CN113100063A - 一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,包括以下步骤:S1、选择4龄优质开花花魔芋,在花药未散粉前取下雄花段,将雄花段在2~6℃下预处理1~2天,消毒处理得到消毒雄花段;S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:将消毒雄花段,在无菌条件下切割成小段,接种到愈伤组织诱导培养基中诱导培养,使雄花散粉,利用暗培养‑光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;S3、分化培养:在无菌条件下,将愈伤组织转入分化培养基中,采用白光‑红蓝光手段培养5个周期,即得到魔芋组培苗。本发明提供的培养方法保证了花粉的成活率,解决了花粉消毒难的问题,且提高愈伤组织的分化率,缩短了成苗的时间。
Description
技术领域
本发明属于农业栽培技术技术领域,具体涉及一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法。
背景技术
魔芋为天南星科多年生草本植物,内含大量可溶性膳食纤维葡甘聚糖,是人体第七大营养素,为联合国确定的十大保健食品,对降三高、减肥、通便等具有显著效果。魔芋种质资源丰富,全世界约有170种,我国有21种。然而人工栽培利用仍以为花魔芋为主,而且多为地方群体种,品种退化,品质下降、抗病性减弱。因此,加快魔芋抗病新品种的选育,成为当前魔芋产业发展中急需解决的问题。
然而,魔芋具高度杂合,遗传背景复杂,因而难以通过传统方法得到纯合自交系,导致魔芋育种受到极大限制;1990年,孔凡伦等人利用白魔芋未授粉子房离体培养获得单倍体植株,截止目前,国内外而对魔芋花粉、花药、胚珠等诱导单倍体的研究尚未见任何报道。由于花粉是单倍体细胞,诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体,且不受花药的药隔、药壁等体细胞的干扰。因此,利用花粉离体培养技术在魔芋单倍体育种中意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,包括以下步骤:
S1、魔芋雄花获得及消毒处理:
S11、选择4龄优质开花花魔芋,在花药未散粉前取下雄花段,将雄花段在2~6℃下预处理1~2天,得到预处理雄花段;
S12、将步骤S11得到的预处理雄花段进行消毒处理,消毒完成后,干燥,得到消毒雄花段;
S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:
将步骤S12得到的消毒雄花段,在无菌条件下切割成小段,将小段接种到愈伤组织诱导培养基中诱导培养3~5天,使雄花散粉,然后利用暗培养-光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;
S3、分化培养:
在无菌条件下,将步骤S2得到的愈伤组织转入分化培养基中,采用白光-红蓝光手段培养5个周期,即得到魔芋组培苗;
上述步骤S2中诱导培养、暗培养-光培养环节以及步骤S3分化培养环节均在密闭培养容器中进行。
优选的,愈伤组织诱导培养基包含MS基本培养基+NAA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L,蔗糖30g/L,琼脂4.5g/L;
优选的,分化培养基包含MS基本培养基+KT 0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L+IAA 0.5mg/L,蔗糖40g/L,琼脂6g/L。
优选的,步骤S2和步骤S3中,无菌条件相同,且具体为在超净工作台上进行。
优选的,步骤S2中,愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8;步骤S3中,分化培养基的pH值为5.8。
优选的,步骤S2中,诱导培养时采用普通光进行照射,光照强度为4000-5000Lx,光照时间为14~16h/d,温度为27~29℃。
优选的,步骤S2中,暗培养-光培养手段1个周期的具体实施步骤为:先在25~27℃下暗培养10~15天,接着在25~27℃下光培养10~15天。
进一步优选的,光培养时采用普通光进行照射,光照强度为1500~2000Lx,光照时间为10~12h/d。
优选的,步骤S3中,白光-红蓝光手段1个周期的具体实施步骤为:先在25~27℃,普通光照下培养5天,接着于25~27℃,红蓝光照下培养2天。
进一步优选的,普通光照培养时的光照强度为3500~4500Lx,光照时间为14~16h/d;红蓝光照培养时的红蓝光比例为2:1,光照强度为1000~1500Lx,光照时间为12~16h/d。
优选的,步骤S11中,雄花段通过消毒过的器具取下,且消毒过的器具通过75%的酒精对器具消毒得到。
优选的,步骤S12中,消毒处理过程的具体方法为:先将步骤S11得到的预处理雄花段水洗10~20min,接着用75%酒精浸泡30~50s,然后用次氯酸钠浸泡8~10min,最后用无菌水冲洗3~5次。
本发明与现有技术相比,其有益效果在于:
(1)本发明中由于花粉是单倍体细胞,诱导发育而成的植株都是单倍体,不受体细胞的干扰,因此,本发明提供的培养方法相比花药、未授粉的子房组织诱导单倍体的效果明显提高。
(2)本发明通过对整个雄花(花梗和花药)进行外植体消毒处理,并利用高、低温及强光照刺激,使雄花在密闭培养器皿中的培养基中散粉,不仅提高了花粉的成活率,而且解决了花粉作为外植体消毒难的问题。
(3)本发明提供的愈伤组织诱导培养基,具有“低糖、低琼脂”的特点,低蔗糖能够在不影响生长的情况下,可以减少污染的概率;低琼脂能够使培养基会处于半固体状态,有利于花粉半悬浮培养。
(4)本发明通过暗-光周期性交替培养,不仅有利于诱导花粉愈伤组织的形成,且降低了愈伤组织的褐化率。
(5)本发明通过周期性增加红蓝光的刺激,由于魔芋是半隐形植物,对光比较敏感,适当的刺激或胁迫能够在一定程度上激活光的信号通路,能够提高愈伤组织的分化率,促进不定芽的快速分化,从而缩短成苗的时间。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤S1中未散粉的魔芋雄花图;
