼠，并且数据对应于两个独立实验。在每个独立实验中进行三次技术重复。*表示p<0.05，***表示p<0.001。B.
在分化方案过程中的不同时间点，通过qPCR监测内源性精氨酸酶I mRNA的表达水平。图24是示出与管家控制基因HPRT的水平相比，在分化方案的第3天和第7天在对照细胞中的精氨酸酶I表达水平的图。表3中公开了精氨酸酶引物的序列。图24示出了在破骨细胞发生过程中精氨酸酶I的表达损失。精氨酸酶I的信使RNA水平在破骨细胞分化的第3天添加RANKL之后降低。图24的数据以平均值±SEM显示且每组n＝5只小鼠，并且是两个组合的独立实验。*表示p<0.05。
为了评估重组精氨酸酶I调节破骨细胞分化的能力，在分化方案的第3天和第6天将剂量增加的重组人精氨酸酶SEQ ID NO:9添加至不同的培养皿。使用的实验方案如下(最少三个不同的培养皿接受每一种处理)：a)对照培养皿不用重组人精氨酸酶处理；b)第一实验培养皿在分化方案的第3天和第6天用1ng/ml剂量的重组人精氨酸酶处理；c)第二实验培养皿在分化方案的第3天和第6天用10ng/ml剂量的重组人精氨酸酶处理；d)第三实验培养皿在分化方案的第3天和第6天用100ng/ml剂量的重组人精氨酸酶处理；e)第五实验培养皿在分化方案的第3天和第6天用1,000ng/ml(1μg/ml)剂量的重组人精氨酸酶处理。图25示出了在破骨细胞分化的第3天和第6天添加重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)可以调节破骨细胞形成。图25中的小图A显示了添加1,000ng/ml的重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)抑制破骨细胞形成。图25中的小图B示出用a)-e)所述的重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)的剂量处理的细胞的代表性显微镜照片。在100至300ng/ml的浓度下，重组人精氨酸酶I(SEQ IDNO.9)可以以剂量依赖性方式阻断破骨细胞发生。图25中的小图B示出了不管是否与RANKL一起温育，与1,000ng/ml一起温育的细胞在形态上均呈现为TRAP阴性巨噬细胞。图25的数据以平均值±SEM显示且每组n＝6只小鼠，并且是三个组合的独立实验，***表示p<0.001。
为了评估重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)在调节破骨细胞分化中的直接作用，在添加未处理的、变性的和酶促灭活的重组人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)的情况下进行上述分化方案。该试验评估变性的和酶促灭活的精氨酸酶I在促进或抑制破骨细胞形成中的能力。该精氨酸酶I酶为a)热变性的(70℃10min)或b)用300μM的抑制剂nor-NOHA酶促灭活的。随后在分化方案的第3天添加精氨酸酶以分离培养皿。图26示出了与未处理的对照培养皿相比，在补充有变性的和N(ω)-羟基-去甲-精氨酸(nor-NOHA)处理的重组人精氨酸酶I(SEQID NO.9)的分化试验中可以列举的分化破骨细胞的数目。观察到正常的破骨细胞计数，这表明精氨酸的可用度是破骨细胞形成的先决条件。图26的数据以平均值±SEM显示且每组n＝2只小鼠，并且代表一个实验。图26证实，破骨细胞发生的阻断依赖于精氨酸酶I的催化功能。
破骨细胞通过自血液中的循环单核细胞衍生的许多细胞的融合而形成，所述循环单核细胞衍生自造血干细胞。为了评估精氨酸酶I在造血干细胞的分化中的作用，在第0天添加1μg/ml的重组人精氨酸酶I的情况下进行上述分化方案。图27证实在分化方案的第0天将1μg/ml剂量的重组人精氨酸酶I添加至造血干细胞未影响破骨细胞形成。图27的数据以平均值±SEM显示且每组n＝4只小鼠。数据显示两个独立实验的组合。
为了评估10μg/ml剂量的重组人精氨酸酶I在造血干细胞中的作用，在第0天和第6天添加10μg/ml的重组人精氨酸酶I的情况下进行上述分化方案。图28示出了在造血干细胞中添加10μg/ml剂量的重组人精氨酸酶I(分化的第0天；“d0”)可干扰破骨细胞形成。此外，在已经分化6天(分化的第6天；“d6”)的细胞中添加1μg/ml剂量的重组人精氨酸酶I仍可干扰破骨细胞形成。图28的数据以平均值±SEM显示且每组n＝2只小鼠，并且代表一个实验。
为了评估不同剂量的重组人精氨酸酶I在破骨细胞发生所涉及的基因的表达水平中的作用，(在与重组人精氨酸酶I一起温育以及不温育的情况下)在分化7天后测定破骨细胞发生的相关基因的mRNA水平。图29示出了在有和没有重组人精氨酸酶I的情况下，在分化过程中TRAP、RANK、NFAT c1和c-FOS基因的表达水平的变化。在添加100ng/ml重组人精氨酸酶I之后，RANK、NFATc1和c-FOS的信使RNA水平增加，这表明较低精氨酸酶I浓度的刺激作用。1,000ng/ml重组人精氨酸酶I的添加与TRAP、RANK、NFAT c1和c-FOS基因的有力下调有关。图29的数据以平均值±SEM显示且每组n＝4只小鼠，并且是两个组合的独立实验。
实施例11.用重组人精氨酸酶I对骨病况的体内调节
通过去除10周龄的雌性小鼠的卵巢建立骨质疏松症的小鼠模型。该手术在小鼠中诱发人工绝经和骨损失并提供了用于研究骨质疏松症的体内模型。将高至30mg/kg的SEQID NO:9中公开的重组人精氨酸酶每周两次施用于所述小鼠。在处理开始后的4周处死小鼠并进行评价。进行胫骨的组织学分析以评估骨容量和骨破坏。利用OsteoMeasure软件(OsteoMetrics Inc.,Atlanta)评估该疾病模型中成骨细胞和破骨细胞的存在。
实施方案
实施方案1.一种治疗有需要的受试者中的炎性疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中所述炎性疾病是多发性硬化。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述重组精氨酸酶是聚乙二醇化的。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组精氨酸酶是重组人精氨酸酶I。
实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约1mg/Kg至约10mg/Kg。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约10mg/Kg至约100mg/Kg。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量大于100mg/Kg。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于120μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于80μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于10μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的纯化重组精氨酸酶是单位剂型。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶是部分纯化的。
实施方案18.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶基本上是纯的。
实施方案19.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶为至少95％纯。
实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中所述精氨酸酶为至少99％纯。
实施方案21.一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用调节所述炎症。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。
实施方案23.根据实施方案21和22中任一项所述的方法，其中所述重组精氨酸酶是聚乙二醇化的。
实施方案24.根据实施方案21-23中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组精氨酸酶是聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I。
实施方案25.根据实施方案21-24中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶抑制T细胞极化。
实施方案26.根据实施方案21-25中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶调节细胞因子释放。
实施方案27.根据实施方案21-26中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是白介素6。
实施方案28.根据实施方案21-26中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是干扰素γ。
实施方案29.根据实施方案21-28中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶I包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16。
实施方案30.根据实施方案21-29中任一项所述的方法，其中所述炎症与自身免疫病症相关。
实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述自身免疫病症是多发性硬化。
