CN113121655A

CN113121655A - 眼部和肌肉特异靶向型腺相关病毒载体及其应用

Info

Publication number: CN113121655A
Application number: CN202110420908.8A
Authority: CN
Inventors: 赵锴; 郑静; 肖啸; 杜增民; 陈晨; 杨晨; 蒋威; 吴侠; 程诚; 赵阳; 王利群
Original assignee: Shanghai Letter Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Letter Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN113121655B

Abstract

本发明涉及新型AAV衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。本发明的AAV载体具有良好的肌肉和视网膜组织靶向特异性，其可作为治疗性基因的送递载体用于治疗相关疾病。

Description

眼部和肌肉特异靶向型腺相关病毒载体及其应用

技术领域

本公开属于基因治疗技术领域。具体地，本公开涉及眼部和肌肉特异靶向型腺相关病毒衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。

背景技术

近年来，基因治疗蓬勃发展。作为在治疗性基因送递方面非常有前景的载体，腺相关病毒(AAV，adeno-associated virus)在各种器官组织中具有高转导效率、长期治疗效果和低致病性，这些特性使AAV在基因治疗领域具有明显的优势(参考文献1)。然而，野生型AAV血清型通常广谱地感染哺乳动物的多个组织/器官。因此，目前AAV的应用仍存在以下问题：野生型AAV具有广泛的组织靶向性，导致基因传递到脱靶的组织，从而加剧了不良反应。

迄今为止，已经开发了靶向不同器官(例如眼睛或骨骼肌)的AAV载体。例如，在2017年底，Spark Therapeutics生产的基于AAV2的基因治疗药物“Luxturna”已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗患有RPE65突变的莱伯氏先天性黑蒙病(LeberCongenital Amaurosis，LCA)。在2019年5月，FDA批准了基于AAV9的药物“Zolgensma”用于治疗脊髓性肌萎缩，这是一种由SMN基因突变引起的神经肌肉疾病。利用AAV作为载体的基因疗法已经在许多临床试验中得以运用，例如，这些基因疗法利用靶向眼睛或肌肉的AAV作为载体来治疗多种眼部和肌肉疾病(例如与年龄相关的黄斑变性、X连锁视网膜分裂症和杜氏肌肉营养不良)，且取得了不错的治疗效果。

研究显示，AAV载体的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。不同的衣壳决定了不同的AAV具有不同的组织亲嗜性及转化效率。为了改善AAV载体的组织特异性以及减轻免疫反应，可以采用例如DNA混编(DNA shuffling)、易错PCR和定点突变的方法来改造AAV衣壳。通常，可以采用定点突变技术在AAV的衣壳蛋白中插入7-20个氨基酸的多肽。例如，通过在AAV9的第588位氨基酸后插入7个氨基酸而获得的AAVPHP.B可改善血脑屏障通透性(参考文献2)。

因此，为了实现更好的治疗效果，期望对AAV衣壳蛋白进行合适的改造，获得具有器官特异性的新型腺相关病毒载体。

参考文献：

1.Li et al.,Nat Rev Genet(2020)21:255-272

2.Deverman et al.,Nat Biotechnol(2016)34:204-209

发明内容

经过大量研究，发明人发现，通过在AAV(例如AAV5)衣壳蛋白的可变区(例如在N573或Q574后)插入寡肽“PGVTPAP”，可以获得靶向视网膜和肌肉的新型AAV(例如AAV5)衣壳。由该新型AAV衣壳包装的新型AAV载体具有良好的肌肉和视网膜组织靶向特异性，有更低的毒副作用和更好的安全性潜力，可应用于肌肉或眼部相关疾病的预防、诊断和治疗。

因此，本公开提供了新型AAV衣壳蛋白，其可在体内或体外在肌肉细胞和视网膜细胞转导。该新型AAV衣壳蛋白可用于生产新型AAV载体，从而开展针对新型AAV载体的相关研究或可用于疾病治疗。

