CN113088551A - 一种骨胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种骨胶原蛋白肽的制备方法。具体而言，本发明的骨胶原蛋白肽的制备方法，包括使用静态载体固定化酶和动态载体固定化酶对骨胶原蛋白原料进行酶解的工序，以及在所述酶解之后去除所述动态载体固定化酶的工序。本发明可以直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白作为原料，适用于工业级大规模和半连续化生产。本发明进一步涉及含有骨胶原蛋白肽的饮料。

Description

一种骨胶原蛋白肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种骨胶原蛋白肽的制备方法，进一步涉及含有骨胶原蛋白肽的饮料。

背景技术

骨胶原蛋白肽是骨胶原蛋白部分水解的产物。骨胶原蛋白肽具有例如抑制血管紧张素转化酶活性、抗氧化活性，具有除自由基，减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等功效。相比于作为原料的骨胶原蛋白而言，骨胶原蛋白肽由于分子量小，可被小肠绒毛上皮细胞直接吸收（“骨胶原蛋白肽确有保健功效”，陆琪，中国科学报，2013-03-30）。

酶解法是制备骨胶原蛋白肽的常见方法。传统的酶解法需要在反应结束后进行酶灭活的操作，以期提高最终产品的稳定性。采用固定化酶技术可以省去酶灭活的操作，不仅简化了工艺，还提高了酶的利用率，降低了生产成本。采用固定化酶技术进行胶原蛋白酶解时，需要使作为原料的骨胶原蛋白溶液在加压状态下通过负载酶的载体，例如固定有载体的反应罐、固定或加持载体的滤膜等，作为工业规模的生产则效率较低。并且骨胶原蛋白与固定的酶接触时间较短，无法保证其充分酶解，低分子量的多肽必须采用过滤装置（管式陶瓷膜或纳米级过滤膜）多次过滤才能制备得到，并不适用于大规模工业生产（CN107012191A、CN101768551A）。

骨胶原蛋白肽是以动物骨骼中的骨胶原蛋白作为原料。动物骨骼作为屠宰工业中的副产品，相对于动物皮等骨胶原蛋白来源而言，具有原料丰富、价格低廉的优点，并且能够实现工业副产品的再利用，减少环境污染和资源浪费。但是，作为原料的骨胶原蛋白在制备过程中不可避免地与骨粉混合在一起，并不能直接应用于现有技术中采用纳米级过滤膜的多级固定化酶设备来制备骨胶原蛋白肽。尽管可以对骨粉进行分离以得到骨胶原蛋白溶液，但增加了工序，从工业生产的角度而言是不期望的。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的在于，提供骨胶原蛋白的制备方法，该制备方法可以直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料来制备低分子量的骨胶原蛋白肽，并且适用于工业规模的连续化生产。

用于解决技术问题的方案

针对现有技术的不足，本发明人通过潜心研究，创造性地发现，通过联合使用静态载体固定化酶和动态载体固定化酶，能够在避免使用加压、纳米级过滤等设备的前提下，直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料制备得到低分子量的骨胶原蛋白肽。

本发明的骨胶原蛋白肽的制备方法具体包括以下构成。

本发明的骨胶原蛋白肽的制备方法，包括使用静态载体固定化酶和动态载体固定化酶对骨胶原蛋白原料进行酶解的工序，以及在所述酶解之后去除所述动态载体固定化酶的工序；

其中，所述静态载体相对于所述酶解的反应器不发生相对运动，并且多个所述静态载体之间形成所述骨胶原蛋白原料流动的通道，

所述动态载体相对于所述酶解的反应器发生相对运动。

作为本发明优选的方案，所述动态载体具有磁性。

作为本发明的另一种实施方式，所述骨胶原蛋白原料依次在所述静态载体固定化酶和所述动态载体固定化酶的存在下进行所述酶解。

作为本发明的一种实施方式，所述静态载体固定化酶和所述动态载体固定化酶所使用的酶选自胰蛋白酶、胶原蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中的一种或多种，优选胰蛋白酶和/或胶原蛋白酶。在一种进一步优选的情况下，所述静态载体固定化酶所使用的酶是胰蛋白酶，所述动态载体固定化酶所使用的酶是胶原蛋白酶。

作为本发明优选的方案，所述胰蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=7.6-8.2下反应4-10h，所述胶原蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=5.5-6.8下反应2-5.5h。