图2为本发明实施例1步骤S2中雄花散粉的效果图;
图3为本发明实施例1步骤S2中愈伤组织形成的效果图;
图4为本发明实施例1步骤S3中不定芽分化的效果图;
图5为本发明实施例1步骤S3中培养得到的幼苗的图片;
图6为图5的仰视图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,具体包括以下步骤:
S1、魔芋雄花获得及消毒处理:
S11、选择4龄优质开花花魔芋,附属器发出“腐尸味”,在花药未散粉前,用75%的酒精对剪刀进行消毒处理,减下雄花段,将雄花段置于冰箱中在4℃下预处理1天,得到预处理雄花段;
S12、将步骤S11得到的预处理雄花段在自来水下冲洗15min,接着用75%酒精浸泡30s,然后用次氯酸钠浸泡8min,最后用无菌水冲洗3次,消毒完成后,用无菌滤纸吸干,得到消毒雄花段;
S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:
在超净工作台上,将步骤S12得到的消毒雄花段,切割成高度为2cm的小段,将小段接种到盛放有愈伤组织诱导培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,接着进行诱导培养4天,使雄花散粉,然后利用暗培养-光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;
愈伤组织诱导培养基包含MS基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L,蔗糖30g/L,琼脂4.5g/L;愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8;
诱导培养时采用普通光进行照射,光照强度为4000Lx,光照时间为16h/d,温度为28℃。
暗培养-光培养手段1个周期的具体实施步骤为:先在26℃下暗培养10天,接着在26℃下光培养10天,光培养时采用普通光进行照射,光照强度为2000Lx,光照时间为10h/d。
S3、分化培养:
在超净工作台上,将步骤S2得到的愈伤组织转入盛有分化培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,采用白光-红蓝光手段交替刺激培养5个周期,加速愈伤组织的分化,促进不定芽快速分化,即得到魔芋组培苗;
分化培养基包含MS基本培养基+KT 0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L+IAA0.5mg/L,蔗糖40g/L,琼脂6g/L;分化培养基的pH值为5.8。
白光-红蓝光手段1个周期的具体实施步骤为:先在26℃,普通光照下培养5天,普通光照培养时的光照强度为4000Lx,光照时间为14h/d;接着于26℃,红蓝光照下培养2天,红蓝光照培养时的红蓝光比例为2:1,光照强度为1500Lx,光照时间为12h/d。
实施例2
一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,具体包括以下步骤:
S1、魔芋雄花获得及消毒处理:
S11、选择4龄优质开花花魔芋,附属器发出“腐尸味”,在花药未散粉前,用75%的酒精对剪刀进行消毒处理,减下雄花段,将雄花段置于冰箱中在2℃下预处理2天,得到预处理雄花段;
S12、将步骤S11得到的预处理雄花段在自来水下冲洗10min,接着用75%酒精浸泡50s,然后用次氯酸钠浸泡10min,最后用无菌水冲洗5次,消毒完成后,用无菌滤纸吸干,得到消毒雄花段;
S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:
在超净工作台上,将步骤S12得到的消毒雄花段,切割成高度为2cm的小段,将小段接种到盛放有愈伤组织诱导培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,接着进行诱导培养3天,使雄花散粉,然后利用暗培养-光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;
愈伤组织诱导培养基包含MS基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L,蔗糖30g/L,琼脂4.5g/L;愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8;
诱导培养时采用普通光进行照射,光照强度为5000Lx,光照时间为14h/d,温度为27℃。
暗培养-光培养手段1个周期的具体实施步骤为:先在25℃下暗培养10天,接着在25℃下光培养15天,光培养时采用普通光进行照射,光照强度为1500Lx,光照时间为12h/d。
S3、分化培养:
在超净工作台上,将步骤S2得到的愈伤组织转入盛有分化培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,采用白光-红蓝光手段交替刺激培养5个周期,加速愈伤组织的分化,促进不定芽快速分化,即得到魔芋组培苗;
分化培养基包含MS基本培养基+KT 0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L+IAA0.5mg/L,蔗糖40g/L,琼脂6g/L;分化培养基的pH值为5.8。
白光-红蓝光手段1个周期的具体实施步骤为:先在27℃,普通光照下培养5天,普通光照培养时的光照强度为3500Lx,光照时间为16h/d;接着于27℃,红蓝光照下培养2天,红蓝光照培养时的红蓝光比例为2:1,光照强度为1000Lx,光照时间为16h/d。
实施例3
一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法法,具体包括以下步骤:
S1、魔芋雄花获得及消毒处理:
S11、选择4龄优质开花花魔芋,附属器发出“腐尸味”,在花药未散粉前,用75%的酒精对剪刀进行消毒处理,减下雄花段,将雄花段置于冰箱中在6℃下预处理2天,得到预处理雄花段;
S12、将步骤S11得到的预处理雄花段在自来水下冲洗20min,接着用75%酒精浸泡40s,然后用次氯酸钠浸泡10min,最后用无菌水冲洗3次,消毒完成后,用无菌滤纸吸干,得到消毒雄花段;
