CN113092602A - 红花如意丸指纹图谱质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红花如意丸指纹图谱质量检测方法，取红花如意丸粉末的无水乙醇溶液，加热回流，冷却，取续滤液；梯度洗脱流动相；高效液相色谱分析不同批次的红花如意丸药物，得各批次药物色谱图，经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》处理分析，得共有特征对照图谱峰图，根据分离度和样品的重现性从中选取共有峰中的15个峰；获取待检测样品的指纹图谱，用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件比较两种共有特征对照图谱峰图，15个共有峰计算得到的相似度不小于0.8。该质量检测方法能从色谱的整体面貌上把握红花如意丸的质量情况，可作为红花如意丸质量控制的指标，对今后标准化生产提供可利用的质量控制模式。

Description

红花如意丸指纹图谱质量检测方法

技术领域

本发明属于中药制剂检测技术领域，涉及一种中药制剂的指纹图谱构建方法，具体涉及一种治疗妇女血症、风症、阴道炎、宫颈糜烂、心烦血虚、月经不调、痛经、下肢关节疼痛、筋骨肿胀、晨僵、麻木、小腹冷痛及寒湿痹证的藏药红花如意丸药粉、药丸或提取物的指纹图谱质量检测方法。

背景技术

红花如意丸是采用中国青藏高原特有的天然药物精制而成的藏成药，主要功能为祛风镇痛、调经血、祛斑。用于妇女血症、风症、阴道炎、宫颈糜烂、心烦血虚、月经不调、痛经、下肢关节疼痛、筋骨肿胀、晨僵、麻木、小腹冷痛及寒湿痹证，其卓越的功效，是中国特有的精品藏药之一。

目前，红花如意丸的质量控制指标除了测定胡椒的含量外，还对藏木香、熊胆粉进行了薄层鉴别，这样虽能控制红花如意丸的质量，但无法整体掌控质量状况及批间一致性。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的红花如意丸指纹图谱质量检测方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种红花如意丸指纹图谱质量检测方法，具体为：

1）供试品溶液的制备：取本品，研细，精密称定（3g），置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60分钟，自然冷却至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

所用红花如意丸可以是组方制备的各种丸剂，也可以是按照组方制备的提取物或用原料直接制备的中药细粉或者按照组方制备各种口服临床剂型，如片剂、胶囊、颗粒、缓释制剂等。

2）梯度洗脱流动相：以十八烷基键合硅胶为填充剂；用C-18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：A相为0.2%磷酸溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0→30min，流速1.00 mL/min，A相90%→70%，B相10%→30%；30→50min，流速1.00 mL/min，A相70%→60%，B相30%→40%；50→70min，流速1.00 mL/min，A相60%→35%，B相40%→65%；70→90min，流速1.00 mL/min，A相35%→20%，B相65%→80%；90→100min，流速1.00 mL/min，A相20%→10%，B相80%→90%；100→120min，流速1.00 mL/min，A相90%，B相10%；

检测波长206nm，柱温25℃，进样量10μL；理论塔板数按胡椒碱峰计，应不低于2500；

3）建立标准药物图谱

选取21批不同批次的红花如意丸药物，根据步骤1）和步骤2）进行高效液相色谱分析，获得每个批次药物的色图谱，如图1，该色谱图经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版本）处理分析，得高效液相色谱指纹图谱的共有特征对照图谱峰图，如图2，根据分离度和样品的重现性从该特征对照图谱峰图中选取共有峰中的15个峰，作为特征峰；该15个特征峰的峰面积总和占总的峰面积的80%以上；

其中，9号峰：保留时间62.060min，为胡椒碱峰；

4）指纹图谱的质量控制

根据步骤1）和步骤2）获取待检测样品的指纹图谱，采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件（国家药典委员会）将待检测样品的共有特征对照图谱峰图与步骤3）中得到的特征对照图谱峰图进行比较，以15个共有峰计算得到的相似度不小于0.9。

本发明质量检测方法采用样品处理方法和色谱条件，利用二极管阵列检测器的多波长同时检测能力建立红花如意丸药物（药粉、药丸或药物提取物）的指纹图谱，用作红花如意丸药物质量检测，能从色谱的整体面貌上把握红花如意丸的质量情况，可作为红花如意丸质量控制的指标。使红花如意丸的质量控制技术更加完善、科学，并对今后的标准化生产提供了可利用的质量控制模式。该检测方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

附图说明

图1是本发明检测方法中对21批红花如意丸进样高效液相色谱仪分析，获得的色谱图。

图2是对图1所示色谱图用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版本）处理分析，获得的红花如意丸高效液相色谱指纹图谱的共有特征对照图谱峰图。

图3是标准品胡椒碱所配制的标准品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

成品、试剂和设备的准备：

成品：红花如意丸 来源：甘南佛阁藏药有限公司、甘肃奇正藏药有限公司

试剂：乙腈（色谱纯） 来源：赛默飞世尔科技有限公司

水：屈臣氏蒸馏水，来源：广州屈臣氏食品饮料有限公司

磷酸（分析纯） 来源： 天津市科密欧化学试剂有限公司

仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，二极管阵列（PDA）检测器，EMPOWER 2操作系统。

）制备供试品溶液：

取本品，研细，精密称定（3g）置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60分钟，自然冷却至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