作为本发明一种实施方式，所述骨胶原蛋白原料是含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

作为本发明优选的方案，所述含有骨粉的骨胶原蛋白原料的制备方法包括以下步骤：

对动物骨骼进行脱脂处理和粉碎处理，得到骨骼粉末；

将所述骨骼粉末与水混合后，进行高温高压处理，得到所述含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

作为本发明优选的方案，还包括在所述酶解之后对酶解液进行过滤分离和/或浓缩的后处理工序。

作为本发明优选的方案，所述动物骨骼是牛骨和/或羊骨，优选牛骨。

本发明的另一个目的在于提供一种含有骨胶原蛋白肽的饮料，该饮料含有由本发明的骨胶原蛋白肽的制备方法制备得到的骨胶原蛋白肽。

发明的效果

本发明实现了动物骨骼的回收利用，在不需要加压和纳米级过滤等复杂工序或特殊设备的情况下，无需对胶原蛋白酶解产物进行分级分离，即可直接得到分子量集中分布于1000Da以下的骨胶原蛋白肽产物。原料可以直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料，不需要对原料施加去除骨粉的工序，也不需要对酶解产物施加酶的灭活工序，从而节约了生产成本。该制备方法适用于工业级大规模和半连续化生产，具有广阔的应用推广价值。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[骨胶原蛋白的酶解]

<基本流程>

骨胶原蛋白的酶解是指以骨胶原蛋白为原料，在蛋白水解酶的作用下，使骨胶原蛋白大分子链断裂，生成低分子量的低聚肽，即骨胶原蛋白肽。

本发明采用骨胶原蛋白原料与载体固定化酶进行反应的酶解工艺。由于酶是固定于载体上，因此酶解结束后可以方便地实现酶的回收和再利用。在实际工业生产中，可以采用安装有载体固定化酶的反应器，能够实现连续或半连续的生产。本发明采用载体固定化酶的酶解工艺，相对于现有技术的酶解工艺而言，可以减少生产环节，省去了传统的加酶和酶灭活的工序，能够有效改善骨胶原蛋白肽的口感，也提高了多肽含量测定的准确性。

<载体>

为了提高骨胶原蛋白原料与被载体固定的酶的接触效率，本发明创造性地提出了联合使用静态载体固定化酶和动态载体固定化酶的技术方案。

静态载体固定化酶指的是，将酶固定化于静态载体之上，该静态载体相对于安装有该静态载体的酶解反应器不发生相对运动，即静态载体固定化酶是“固定”于反应器之上，例如可拆卸地固定在反应器外壳内壁，使得被固定的酶不随着反应物料运动。利用静态载体固定化酶具有高的酶负载率的特点，能够提升单批次的骨胶原蛋白原料的处理量。

动态载体固定化酶指的是，将酶固定化于动态载体之上，该动态载体相对于所述酶解的反应器发生相对运动。在酶解过程中，动态载体固定化酶随着反应物料共同运动，其与骨胶原蛋白原料的接触程度近似于自由酶（非载体固定化酶），能够增加骨胶原蛋白原料与酶的接触机会，提高酶解的效率和效果。

[载体固定化酶]

<静态载体>

作为静态载体，只要能够满足以下三个条件，则没有特别的限定：

（1）载体能够稳定地固定于反应器内壁上，

（2）载体能够牢固地与酶结合，

（3）载体固定于反应器之后，载体之间具有供骨胶原蛋白原料（下文也称为“反应物料”）流动的通道。

作为示例，可以列举出片状载体、棒状载体、纤维状载体。其中优选片状载体，其固定酶的技术路线相对成熟，具有较高的酶负载量。另一方面，采用片状载体作为静态载体时，可以在反应器内可拆卸地固定安装多个（多片）这样的片状载体，载体之间相互重叠但不接触，从而形成分米级至毫米级尺度的通道，反应物料在通道间穿行，不仅增加了载体固定化酶的有效接触面积，也可以防止反应物料中的骨粉阻塞物料流动通道。该技术效果是现有技术中使用的膜状载体所不能达到的，也是本发明可以直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料的基础。

<动态载体>

动态载体，只要能够随着反应物料一起运动，并且在酶解结束后易于回收，则没有特别的限定。作为示例，可以列举出球状载体、短纤维状载体等，这些载体可在酶解结束后通过过滤反应液得以回收。由于动态载体随着反应物料一起运动，所以即使直接使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料，也不存在骨粉堵塞物料流动通道的担心。通过动态载体与反应物料的有效混合，进一步增加了载体固定化酶的有效接触面积，弥补了单独使用静态载体造成的酶解反应不充分、不彻底的缺陷，使得产物骨胶原蛋白肽具有期望的低分子量。