实施方案32.根据实施方案30所述的方法，其中所述自身免疫病症是类风湿性关节炎。
实施方案33.根据实施方案21-32中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的施用在所述受试者中提供不大于10μM的精氨酸血浆水平。
实施方案34.根据实施方案31或32中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约1mg/kg受试者体重至约10mg/kg受试者体重。
实施方案35.根据实施方案31或32中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约10mg/kg受试者体重至约100mg/kg受试者体重。
实施方案36.根据实施方案31或32中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量大于100mg/kg受试者体重。
实施方案37.根据实施方案21-36中任一项所述的方法，其中在24小时的时间段内向受试者施用至少一次治疗有效量的所述纯化精氨酸酶。
实施方案38.根据实施方案21-37中任一项所述的方法，其中在48小时的时间段内向受试者施用至少一次治疗有效量的所述纯化精氨酸酶。
实施方案39.根据实施方案21-38中任一项所述的方法，其中在1周的时间段内向受试者施用至少一次治疗有效量的所述纯化精氨酸酶。
实施方案40.根据实施方案21-39中任一项所述的方法，其中在2周的时间段内向受试者施用至少一次治疗有效量的所述纯化精氨酸酶。
实施方案41.根据实施方案21-40中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案42.一种调节免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用调节所述免疫应答。
实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。
实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述重组精氨酸酶是聚乙二醇化的。
实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组精氨酸酶是聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I。
实施方案46.根据实施方案42-45中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16。
实施方案47.根据实施方案42-46中任一项所述的方法，其中所述调节免疫应答抑制受试者的免疫系统。
实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中所述受试者的免疫系统的抑制有助于细胞、组织或器官移植到该受试者中。
实施方案49.纯化的重组精氨酸酶或其功能性片段在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的药物中的用途。
实施方案50.根据实施方案49所述的用途，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
实施方案51.根据实施方案49所述的用途，其中所述炎性疾病是多发性硬化。
实施方案52.根据实施方案49所述的用途，其中所述纯化的重组精氨酸酶是聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I。
实施方案53.根据实施方案52所述的用途，其中所述药物包含少于1000mg的所述纯化的重组精氨酸酶。
实施方案54.根据实施方案53所述的用途，其中所述药物包含少于100mg的所述纯化的重组精氨酸酶。
实施方案55.根据实施方案54所述的用途，其中所述药物包含少于10mg的所述纯化的重组精氨酸酶。
实施方案56.根据实施方案55所述的用途，其中所述药物包含少于1mg的所述纯化的重组精氨酸酶。
实施方案57.根据实施方案49所述的用途，其中所述药物在受试者中提供低于120μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案58.根据实施方案49所述的用途，其中所述药物在受试者中提供低于80μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案59.根据实施方案49所述的用途，其中所述药物在受试者中提供低于10μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案60.根据实施方案49所述的用途，其中所述施用是静脉内施用。
实施方案61.根据实施方案49所述的用途，其中所述受试者是人。
实施方案62.一种包含纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质或其功能性片段以及至少一个聚乙二醇寡聚体的药物组合物。
实施方案63.根据实施方案62所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质包含至少两个聚乙二醇寡聚体。
实施方案64.根据实施方案62所述的药物组合物，其中每一个聚乙二醇寡聚体的分子量为约20千道尔顿至约40千道尔顿。
实施方案65.根据实施方案63所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I蛋白质包含约4个聚乙二醇寡聚体至约13个聚乙二醇分子。
实施方案66.根据实施方案62所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇寡聚体的分子量为约5千道尔顿。
实施方案67.根据实施方案62所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇寡聚体与所述纯化的重组人精氨酸酶I的半胱氨酸残基缀合。
实施方案68.根据实施方案62所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇寡聚体与所述纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质的胺残基缀合。
实施方案69.根据实施方案62所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇寡聚体与所述纯化的重组人精氨酸酶I蛋白质的N-末端缀合。
实施方案70.根据实施方案62所述的药物组合物，其中将所述药物组合物包装为试剂盒。
实施方案71.一种治疗有需要的受试者中的骨疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述骨疾病是骨质疏松症。
实施方案73.根据实施方案71和72所述的方法，其中所述骨质疏松症与破骨细胞功能障碍相关。
实施方案74.根据实施方案71-73中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。
实施方案75.根据实施方案71-74中任一项所述的方法，其中所述重组精氨酸酶是聚乙二醇化的。
实施方案76.根据实施方案71-75中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组精氨酸酶是重组人精氨酸酶I。
实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组人精氨酸酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
实施方案78.根据实施方案71-77中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约1mg/Kg至约10mg/Kg。
实施方案79.根据实施方案78所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量为约10mg/Kg至约100mg/Kg。
实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶的治疗有效量大于100mg/Kg。
实施方案81.根据实施方案71-79中任一项所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于120μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于80μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶在受试者中提供低于10μM的精氨酸血浆浓度。
实施方案84.根据实施方案71-83中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
实施方案85.根据实施方案71-84中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的纯化重组精氨酸酶是单位剂型。
实施方案86.根据实施方案71-85中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案87.根据实施方案71-86中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶是部分纯化的。
实施方案88.根据实施方案71-87中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶基本上是纯的。
实施方案89.根据实施方案71-88中任一项所述的方法，其中所述精氨酸酶为至少95％纯。
实施方案90.根据实施方案89所述的方法，其中所述精氨酸酶为至少99％纯。