在第一方面，本公开提供一种新型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，所述新型AAV衣壳蛋白通过在AAV衣壳蛋白的可变区插入寡肽PGVTPAP构建而成。

上述腺相关病毒(AAV)可以选自任何AAV血清型。AAV血清型的实例包括天然的AAV(例如，天然的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)和其他人工改造的AAV(例如，人工改造的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)，优选AAV5。

在一个实施方式中，上述可变区选自VRII、VRIII、VRIV、VRV、VRVI、VRVII和VRVIII，优选VRVIII。在一个优选实施方式中，寡肽PGVTPAP插入至AAV衣壳蛋白的N573或Q574之后，优选插入至AAV衣壳蛋白的Q574之后，更优选插入至AAV5衣壳蛋白的Q574之后。

在一个优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性，优选上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一个更优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一个更优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在第二方面，本公开提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述新型AAV衣壳蛋白。

在一个优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，优选上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

在一个优选实施方式中，上述核酸分子包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在一个更优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在第三方面，本公开提供一种新型AAV载体，所述新型AAV载体包含上述新型AAV衣壳蛋白。

在一个优选实施方式中，上述新型AAV载体还包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，上述新型AAV载体还包含病毒基因组，所述病毒基因组可以是天然的AAV基因组或包含异源核酸的重组病毒基因组，所述病毒基因组可编码报告蛋白、天然蛋白、重组蛋白、抗原、抗体和/或用于核苷酸干扰(RNAi)治疗的多聚寡聚核苷酸元件(shRNA、miRNA)等。

在一个优选实施方式中，异源核酸编码一种或多种哺乳动物蛋白，或者是RNAi组分的序列(例如shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)。在另一个优选实施方式中，异源核酸编码某些抗体、抗原、合成蛋白或多肽的蛋白质序列。

在第四方面，本公开提供上述新型AAV载体在制备用于治疗眼部疾病或肌肉疾病的药物中的应用。

在第五方面，本公开提供一种药物，其包含上述新型AAV载体和可使病毒载体成药的试剂，所述药物用于治疗眼部疾病或肌肉疾病。

在一个实施方式中，可使病毒载体成药的试剂包括盐、有机物和表面活性剂。

在第六方面，本公开提供一种治疗眼部疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上述药物。

在第七方面，本公开提供一种治疗肌肉疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上述药物。

在一个实施方式中，上述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用，优选局部施用于眼睛，特别是作为滴眼剂施用、眼内注射或玻璃体内注射到眼睛中。

附图说明

图1A示出了候选AAV衣壳蛋白的筛选方法。

图1B为AAVz3的示意图。通过在AAV5衣壳蛋白的Q574后插入寡肽“PGVTPAP”得到AAVz3，其氨基酸序列如图1B所示。

图1C显示通过qPCR和银染定量的5×10⁷个细胞(培养基+裂解物)生产的AAV颗粒的滴度，以及AAV病毒颗粒的实心率。数据显示为平均值±SD，n＝3。

图2A示出了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)感染C2C12成肌细胞和其他细胞(C28/I2、Huh7和HEK293细胞)的图片。上层：GFP荧光；下层：明场；比例尺＝100μm。

图2B显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在C2C12成肌细胞中的特异性转导的定量结果，以GFP阳性C2C12细胞与GFP阳性C28/I2细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝6孔细胞/组。单向方差分析。

图2C显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在C2C12成肌细胞中的特异性转导的定量结果，以GFP阳性C2C12细胞与GFP阳性Huh7细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝6孔细胞/组。单向方差分析。

图2D显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在C2C12成肌细胞中的特异性转导的定量结果，以GFP阳性C2C12细胞与GFP阳性HEK293细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝6孔细胞/组。单向方差分析。

图3A显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在小鼠的肝、心、肺、脾的转导情况。比例尺＝100μm。

图3B显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在小鼠的腓肠肌(GA)、胫前肌(TA)和比目鱼肌(SO)的转导情况。比例尺＝100μm。