作为优选方案，可以使用具有磁性的动态载体，例如磁性高分子微球等，从而可以通过外加磁场来调节、改变动态载体的分布状态和运动轨迹，不仅能够可控地提升反应体系内局部的酶浓度，还可以通过磁性对其进行回收，避免通过过滤的方法导致载体微球与骨粉混合在一起，影响再次使用。

<酶>

本发明中，对于胶原蛋白酶解时所用的酶，只要能够适用于胶原蛋白水解、并且能够维持活性地固定于在体制上，则没有特别限定。

作为示例，可以列举出胰蛋白酶、胶原蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中的一种或多种。上述酶可以单独使用，可以使用多种；在使用多种的情况下，根据所使用的酶的活性条件，可以在同一反应器（步骤）中使用，也可以沿着物料流向顺序使用。

酶的固定方式可以采用现有技术中公知的方法，例如使用戊二醛等交联剂将酶固定于载体之上。

<酶与载体的配合>

酶的种类与载体种类的配合，只要有利于酶解反应进行、并且使所用酶处在其活性pH和温度范围，则没有特别限定。在仅使用一种酶的情况下，可以将该特定的酶负载于动态载体与静态载体之上。在使用多种酶的情况下，可以在一种载体上负载多种酶，也可以在不同载体上分别负载不同的酶。

从便于控制反应条件的角度出发，优选在静态载体和固态载体上分别负载不同种类的酶，如此，当静态载体固定化酶与固态载体固定化酶以串联的形式设置时，可以使反应物料依次被不同的酶所水解，从而保证即使是半连续化乃至连续化的工业生产的情况下，产物骨胶原蛋白肽依然具有期望的低分子量。

[原料]

<原料选择>

本发明的制备方法，对于骨胶原蛋白原料没有特别的限定。具体而言，本发明的制备方法可以使用骨胶原蛋白水溶液作为原料，骨胶原蛋白可以源自商业购买的初级产品，也可以是利用动物骨骼经过预处理后、去除骨粉所得的骨胶原蛋白提取液。进一步地，当采用本发明前述特定的载体固定化酶时，还可以使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料。与现有技术不同，本发明即使使用含有骨粉的骨胶原蛋白原料，也不会造成反应设备的堵塞，并能够保证骨胶原蛋白顺利酶解为低分子量的骨胶原蛋白肽。

在使用动物骨骼的情况下，所用骨骼的动物种类没有特别限定，作为示例，可以列举出牛、羊、猪、马、驴等家畜，以及鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽。从骨胶原蛋白所含比例较高的角度考虑，优选家畜，进一步优选牛、羊等适合大规模放牧饲养的家畜；从防止动物骨骼原料引入异味的角度考虑，更进一步优选牛骨，以避免羊骨等天然的膻味对骨胶原蛋白肽产品及饮料制品等的风味的不利影响。

<原料处理>

如果采用商购骨胶原蛋白或其溶液，则可以直接作为原料使用或稀释后使用。

如果采用动物骨骼作为初始原料，则需要对原料进行预处理。动物骨骼的预处理包括脱脂处理和粉碎处理、高温高压处理等步骤。

脱脂粉碎处理的目的在于去除动物骨骼上附着的肌肉、结缔组织、脂肪等，防止杂质的引入。脱脂处理的具体方法没有特别限定，可以采用现有技术中公知的工艺流程。作为示例的工艺流程：首先在对动物骨骼进行初级破碎并除去残留的肌肉和结缔组织等，随后进行高温高压蒸煮，从而彻底去除骨骼上附着的有机组织。随后用水清洗，优选使用例如45~95℃的热水清洗，进一步优选依次使用热的氢氧化钠水溶液和热水进行清洗，干燥后进行粗粉碎和除油处理，例如采用真空干燥除油、滤纸吸油、加热蒸发除油等方法，之后对除油的粗骨粉进行细粉碎，按照《中华人民共和国药典》规定过4号筛（粒径250±9.9μm），得到骨骼粉末。