2）红花如意丸指纹图谱的建立方法：

2.1色谱条件

高效液相色谱仪Waters2695/2998，C-18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm。流动相：A：0.2%磷酸水溶液；B：乙腈，梯度洗脱。进样量10μl，检测波长206 nm；柱温25℃。梯度洗脱如下：

2.3 方法学考察

2.3.1 检测波长的选择

红花如意丸收载于国家药品标准WS-11268(ZD-1268)-2002-2012Z,，其含量测定成份选取了胡椒碱，这一种成份是红花如意丸中胡椒药材的有效成分，《中国药典》在该药材和红花如意丸含量测定项下均选用胡椒碱作为指标成份，检测波长为343nm。但因红花如意丸成分复杂，通过206nm、265nm、290nm、343nm不同波长下检测结果显示：在206nm的波长下，能够检测的色谱峰最多、色谱峰响应值较高、基线较平稳、胡椒碱成分也相对稳定、重现性高，故在做高效液相色谱指纹图谱时选取206nm波长为检测波长。

2.3.2 流动相及柱温的确定

实验表明，使用空调控制室温，在22～26℃的室温条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的相对保留时间、相对峰面积数据的RSD均小于5.0%，色谱柱在25℃条件下的测试结果是可靠的，故选取25℃作为柱温控制值。经采用不同的流动相梯度洗脱，本发明检测方法中所提供的梯度是最佳方案，可使物质得到较好的分离，满足测试的需要。

2.3.3 稳定性考察：

取供试品溶液测试品分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h这七个时间点进行测试，考察色谱峰保留时间与峰面积的一致性，以胡椒碱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，供试品中共有峰相对保留时间的RSD＜0 .6％，相对峰面积的RSD＜3.5％，说明供试品在24小时内基本稳定。

2.3.4 重复性实验

取红花如意丸（批号2009059），平行称取6份，按实施例1中的供试品制备方法制备6份供试品溶液，分别进样。以胡椒碱峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算RSD值，结果显示各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于5.0%，说明该方法重复性良好。

2.4 高效液相色谱图中选作特征指纹峰的保留时间及编号

2.4.1 按照色谱条件和供试品制备方法，对21批红花如意丸进行高效液相色谱仪分析，对所获得的如图1所示的色谱图经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版本）处理分析，获得图2所示的红花如意丸高效液相色谱指纹图谱的共有特征对照图谱峰图，根据分离度、样品的重现性选取选取15个特征峰，该15个特征峰的保留时间见表1，从表1可以看出：9号峰的保留时间为62.060min。

表1红花如意丸对照图谱编号、保留时间

图2中的9号峰为胡椒碱峰；而标准品胡椒碱所配制的标准品溶液色谱图，见图3。

图2是红花如意丸供试品形成的共有峰，属于红花如意丸样品色谱图。而图3是标准品胡椒碱所配制的标准品溶液色谱图，只代表本次配制的标准溶液，与红花如意丸样品峰没有直接关系；标准溶液中9号峰的高度，直接取决于标准品的称样量。

2.4.2对21批红花如意丸高效液相色谱指纹图谱相似度评价，结果发现相似度均大于0.9，说明不同批次间的相似度较高，具体结果见表2。

表2 21批红花如意丸高效液相色谱指纹图谱相似度

。

Claims (3)

1.一种红花如意丸指纹图谱质量检测方法，其特征在于，该检测方法具体为：

1）取红花如意丸，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流60分钟，自然冷却至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

2）梯度洗脱流动相：以十八烷基键合硅胶为填充剂；用C-18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：以0.2%磷酸水溶液为A相，乙腈为B相组成流动相，采用梯度洗脱方式，其洗脱时间及流动相比例为：0～30min，A相90%→70%，B相10%→30%；30～50min，A相70%→60%，B相30%→40%；50～70min，A相60%→35%，B相40%→65%；70～90min，A相35%→20%，B相65%→80%；90～100min，A相20%→10%，B相80%→90%；100～120min，A相90%，B相10%，检测波长为206nm，流速1mL/min，柱温20～40℃，进样量10μL ；

检测波长206nm，柱温25℃，进样量10μL；理论塔板数按胡椒碱峰计，不低于2500；

3）建立标准药物图谱

选取21批不同批次的红花如意丸药物，根据步骤1）和步骤2）进行高效液相色谱分析，获得每个批次药物的色谱图，该色谱图经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》处理分析，得高效液相色谱指纹图谱的共有特征对照图谱峰图，根据分离度和样品的重现性从该特征对照图谱峰图中选取共有峰中的15个峰，作为特征峰；该15个特征峰的峰面积总和占总的峰面积的80%以上；

4）指纹图谱的质量控制

根据步骤1）和步骤2）获取待检测样品的指纹图谱，采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件将待检测样品的共有特征对照图谱峰图与步骤3）中得到的特征对照图谱峰图进行比较，以15个共有峰计算得到的相似度不小于0.9。

2.根据权利要求1所述的红花如意丸指纹图谱质量检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，所用红花如意丸粉末是按照组方制备的各种丸剂、按照组方制备的提取物、用原料直接制备的中药细粉或者按照组方制备各种口服临床剂型。

3.根据权利要求1所述的红花如意丸指纹图谱质量检测方法，其特征在于，所述步骤2）的15个特征峰中的9号峰：保留时间62.060min，为胡椒碱峰。

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