图3C显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在肌肉细胞中的特异性转导的定量结果，以基于细胞核数量(DAPI)统计的GFP阳性肌肉细胞(GA、TA和SO的平均值)与GFP阳性肝细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝5只小鼠/每组。单向方差分析。

图3D显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在肌肉细胞中的特异性转导的定量结果，以基于细胞核数量(DAPI)统计的GFP阳性肌肉细胞(GA、TA和SO的平均值)与GFP阳性心肌细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝5只小鼠/每组。单向方差分析。

图3E显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在肌肉细胞中的特异性转导的定量结果，以基于细胞核数量(DAPI)统计的GFP阳性肌肉细胞(GA、TA和SO的平均值)与GFP阳性肺细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝5只小鼠/每组。单向方差分析。

图3F显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)在肌肉细胞中的特异性转导的定量结果，以基于细胞核数量(DAPI)统计的GFP阳性肌肉细胞(GA、TA和SO的平均值)与GFP阳性脾细胞的比值作为统计指标。***p<0.001，n＝5只小鼠/每组。单向方差分析。

图4A显示了AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)的视网膜转导情况。

图4B显示了小鼠的视网膜切片。到达感光层的GFP信号由白色箭头指示。GCL：神经节细胞层。IPL：内部丛状层。INL：内核层。OPL：外丛状层。ONL：外核层。RPE：视网膜色素上皮。

图4C显示了不同AAV组相对于AAV5(标准化到1)的平均GFP荧光强度的定量结果。n＝4只眼睛/组，***p<0.001，单向方差分析。

图5显示AAVz3衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图6显示编码AAVz3衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：2)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。

在本文中，术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗眼部疾病的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该眼部疾病相关的一种或多种症状的量。

在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。

在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。

在本文中，术语“载体”是指包裹多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送到靶细胞中。载体的分类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“转基因(transgene)”，包含但不限于可以增强、抑制、削弱、保护、触发或预防某些生物学功能和生理机能的某些蛋白质或合成多肽的编码序列、疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白、多肽或肽的多核苷酸)、RNAi组分的编码序列(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)，或可选的标记。

在本文中，术语“免疫应答”是指宿主组织和细胞遭遇免疫原如AAV衣壳蛋白和转基因后参与的过程。它涉及淋巴网状组织、血液、脾脏或其他相关组织中免疫活性细胞(例如T淋巴细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞)的增殖、迁移和分化，从而导致抗体的产生或细胞介导的反应性的发展。换言之，宿主通过感染或疫苗接种而暴露于免疫原后诱导主动免疫应答。主动免疫是通过从免疫或非免疫宿主中“转移预先形成的物质(例如抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)”而获得的，而被动免疫则不是。

在本文中，术语“镶嵌(mosaic)”AAV衣壳核酸编码序列或衣壳蛋白指通过DNA混编、易错PCR和定点突变的方法人工设计和改造的AAV衣壳序列。

在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指异源多核苷酸被递送至宿主细胞发生转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用重组病毒将异源多核苷酸引入宿主细胞。

在本文中，术语“基因送递”指的是将异源多核苷酸引入细胞来进行基因传递，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。

在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。

在本文中，术语“靶向”是指病毒优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。本领域技术人员已知，如果没有顺式和反式作用因子(例如诱导型启动子或其他调节性核酸序列)，从病毒基因组转录异源核酸序列就不能开始。

在本文中，术语“多肽”是指至少20个通过肽键连接的氨基酸的聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中同义地是指由多于20个氨基酸组成的聚合物。该术语还包括合成氨基酸聚合物。

在本文中，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核苷酸、核糖核苷酸、其杂合序列和类似物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化或加帽的核苷酸或核苷酸类似物。

在本文中，与多核苷酸相关的术语“重组”意味着该多核苷酸是通过多步克隆步骤得到的不同于天然多核苷酸的合成产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。

在本文中，核酸序列为单链形式，从左到右为5’-3’的方向。本文中涉及的核酸序列和氨基酸序列参考IUPACIUB生化命名委员会推荐的形式。氨基酸序列采用单字母符号或三字母符号。