高温高压处理的目的在于，主要利用物理手段使骨骼粉末中的骨胶原蛋白与骨骼粉末分离、分散至水相乃至形成溶液，从而有利于后续的酶解反应。高温高压处理中，骨骼粉末与水的配比没有特别的限定，但是从骨胶原蛋白的高分离率和反应液体积的平衡的角度考虑，优选骨骼粉末与水按照质量比1:3-7、进一步优选质量比1:4.5-5.5的比例形成骨骼粉末分散液，更进一步优选浸润0.5-2.0h后再进行后续的高温高压处理。高温高压处理中的温度和压力没有特别限定，例如可以是115-130℃、0.11-0.15MPa，优选119-123℃、0.11-0.13MPa。高温高压处理的时间可以是1.5-3.2h，优选1.8-2.5h。最终得到含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

该含有骨粉的骨胶原蛋白原料可以通过过滤骨粉的方式得到不含有颗粒状杂质的骨胶原蛋白原料，从而可以用于现有技术中已知的载体固定化酶解技术。但是在本发明中，优选直接使用这种含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

[双固定化酶酶解的工艺流程]

<载体固定化酶的应用顺序>

本发明中，载体固定化酶的应用顺序没有特别限定，作为示例，可以列举出：

静态载体固定化酶与动态载体固定化酶在同一个反应器中同时使用，

静态载体固定化酶与动态载体固定化酶分别位于不同的反应器中，

以及：上述两种方式的组合。

从利用多种酶实现充分酶解的角度考虑，优选使反应物料分别与静态载体固定化酶与动态载体固定化酶接触，例如：

先与静态载体固定化酶接触反应、再与动态载体固定化酶接触反应，

或者先与动态载体固定化酶接触反应、再与静态载体固定化酶接触反应。

作为优选，可以使反应物料依次在静态载体固定化酶和动态载体固定化酶的存在下进行酶解。如此，则首先利用静态载体固定化酶的高载酶率的优点，对骨胶原蛋白进行初级的酶解，使之分解为相对原料而言更低分子量的蛋白质片段；随后再利用动态载体固定化酶随着反应物料共同流动、与这些蛋白质片段进行更密切接触的特点，进行进一步的酶解，最终得到期望的低分子量骨胶原蛋白肽。

前文所称“依次”，仅是描述反应物料与载体固定化酶接触的先后顺序，即从整个反应流程中截取某一流程片段来看，反应物料至少与静态载体固定化酶接触后、再至少与态载体固定化酶接触。

反应物料与载体固定化酶的接触可以仅一次，也可以多次。

在多次接触的情况下，可以任意地组合静态载体固定化酶与动态载体固定化酶的顺序。作为示例，可以使反应物料依次在静态载体固定化酶和动态载体固定化酶的存在下进行酶解、并将这种“依次酶解”的步骤重复1次以上；作为另一个示例，可以使反应物料与静态载体固定化酶接触后、再次与静态载体固定化酶接触一次或两次以上、然后与动态载体固定化酶接触一次或两次以上，这种情况特别适合于原料投料量较大的大规模工业生产；作为再一个示例，可以使反应物料与静态载体固定化酶接触一次或两次以上后、随后与动态载体固定化酶接触一次、然后再次与动态载体固定化酶接触一次或两次以上，这种情况特别适合于要求连续化生产的情况，当一次动态载体固定化酶的酶解无法保证反应充分时，可以对该动态载体固定化酶的酶解步骤重复一次或两次以上。

以上仅为示例性说明，实际工业生产中可以采用胶原蛋白酶原料与载体固定化酶接触次序的安排并不限于此。

<反应条件>

本发明的制备方法中，对于酶解所用的酶没有特别限定。但是从酶的固定工艺成熟的角度出发，优选配套使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶。

酶解的具体条件没有特别的限制，可以采用现有技术中公知的反应条件。作为示例：胰蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=7.6-8.2下反应4-10h，胶原蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=5.5-6.8下反应2-5.5h。

作为一种优选方案，本发明的制备方法中，骨胶原蛋白首先通过胰蛋白酶进行酶解、其产物再通过胶原蛋白酶进行酶解。由于胰蛋白酶和胶原蛋白酶的最佳pH条件不同，前者需要偏碱性环境、而后者则是偏酸性环境。而骨胶原蛋白原料（骨胶原蛋白提取液）是偏碱性的体系，骨胶原蛋白肽的饮料制品需要混合偏酸性的浓缩果汁等以调整口感，故依次使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶，可以使反应流程自然地由碱性体系向酸性体系过度，避免加入过多的pH调节剂、减少成盐，在节约原料成本的同时，提高最终产品（即骨胶原蛋白肽的饮料制品）的口感。