序列表
<110> 康达医药科技有限公司
<120> 采用精氨酸酶I调节免疫系统的方法和组合物
<130> 46106-701.601
<140> PCT/CN2015/077654
<141> 2015-04-28
<150> 61/985,924
<151> 2014-04-29
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 322
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
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Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys
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<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Pro Lys
<210> 6
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 7
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 8
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 9
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 10
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 12
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 13
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 14
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 15
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 16
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
20 25 30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Gln Glu Ala Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
50 55 60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
85 90 95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
115 120 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
130 135 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Ala Ile
165 170 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
180 185 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
195 200 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
210 215 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
245 250 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
260 265 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
275 280 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Ile Thr Leu Ala Ala Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
325
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 17
ctcctctact ccattcttcc c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 18
actcccacca atgaacaaac 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 19
tcgcgattat cttctatatc ttcag 25
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 20
gctcgaccag tttagttacc c 21
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 21
tattagccaa tattagccaa tattagccaa tattagcca 39
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 22
tggctaatat tggctaatat tggctaatat tggctaata 39
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
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acaccgccaa atttaactgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 24
gtgaagaacc cacggtctgt 20
<210> 25
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<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 25
tttctccagt gtagccatcc tt 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 26
ctggattggc aagaagttcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 27
ccctccttct gctctgtgtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成引物
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tacaccagtc cgtccctttc 20
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<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：合成引物
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ctggttgtca ggggagtgtt 20
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<223> 人工序列的描述：合成引物
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tctgggtaca agatccctga a 21
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cccttctcat ctgcatctcc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 32
caaacttggt gtggatgtcg 20

Claims (10)

1.一种治疗有需要的受试者中的炎性疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病是多发性硬化。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化精氨酸酶是重组精氨酸酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组精氨酸酶是聚乙二醇化的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组精氨酸酶是重组人精氨酸酶I。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重组人精氨酸酶I包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
8.一种调节炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用调节所述炎症。
9.一种调节免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用调节所述免疫应答。
10.一种治疗有需要的受试者中的骨病况的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的纯化精氨酸酶或其功能性片段。
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