在一个实施方式中，本公开提供一种新型AAV5衣壳蛋白，其通过在AAV5衣壳蛋白的Q574后插入寡肽PGVTPAP构建而成。作为新型AAV5衣壳蛋白的一个示例，AAVz3衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码AAVz3的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本领域技术人员已知，AAV衣壳蛋白含有VP1、VP2和VP3蛋白，VP2和VP3蛋白在VP1蛋白内部的起始密码子处经历转录和翻译过程，即，VP1序列包含VP2和VP3序列。本公开提供了AAVz3衣壳的VP1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

在一个实施方式中，本公开提供另一种新型AAV衣壳蛋白，其通过在AAV衣壳蛋白中插入与“PGVTPAP”具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的寡肽构建而成。在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库。

氨基酸的保守性替换是本领域已知的。在一个实施方式中，本公开的AAV衣壳蛋白在以下同一组中的氨基酸可进行保守性替换：a)甘氨酸和丙氨酸；b)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；c)天冬氨酸和谷氨酸；d)天冬酰胺和谷氨酰胺；e)丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸；f)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；g)蛋氨酸和半胱氨酸。在一些实施方式中，上述不同组的氨基酸之间的非保守性替换也是允许的。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体可以装载异源多核苷酸用于将基因递送到靶细胞中。因此，本公开的AAV载体可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。

在一个实施方式中，由AAV载体递送的异源多核苷酸编码充当报告子的多肽(即报告蛋白)。报告蛋白用于指示被AAV成功感染的细胞。这些报告蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的异源多核苷酸编码用于治疗用途的天然蛋白质，所述天然蛋白质经密码子优化或未经密码子优化。此类天然蛋白质包括但不限于：可用于治疗各种肌肉疾病的蛋白，例如，囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(包括一些截短的形式，称为微型肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白)、微型凝集素、整联蛋白-β1、层粘连蛋白-β2、肌聚糖-α、肌聚糖-β、肌节蛋白、突触核蛋白、促性腺激素、微型促卵磷脂、Lamin A/C、四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)、卵泡抑素、SOD1、SOD2、全长或显性负性肌生长抑制素；血管生成因子(例如VEGF，血管生成素1或2)和血管生成抑制剂(例如内皮抑素和血管抑制素)；抗炎多肽(例如，抗炎白细胞介素4、10、11和13，全长和显性突变体Ikappa B、Pinch和ILK基因)；凝血因子(例如凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X)；血影蛋白、酪氨酸羟化酶、芳香族L-氨基酸脱羧酶、瘦素和瘦素受体；神经营养因子(例如BDNF、GDNF、NGF、信号素、SLIT1、SLIT2、SLIT3、FGF7、FGF10和FGF22)以及相应的神经营养蛋白受体；LDL受体、脂蛋白脂肪酶、肾上腺素能受体-α和β、B-球蛋白、C-球蛋白；胰岛素样生长因子，例如IGF-1和IGF-2；腺苷脱氨酶和骨形态发生蛋白超家族(例如BMP1、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、TGF-β、RANKL)；以及，与维持视力、视网膜层结构、视网膜细胞(例如感光细胞和视网膜色素上皮)功能有关的分子，例如RPE65、RPGR、Bestrophin-1、CNGA3、CNGB3、Retinoschisin、ABCA4和视网膜特异性ABC转运蛋白。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的异源多核苷酸编码合成多肽，包括但不限于，Aflibercept、各种重组白介素(例如白介素-1和白介素-18)、TNF-α拮抗可溶性受体、激活素II型可溶性受体、抗VEGF抗体、抗硬化蛋白抗体、抗RANKL抗体、抗C5抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CGRP抗体、抗HER2抗体、抗EGFR抗体、针对促炎细胞因子的抗体及其受体。