作为更进一步的优选方案，对于静态载体固定化酶使用胰蛋白酶，对于动态载体固定化酶使用胶原蛋白酶，并采用包括使反应物料首先通过静态载体固定的胰蛋白酶一次或两次以上、随后再通过动态载体固定的胶原蛋白酶一次或两次以上进行酶解反应的工序，从而利用载体顺序和酶顺序所带的协同效果。

酶解反应过程中可以对反应物料进行搅拌，例如每1.5-2.5h搅拌依次，反应过程中可以进行取样，并检测产物的分子量；也可以按照设定的酶解反应时间进行反应，对产物骨胶原蛋白肽进行分子量检测，以80%的骨胶原蛋白肽分子量在1000Da以下作为合格标准。

<后处理工序>

酶解反应结束后，动态载体、骨粉等依然存在于反应物料之中，因此需要对其进行一定的后处理，作为示例，可以列举出过滤分离操作、浓缩操作等后处理工序。

对反应物料可以进行固液分离操作，从而去除大颗粒固体物料，例如动态载体、骨粉等。在使用具有磁性的动态载体的情况下，优选首先通过磁力将该动态载体分离回收，随后再进行固液分离，避免骨粉与动态载体混杂。固液分离操作没有特别的限定，例如可以使用孔径10μm以下的滤布，过滤直至液体澄清。为了进一步去除细微的骨粉等固体杂质，优选在过滤后进行离心分离。也可以仅进行离心分离操作，但是工艺成本较高。当然，如前所述，对于直接以这种含有骨粉的粗产品作为食品饮料等的原料、或者作为初级产品销售的情况下，也可以不进行过滤分离操作，但是应当使用具有磁性的动态载体、以防止动态载体残留于粗产品中。

反应结束后，反应液中相对分子质量在10000Da以下的胶原蛋白肽所为90%（摩尔）以上，优选相对分子质量在1000Da以下的胶原蛋白肽所占比例为90%（摩尔）以上。进一步地，对反应物料可以进行浓缩操作，例如采用减压蒸发等操作。作为示例，在温度80-88℃、压力0.10MPa以下的条件下进行减压蒸发。

[含有骨胶原蛋白肽的饮料]

本发明的另一个目的在于，提供含有骨胶原蛋白肽的饮料。

<成分>

本发明的饮料含有骨胶原蛋白肽作为必需原料，优选含有前述方法制备得到的胶原蛋白肽，进一步优选骨胶原蛋白肽原料中相对分子质量在1000Da以下的胶原蛋白肽所占比例为90%（摩尔）以上。

为了调整饮料的口感，优选加入浓缩果汁；进一步优选加入饮料中常用的其他辅料，作为列举，可以举出乳酸钙、木糖醇、山梨酸钾、羧甲基纤维素钠、单硬脂酸甘油脂、柠檬酸钠、维生素C、羟丙基二淀粉磷酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯中的一种或多种。

从充分利用动物骨骼资源的角度出发，还可以加入优选来源自牛骨的硫酸软骨素。

各物料的用量没有特别限定，可根据食品工业领域中对于这些物料的一般要求而定。作为优选，骨胶原蛋白肽的含量在5-6g/100mL以上。

<制备流程>

本发明的含有骨胶原蛋白肽的饮料，其制备流程没有特别的限定，可以采用现有技术中常规的饮料生产流程，包括饮料容器的清洗、灌装、灭菌、检查和外包装等环节。

实施例

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[准备例1]

采用检验检疫合格的内蒙古黄牛的牛棒骨作为原料，破碎、除去结缔组织并清洗，投入高压釜中，在120℃下高温处理35min彻底去除骨头上附着的有机组织。

对处理后的牛骨用90℃的纯净水冲洗3次，冲洗后沥干水分，铺平并置于60℃的鼓风箱内干燥7h。用破骨机对烘干的牛骨进行粗粉碎，碎料放在铺有定性滤纸的托盘上，送入鼓风干燥箱内，在60℃干燥，期间多次更换滤纸，直到滤纸上未有可见油脂为止。脱脂碎料进行细粉碎，过4号筛，得到牛骨粉。

将牛骨粉与水按照质量比1:5的比例混合，形成悬浮液，投入高压釜中，在121℃、0.12MPa的条件下处理2h，得到含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