S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:
在超净工作台上,将步骤S12得到的消毒雄花段,切割成高度为2cm的小段,将小段接种到盛放有愈伤组织诱导培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,接着进行诱导培养4天,使雄花散粉,然后利用暗培养-光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;
愈伤组织诱导培养基包含MS基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L,蔗糖30g/L,琼脂4.5g/L;愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8;
诱导培养时采用普通光进行照射,光照强度为4500Lx,光照时间为15h/d,温度为29℃。
暗培养-光培养手段1个周期的具体实施步骤为:先在27℃下暗培养12天,接着在27℃下光培养12天,光培养时采用普通光进行照射,光照强度为1800Lx,光照时间为12h/d。
S3、分化培养:
在超净工作台上,将步骤S2得到的愈伤组织转入盛有分化培养基的培养瓶中,盖紧瓶塞,采用白光-红蓝光手段交替刺激培养5个周期,加速愈伤组织的分化,促进不定芽快速分化,即得到魔芋组培苗;
分化培养基包含MS基本培养基+KT 0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L+IAA0.5mg/L,蔗糖40g/L,琼脂6g/L;分化培养基的pH值为5.8。
白光-红蓝光手段1个周期的具体实施步骤为:先在25℃,普通光照下培养5天,普通光照培养时的光照强度为4500Lx,光照时间为15h/d;接着于25℃,红蓝光照下培养2天,红蓝光照培养时的红蓝光比例为2:1,光照强度为1200Lx,光照时间为14h/d。
综上所述,本发明实施例提供的本发明提供的培养方法保证了花粉的成活率,解决了花粉消毒难的问题,且提高愈伤组织的分化率,促进了不定芽的快速分化,缩短了成苗的时间,建立了一套魔芋花粉离体培养体系,为开展魔芋单倍体育种提供技术支撑。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、魔芋雄花获得及消毒处理:
S11、选择4龄优质开花花魔芋,在花药未散粉前取下雄花段,将雄花段在2~6℃下预处理1~2天,得到预处理雄花段;
S12、将步骤S11得到的预处理雄花段进行消毒处理,消毒完成后,干燥,得到消毒雄花段;
S2、催粉和花粉愈伤组织诱导:
将步骤S12得到的消毒雄花段,在无菌条件下切割成小段,将小段接种到愈伤组织诱导培养基中诱导培养3~5天,使雄花散粉,然后利用暗培养-光培养手段培养2个周期,得到愈伤组织;
S3、分化培养:
在无菌条件下,将步骤S2得到的愈伤组织转入分化培养基中,采用白光-红蓝光手段培养5个周期,使得愈伤组织分化产生不定芽,不定芽分化、生长,即得到魔芋组培苗;
上述步骤S2中诱导培养、暗培养-光培养环节以及步骤S3分化培养环节均在密闭培养容器中进行。
2.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S2中,所述愈伤组织诱导培养基包含MS基本培养基+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L,蔗糖30g/L,琼脂4.5g/L。
3.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S2中,所述分化培养基包含MS基本培养基+KT 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IAA 0.5mg/L,蔗糖40g/L,琼脂6g/L。
4.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S2中,所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8;步骤S3中,所述分化培养基的pH值为5.8。
5.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S2中,所述诱导培养时采用普通光进行照射,光照强度为4000~5000Lx,光照时间为14~16h/d,温度为27~29℃。
6.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S2中,所述暗培养-光培养手段1个周期的具体实施步骤为:先在25~27℃下暗培养10~15天,接着在25~27℃下光培养10~15天。
7.根据权利要求6所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,所述光培养时采用普通光进行照射,光照强度为1500~2000Lx,光照时间为10~12h/d。
8.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S3中,所述白光-红蓝光手段1个周期的具体实施步骤为:先在25~27℃,普通光照下培养5天,接着于25~27℃,红蓝光照下培养2天。
9.根据权利要求8所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,所述普通光照培养时的光照强度为3500~4500Lx,光照时间为14~16h/d;所述红蓝光照培养时的红蓝光比例为2:1,光照强度为1000~1500Lx,光照时间为12~16h/d。
10.根据权利要求1所述的利用魔芋花粉离体培养获得单倍体植株的方法,其特征在于,步骤S12中,所述消毒处理过程的具体方法为:先将步骤S11得到的预处理雄花段水洗10~20min,接着用75%酒精浸泡30~50s,然后用次氯酸钠浸泡8~10min,最后用无菌水冲洗3~5次。
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