在一个实施方式中，由AAV载体递送的异源多核苷酸可由RNAi组分(例如，siRNA、shRNA、snRNA、microRNA、核酶、反义寡核苷酸和反义多核苷酸)组成，它们可以敲低以异常方式激活的任何内源基因或侵入宿主细胞的异源基因，例如，本领域已知的病毒或细菌的多核苷酸。RNAi组分通常与其靶基因在序列上具有60-100％的同一性，并导致相应的蛋白质产物减少至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)。

在一个实施方式中，由AAV载体递送的异源多核苷酸包含调节序列，例如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)或2A信号(例如，P2A、T2A、F2A)、启动子和增强子(例如CMV启动子或具有脊椎动物β-肌动蛋白、β-球蛋白或β-球蛋白调节元件的其他杂CMV启动子、EF1启动子、泛素启动子、T7启动子、SV40启动子、VP16或VP64启动子)。启动子和增强子的使用取决于它们的组织特异性表达谱。启动子/增强子也可以被化学药品或激素(如强力霉素或他莫昔芬)诱导，具体取决于在所需时间点触发基因表达的需要。此外，启动子/增强子可以是天然序列或合成序列，即原核或真核序列。

在一个实施方式中，用于基因表达的诱导型调控元件可以是组织特异性或组织嗜性启动子/增强子元件，包括但不限于：骨骼肌特异性启动子，例如MCK、HSA、肌生成素启动子；以及对各种类型的眼细胞具有特异性的启动子，例如神经节细胞特异性启动子(例如Tuj1启动子)、星形胶质细胞和Müller细胞特异性启动子(例如GFAP启动子)和视网膜色素上皮特异性启动子(例如RPE65启动子)。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体包含AAV衣壳蛋白和病毒基因组，病毒基因组可以是天然的AAV基因组或者是用于治疗目的的异源多核苷酸的重组载体。在一个实施方式中，异源多核苷酸编码哺乳动物蛋白或RNAi组分(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)。在一个实施方式中，异源多核苷酸编码某些抗体、抗原、合成蛋白质或多肽的氨基酸序列。

在一个实施方式中，病毒基因组的翻译产物会增强、抑制、削弱、保护、触发或预防哺乳动物中参与代谢调节和健康维持的一种或多种内源信号通路。

在一个实施方式中，可以将本公开的AAV病毒颗粒在体外施用给宿主细胞，然后将细胞植入受试者中。由此，包装在病毒中的异源核酸通过细胞被引入受试者体内进行转录和/或翻译，产生从细胞分泌到受试者体内或调节宿主细胞生物活性的蛋白质或RNA产物，从而起到治疗作用。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体被制成药物制剂(例如，注射剂、片剂、胶囊剂、散剂、滴眼剂)施用于人或其他哺乳动物。该药物制剂还包含其他成分，例如药物辅料、水溶性或有机溶剂(例如水、甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、苯酚或聚乙二醇)、盐(例如氯化钠、氯化钾、磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl和Tris-乙酸盐)、延缓溶解试剂(例如石蜡)、表面活性剂、抗微生物剂、脂质体、脂质复合物、免疫抑制剂(例如可的松、泼尼松、环孢霉素)、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚)微球、硬质基质、半固体载体、纳米球或纳米颗粒。药物制剂中AAV颗粒的滴度可以为10⁵-10¹⁴vg/mL。此外，可以通过吸入、全身或局部(例如，静脉内、皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、脉络膜上、肠胃外、肌内、脑室内、口服、腹膜内和鞘内)给药方式以单剂量或多剂量递送AAV。

在一个实施方式中，本公开提供了一种药物，其包含本公开的AAV载体和可使AAV载体成药的试剂(例如，盐、有机物和表面活性剂)。药物可用于体外转导细胞或体内转导哺乳动物(例如啮齿动物、灵长类动物和人类)，从而治疗各种疾病，例如眼部疾病和肌肉疾病。