[准备例2]

采用片状载体（武汉赛科成科技有限公司生产，SKC0102-0250型号），参照现有技术（“片状载体固定化胰蛋白酶的研究”，黄冬丽等，《农产品加工》，2018.8）的方法，将片状载体进行预处理后，以戊二醛作为交联剂固定胰蛋白酶，戊二醛浓度2.27wt%，胰蛋白酶的质量分数2.35%，温度55℃，pH值为8.5，制备得到静态载体固定化酶S1（片状载体、胰蛋白酶）。

[准备例3]

参照现有技术（“磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质”，李黎等，《中国组织工程研究》），以Fe₃O₄磁性粒子为内核、液体石蜡为分散介质、Span为乳化剂、戊二醛为交联剂，制备制备得到动态载体固定化酶D1（磁性微球载体，胶原蛋白酶）。

[准备例4]

片状载体（武汉赛科成科技有限公司生产，SKC0102-0250型号）进行预处理后，以戊二醛作为交联剂固定胶原蛋白酶，戊二醛浓度2.76wt%，胶原蛋白酶的质量分数2.73%，温度43.78℃，pH值为6.0，制备得到静态载体固定化酶S2（片状载体、胶原蛋白酶）。

实施例1

在10L反应器内壁上可拆卸地安装静态载体固定化酶S1，使其不影响搅拌，且各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。向反应器中投入8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，使用食品级氢氧化钠溶液调节pH为8.0，使反应温度维持在55℃，每0.5h搅拌1次，促使物料在静态载体固定化酶S1所形成的物料流道内发生位移，反应7h后放料备用。

将上一步骤的反应物料投入到另外的10L的非铁磁性反应器中，并投入以上一步骤的反应物的质量计为5质量%的动态载体固定化酶D1，使用食品级盐酸溶液调节pH为6.0，使反应温度维持在50℃，每0.5h搅拌一次以防止沉淀。反应4h后，使用强磁铁充分吸附去除动态载体，移除动态载体固定化酶D1，得到骨胶原蛋白肽粗产品。该粗产品可以直接用作例如食品等的原料、或者包装销售，也可以通过以下的固液分离、浓缩等后处理工序进行纯化。

对于骨胶原蛋白肽粗产品，采用孔径50μm的滤布在常压下过滤后，用纯净水冲洗滤渣2次，合并滤液，送入离心机中，在5000rpm的转速下离心分离5min。上清液送入减压蒸馏设备，在85℃、0.08MPa的条件下减压蒸馏，浓缩至7.6 L，液体中98%颗粒保留在≤50μm范围内，得到作为产物的骨胶原蛋白肽溶液1。

[产品检测]

依照GB31645-2018《胶原蛋白肽》中的检测方法，采用岛津高效液相色谱仪（配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站），以TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm的凝胶色谱柱，测得骨胶原蛋白肽溶液1中，90.1%（摩尔）的骨胶原蛋白肽的分子量在1000Da以下。

实施例2

在10L非铁磁性反应器内壁上可拆卸地安装静态载体固定化酶S2，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。向反应器中投入8L准备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，并投入以含有骨粉的骨胶原蛋白原料的质量计为5质量%的动态载体固定化酶D1，使用食品级盐酸溶液调节pH为6.2，使反应温度维持在50℃，每0.5h搅拌一次以防止沉淀。反应5.5h后，使物料通过安装有电磁装置的分离设备，移除动态载体固定化酶D1，得到骨胶原蛋白肽粗产品。对粗产品进行固液分离和浓缩后处理，具体操作流程同实施例1，得到作为产物的骨胶原蛋白肽溶液2。

产品检测，骨胶原蛋白肽溶液2中，82.0%（摩尔）的骨胶原蛋白肽的分子量在1000Da以下。相比于实施例1，由于在一个反应器中同时使用了静态载体固定化酶和动态载体固定化酶，可以减少反应设备的投资；但是，由于体系pH等因素所限，只能使用一种酶，故骨胶原蛋白原料的酶解程度低于实施例1。

实施例3

准备三组10L反应器，其内壁上可拆卸地安装静态载体固定化酶S1，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道，三组反应器串联连接。将8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，使用食品级氢氧化钠溶液调节至pH 8.0，并加热至50℃，随后送入前述串联的反应器的第一组反应器中，使反应物料依次流经三组反应器，每组反应器中停留2h。反应过程中维持反应器内的物料温度在50℃。从最末端的反应器放出物料备用。

将上一步骤的反应物料继续通过动态载体固定化酶D1进行酶解，随后进行固液分离和浓缩后处理，具体操作流程同实施例1，得到作为产物的骨胶原蛋白3。

经产品检测，骨胶原蛋白肽溶液3中，92.4%（摩尔）的骨胶原蛋白肽的分子量在1000Da以下。通过采用多组反应器串联，可以实现半连续化生产，更适应于实际的工业生产要求。

实施例4

在10L反应器中安装可拆卸地静态载体固定化酶S1，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。向反应器中投入8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，使用食品级氢氧化钠溶液调节pH为8.0，使反应温度维持在50℃，反应3h，并在第0.5h时搅拌一次，促使物料在静态载体固定化酶S1所形成的物料流道内发生位移。

在10L反应器中安装可拆卸地静态载体固定化酶S2，与上述类似，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。将上一步的反应物料送入反应器中，使用食品级盐酸溶液调节pH为6.5，使反应温度维持在50℃，反应3h，并在第0.5h时搅拌一次，促使物料在静态载体固定化酶S2所形成的物料流道内发生位移。

将上一步骤的反应物料通过态载体固定化酶D1进行酶解，随后进行固液分离和浓缩后处理，具体操作流程同实施例1，得到作为产物的骨胶原蛋白肽溶液4。

经产品检测，骨胶原蛋白肽溶液4中，93.4%（摩尔）的骨胶原蛋白肽的分子量在1000Da以下。通过在胰蛋白酶和胶原蛋白酶之间增加一步静态载体固定化胶原蛋白酶的酶解步骤，可以进一步平缓pH变化程度，有利于提升酶的反应活性、减少成盐。

实施例5

在10L的非铁磁性反应器中投入8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，以及以含有骨粉的骨胶原蛋白原料的质量计为5质量%动态载体固定化酶D1，缓慢滴加入食品级盐酸溶液，调节pH为6.0，使反应温度维持在50℃，每0.5h搅拌一次以防止沉淀。反应4h后，使物料通过安装有电磁装置的分离设备，移除动态载体固定化酶D1，放料备用。

准备10L反应器，其中安装可拆卸地静态载体固定化酶S1，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。将上一步骤得到的反应物料投入其中，缓慢地加入食品级氢氧化钠溶液，调节pH为8.0，使反应温度维持在50℃，每0.5h搅拌一次，促使物料在静态载体固定化酶S1所形成的物料流道内发生位移，反应7h后放料备用，得到骨胶原蛋白肽粗产品。

对于骨胶原蛋白肽粗产品进行固液分离和浓缩后处理，具体操作流程同实施例1，得到作为产物的骨胶原蛋白肽溶液5。

经产品检测，骨胶原蛋白肽溶液5中，89.0%（摩尔）的骨胶原蛋白肽的分子量在1000Da以下。由于颠倒了两种酶的使用顺序，整个酶解流程中反应物料的pH值反复多次地酸碱波动，需要缓慢加入更多量的pH调节剂，生产工艺不经济，并且最终得到的骨胶原蛋白肽溶液5的含盐率高于实施例1。

比较例1

参考CN101768551，准备安装有聚酰胺膜的圆柱形反应器，其截留分子量为10000Da，根据该现有技术的方法，在膜的内侧表面上固载胰蛋白酶。随后将准备例1制备的含有骨粉的骨胶原蛋白原料投入反应器中（位于膜的内侧），并与本发明实施例1相同地，在pH为8.0、50℃、每2h搅拌一次的条件下反应7h。

反应结束后，放料时仅有少量的澄清的液体被放出。经拆解反应器观察，发现骨粉涂布于聚酰胺膜的内侧表面，几乎完全覆盖固载的胰蛋白酶，导致酶解反应无法顺利进行。

比较例2

在10L反应器中可拆卸地安装静态载体固定化酶S1，各个片状静态载体相互穿插以形成物料流道。向反应器中投入8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料，使用食品级氢氧化钠溶液调节pH为8.0，使反应温度维持在50℃，每2h搅拌一次，促使物料在静态载体固定化酶S1所形成的物料流道内发生位移，反应12h后放料。