在本文中，眼部疾病选自：视网膜的遗传性营养不良、青光眼、青光眼神经病变、年龄相关性黄斑变性、屈光不正、干眼症、眼部炎症的遗传性营养不良、眼部炎症、葡萄膜炎、眼眶炎症、白内障、过敏性结膜炎、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、角膜水肿、圆锥角膜、增生性玻璃体视网膜病变(纤维化)、视网膜周围纤维化、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、玻璃体视网膜病变、玻璃体黄斑牵引和玻璃体出血。在一个实施方式中，眼部疾病涉及眼睛和/或视觉功能的退化。

在一个实施方式中，治疗眼部疾病是指改善接受治疗的患者的视敏度、对比度视力、色觉以及视野。

在本文中，肌肉疾病可以是由于肌肉功能下降、肌肉消耗或肌肉退化而引起的肌肉疾病，可以选自：Duchenne肌营养不良(DMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良(EDMD)、肢带肌营养不良(LGMD)、重症肌无力、先天性肌无力综合症、肌少症、恶病质、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、I型和II型肌强直性营养不良。

在一个实施方式中，治疗肌肉疾病是指抑制或延迟肌肉疾病的发生、增进肌肉量、改善肌肉强度或改善肌肉功能。

在一个实施方式中，本公开涉及由细胞生产AAV载体的方法。所述细胞支持高效转染编码AAV Rep/Cap蛋白的质粒、辅助基因和编码天然病毒基因组或异源蛋白的重组载体。可以采用本领域技术人员熟知的三质粒转染法，由HEK293细胞生产本公开的AAV载体。例如，通过将编码GFP等重组蛋白的顺向质粒、AAV Rep/Cap质粒、pHelper质粒共转染至HEK293细胞中，来生产本公开的AAV载体。

可以采用本领域技术人员熟知的标准方法来生产多肽、抗体或抗原结合片段；改变核酸序列；生产转化细胞；构建重组AAV载体；改造衣壳蛋白；包装表达AAV Rep和Cap序列的载体；瞬时转染和稳定转染包装细胞。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1：改造和筛选AAV

如图1A所示：首先，将改造的AAV库和辅助质粒转染至HEK293细胞中。接着，将包含AAV的HEK293细胞裂解物和Ad5(腺病毒5型)一起加入到培养的C2C12成肌细胞中。富集细胞裂解物并重复感染C2C12细胞4-5次。通过对C2C12细胞裂解物进行PCR来富集候选AAV衣壳的病毒基因组带并进行测序。通过筛选，挑选出富集度高的血清型序列，得到血清型突变体AAVz3(图1B)。

AAVz3颗粒通过AAVX(Thermo Scientific)亲和层析加碘克沙醇超速离心的方法进行纯化，并浓缩至200-500μl，用于下一步实验以确定载体的实心率和组织靶向性。

实施例2：AAVz3的产量和实心率

用亲和层析加碘克沙醇超速离心的方法纯化5×10⁷个细胞中生产的AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)病毒颗粒。然后，将病毒颗粒稀释10000倍，用DNase I在37℃消化1小时，在100℃放置10分钟灭活DNase I。通过qPCR和银染实验对病毒产量进行定量。接着，用已知滴度的AAV8病毒标准品以10倍梯度稀释的6个滴度梯度(1x10¹⁰、1x10⁹、1x10⁸、1x10⁷、1x10⁶、1x10⁵ vg/ml)作为标准品，计算qPCR定量结果与银染定量结果的比值，得到AAV的实心率。如图1C所示，qPCR定量的由HEK293细胞产生的实心AAVz3病毒基因组数目与野生型AAV5、8、9相当，这表明寡肽的插入对病毒的生产没有负面影响。此外，图1C显示，AAVz3病毒颗粒的实心率显著高于野生型AAV5、8、9。

实施例3：突变体AAVz3的C2C12转导特异性

为了研究转导特异性，用携带GFP基因的AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)感染细胞，感染复数(MOI)为1×10⁵vg/细胞。AAV处理72h后获取图片。