所得反应物料采用孔径50μm的滤布在常压下过滤，用纯净水冲洗滤渣2次，合并滤液，送入离心机中，在5000rpm的转速下离心分离5min。上清液送入减压蒸馏设备，在85℃、0.08MPa的条件下减压蒸馏，浓缩至7.8L时已经较为粘稠，经产品检测，分子量在1000Da以下的骨胶原蛋白肽仅为47.1%，反应并不充分。

比较例3

将8L制备例1得到的含有骨粉的骨胶原蛋白原料投入到10 L的非铁磁性反应器中，并投入以含有骨粉的骨胶原蛋白原料的质量计为2质量%的动态载体固定化酶D1，使用食品级盐酸溶液调节pH为6.0，使反应温度维持在50℃，每0.5 h搅拌一次以防止沉淀。反应12h后，使物料通过安装有电磁装置的分离设备，移除动态载体固定化酶D1后放料。

所得反应物料采用孔径50μm的滤布在常压下过滤，用纯净水冲洗滤渣2次，合并滤液，送入离心机中，在5000rpm的转速下离心分离5min。上清液送入减压蒸馏设备，在85℃、0.08MPa的条件下减压蒸馏，浓缩至7.5 L时已经较为粘稠，经产品检测，分子量在1000Da以下的骨胶原蛋白肽仅为62.3%，反应并不充分。

实施例6

将83.5L 实施例1得到的骨胶原蛋白肽溶液1中，加入处方量的硫酸软骨素（来源牛骨）1092g，乳酸钙1092g，无添加百香果浓缩果汁4.55kg，木糖醇9.1kg，山梨酸钾45.5g，搅拌混匀至全部溶解，定容至100L，得到骨胶原蛋白肽饮料1。

将瓶子正向转移至清洁的周转盘中，待洗瓶机空载10分钟后，上机洗瓶，依次开动饮用水、纯化水、洁净高压空气、高热空气各喷头，进行洗瓶、干燥、灭菌操作过程。剔除不规格瓶和碎瓶，反向转移至清洁的周转盘中。

将骨胶原蛋白肽饮料1灌注如瓶子中，每20分钟取样检查装量，依次取5支，平均装量应不少于标示量，同时，每支装量应不少于标示量的93%。

灌装后在0.08MPa、温度105 ℃的条件下灭菌30min后封装，检测合格后包装待售。

实施例7

与实施例6相同，只是使用实施例5得到的骨胶原蛋白肽溶液5，得到骨胶原蛋白肽饮料2。

经人工品尝，相比于骨胶原蛋白肽饮料1而言，骨胶原蛋白肽饮料2的口感更加发涩，这是由于较高的含盐率所导致口感变差。

对骨胶原蛋白肽饮料2进行口感调试，使之获得与骨胶原蛋白肽饮料1较为近似的口感，需要额外添加其他的调味剂，并且引入了额外的制备工艺流程。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种骨胶原蛋白肽的制备方法，包括使用静态载体固定化酶和动态载体固定化酶对骨胶原蛋白原料进行酶解的工序，以及在所述酶解之后去除所述动态载体固定化酶的工序；

其中，所述静态载体相对于所述酶解的反应器不发生相对运动，并且多个所述静态载体之间形成所述骨胶原蛋白原料流动的通道，

所述动态载体相对于所述酶解的反应器发生相对运动。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述动态载体具有磁性。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述骨胶原蛋白原料依次在所述静态载体固定化酶和所述动态载体固定化酶的存在下进行酶解。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述静态载体固定化酶和所述动态载体固定化酶所使用的酶选自胰蛋白酶、胶原蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中的一种或多种，优选胰蛋白酶和/或胶原蛋白酶，进一步优选所述静态载体固定化酶所使用的酶是胰蛋白酶并且所述动态载体固定化酶所使用的酶是胶原蛋白酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=7.6-8.2下反应4-10h，所述胶原蛋白酶的酶解条件是在45-55℃、pH=5.5-6.8下反应2-5.5h。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述骨胶原蛋白原料是含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有骨粉的骨胶原蛋白原料的制备方法包括以下步骤：

（i）对动物骨骼进行脱脂处理和粉碎处理，得到骨骼粉末；

（ii）将所述骨骼粉末与水混合后，进行高温高压处理，得到所述含有骨粉的骨胶原蛋白原料。

8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括在所述酶解之后对酶解液进行过滤分离和/或浓缩的后处理工序。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述动物骨骼是牛骨和/或羊骨，优选牛骨。

10.饮料，其特征在于，含有权利要求1-9任一项所述制备方法制备得到的骨胶原蛋白肽。