如图2A所示，野生型AAV8或AAV9在C2C12成肌细胞(肌细胞祖细胞)、C28/I2(人软骨细胞系)细胞和Huh7(肝细胞谱系中的人肝癌细胞系)细胞中表现出明显的转导，且野生型AAV5几乎对所有细胞均不感染。与此相对，AAVz3在C2C12成肌细胞中显示出稳定高效的GFP表达，并且仅较少地转导了C28/I2、Huh7和HEK293细胞。

此外，通过计算GFP阳性C2C12细胞与GFP阳性C28/I2、Huh7和HEK293细胞的比值，进一步量化了突变体AAVz3对C2C12的感染特异性。结果显示，AAVz3的C2C12转导特异性比AAV5、8和9高3-4倍(图2B至图2D)。

实施例4：突变体AAVz3的肌肉靶向性

向C57BL/6小鼠通过尾静脉注射1×10¹³vg/kg的携带GFP基因的AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)病毒颗粒。病毒静脉注射4周后，分离出肝、心脏、肺、脾进行免疫染色(图3A)。向C57BL/6小鼠的后肢肌肉注射携带GFP基因的AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)病毒(5×10¹⁰vg/鼠)。病毒注射4周后，分离出腓肠肌(GA)、胫前肌(TA)和比目鱼肌(SO)进行免疫染色(图3B)。

此外，通过计算GFP阳性肌肉细胞(GA、TA和SO的平均值)与GFP阳性肝细胞、心细胞、肺细胞和脾细胞的比值，进一步量化了突变体AAVz3对肌肉细胞的特异性。结果显示，在AAVz3组中，肌肉相对于肝、肺，心脏和脾脏的转导特异性明显高于野生型AAV(AAV5、8、9)组(图3C至图3F，***p<0.001)。

上述结果证明了AAVz3具有优于AAV5、8、9的优异的肌肉靶向特异性。

实施例5：突变体AAVz3的视网膜靶向性

以3×10⁹vg/眼的剂量向C57BL/6小鼠的玻璃体内注射携带GFP的AAV颗粒(野生型AAV和AAVz3)。注射3周后获取GFP信号的图片(图4A)。小鼠的视网膜用AAV(AAVz3、AAV5、AAV8和AAV9)感染后，进行GFP、DAPI和视锥细胞标记物S-视蛋白染色。

结果显示，尽管采用玻璃体内给药，但AAVz3仍能够扩散到视网膜中的感光层，而AAV5、8、9则几乎没有(图4B)。此外，如图4C所示，AAVz3的视网膜GFP荧光水平约为AAV5、8、9的4倍(图4C，***p<0.001，n＝4)，表明AAVz3相比野生型AAV5、8、9有更好的视网膜靶向性。

以上实验结果表明，与野生型AAV5、AAV8和AAV9相比，在AAV5衣壳蛋白的Q574后插入了合成寡肽“PGVTPAP”的本公开的AAVz3载体的实心率显著升高，并且在小鼠的视网膜和肌肉的转导得到改善。本公开的AAVz3载体在其他组织(比如心、肺、脾)中的转导效率明显低于野生型AAV(AAV5、AAV8和AAV9)，表明本公开的AAVz3载体具有更好的肌肉和视网膜组织靶向性。因此，与野生型AAV5、8、9相比，当本公开的AAVz3在临床上用作治疗载体时，脱靶组织的感染率和潜在不良反应的发生率均降低。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

序列表

<110> 上海信致医药科技有限公司

<120> 眼部和肌肉特异靶向型腺相关病毒载体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 731

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVz3衣壳蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu

1 5 10 15

Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly

35 40 45

Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val

50 55 60

Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp

85 90 95

Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn

100 105 110

Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe

115 120 125

Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile

130 135 140

Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser

145 150 155 160

Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln

165 170 175

Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr

180 185 190

Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala

195 200 205

Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp

210 215 220

Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro

225 230 235 240

Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp

245 250 255

Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

260 265 270

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val

290 295 300

Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr

305 310 315 320

Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp

325 330 335

Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys

340 345 350

Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr

355 360 365

Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser

370 375 380

Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn

385 390 395 400

Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser

405 410 415

Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp

420 425 430

Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln

435 440 445

Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp

450 455 460

Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly

465 470 475 480

Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu

485 490 495

Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr

500 505 510

Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile

515 520 525

Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu

530 535 540

Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg

545 550 555 560

Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Pro Gly

565 570 575

Val Thr Pro Ala Pro Ser Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr

580 585 590

Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val

595 600 605

Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His

610 615 620

Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro

625 630 635 640

Pro Met Met Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser

645 650 655

Phe Ser Asp Val Pro Val Ser Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly

660 665 670

Gln Val Thr Val Glu Met Glu Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys

675 680 685

Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln

690 695 700

Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg

705 710 715 720

Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730

<210> 2

<211> 2196

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码AAVz3衣壳蛋白的核酸序列

<400> 2

atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60

tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120

gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180

ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240

cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300

gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360

aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420

ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480

aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540

ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600

ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660

gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720

agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780

aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840

cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900

tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960

accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020

ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080

tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140

gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200

aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260

cagaacctct tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320

acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380

tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440

gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500

agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560

tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620

acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680

gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agcctggagt gacaccggca 1740

ccaagctcca ccactgcccc cgcgaccggc acgtacaacc tccaggaaat cgtgcccggc 1800

agcgtgtgga tggagaggga cgtgtacctc caaggaccca tctgggccaa gatcccagag 1860

acgggggcgc actttcaccc ctctccggcc atgggcggat tcggactcaa acacccaccg 1920

cccatgatgc tcatcaagaa cacgcctgtg cccggaaata tcaccagctt ctcggacgtg 1980

cccgtcagca gcttcatcac ccagtacagc accgggcagg tcaccgtgga gatggagtgg 2040

gagctcaaga aggaaaactc caagaggtgg aacccagaga tccagtacac aaacaactac 2100

aacgaccccc agtttgtgga ctttgccccg gacagcaccg gggaatacag aaccaccaga 2160

cctatcggaa cccgatacct tacccgaccc ctttaa 2196

Claims

1.新型AAV衣壳蛋白，其中，所述新型AAV衣壳蛋白通过在AAV衣壳蛋白的可变区插入寡肽PGVTPAP构建而成。

2.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白包括天然AAV衣壳蛋白和其他人工改造的AAV衣壳蛋白。

3.根据权利要求2所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述天然AAV选自天然的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10，优选为天然的AAV5；所述其他人工改造的AAV选自人工改造的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10，优选为人工改造的AAV5。

4.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述可变区选自VRII、VRIII、VRIV、VRV、VRVI、VRVII和VRVIII，优选VRVIII。

5.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述寡肽PGVTPAP插入至AAV衣壳蛋白的N573或Q574之后，优选插入至AAV衣壳蛋白的Q574之后，更优选插入至AAV5衣壳蛋白的Q574之后。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性，优选所述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述新型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，优选所述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

8.核酸分子，其中，所述核酸分子编码权利要求1至7中任一项所述的新型AAV衣壳蛋白。

9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，优选所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

10.根据权利要求8或9所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，优选所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

11.新型AAV载体，其中，所述新型AAV载体包含权利要求1至7中任一项所述的新型AAV衣壳蛋白。

12.根据权利要求11所述的新型AAV载体，其中，所述新型AAV载体还包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的核苷酸序列。

13.权利要求11或12所述的新型AAV载体在制备用于治疗眼部疾病或肌肉疾病的药物中的应用。

14.药物，其包含权利要求11或12所述的新型AAV载体和可使病毒载体成药的试剂，所述药物用于治疗眼部疾病或肌肉疾病。

15.根据权利要求14所述的药物，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用，优选局部施用于眼睛，特别是作为滴眼剂施用、眼内注射或玻璃体内注射到眼睛中。

16.根据权利要求14或15所述的药物，其中，可使病毒载体成药的试剂包括盐、有机物和表面活性剂。