CN113082208A - 阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用。本发明揭示了7‑脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)在I型干扰素IFN‑β表达、病原微生物感染或血清胆固醇调控方面发挥着重要的生物学作用，其可作为病原微生物感染以及血清胆固醇调控研究的靶点。

Description

阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用
技术领域
本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及本发明涉及阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用。
背景技术
病原微生物可以通过呼吸道、消化道、皮肤粘膜、眼及泌尿生殖器和胎盘传播。如果不能及时有效控制病原微生物尤其新发或重症病毒的感染，可能会引起死亡及遗留后遗症。人体的病毒性感染多数呈隐性感染，少数为显性感染。显性感染表现为急性感染，发病急、病程短，多在1～2周内自愈，少数表现为潜伏性感染(如乙型肝炎病毒感染等)。病毒感染与肿瘤的发生也有关，如原发性肝癌与乙肝病毒感染有关，子宫颈癌与HPV感染有关，乳腺癌患者伴有HPV感染等。如何阻断病毒感染、防止和治疗病毒感染相关肿瘤是国内外关注的问题。此外，近几年爆发的新发或重症病毒感染，尚缺乏特效药物或疫苗来抵御或治疗这类感染性疾病，例如禽流感病毒和寨卡病毒。寨卡病毒是一种由蚊子传播的黄病毒，被寨卡病毒感染后的常见征状包括发烧、疹子、关节疼痛、肌肉疼痛、头痛和结膜炎，病情通常较温和，征状可持续数日至一周。虽然感染寨卡病毒的非孕个体通常无症状，但是被诊断为急性寨卡病毒感染的孕妇中约29％导致各种胎儿畸形，包括小头畸形、自然流产和宫内生长受限并留下后遗症。自2014年巴西暴发寨卡病毒感染以来，由于其全球传播，已成为一个主要的公共卫生问题。
调节体内胆固醇含量可降低心血管等疾病的发病风险，研究显示降低细胞的胆固醇水平还有助于抵御病毒感染。并且，病毒繁殖需要胆固醇，降低胆固醇含量可限制病毒在体内的繁殖。目前有在临床使用或在临床前研发的降低胆固醇的药物主要针对胆固醇限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶即他汀类药物(statins)。此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加，促进血清胆固醇的清除，但其实际疗效方面还有待验证。
因此，本领域还需要进一步开发防治病毒感染的物质，以更有效地应用于临床制药或必要时的环境中病毒的灭杀、消除，从而降低或避免病毒的感染。
发明内容
本发明的目的在于提供阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用。
在本发明的第一方面，提供7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)下调剂的用途，用于：制备预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制的组合物；制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物；制备降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物的组合物；和/或制备预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病的组合物。
在一个优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂包括：特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物；特异性干扰7-脱氢胆固醇还原酶基因表达的干扰分子；特异性下调(包括敲除)7-脱氢胆固醇还原酶基因的基因编辑试剂；或特异性与7-脱氢胆固醇还原酶基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂是特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物，其包括：AY9944或除AY9944以外的DHCR7下调剂；较佳地包括：他莫昔芬(Tamoxifen)。
在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂是靶向缺失7-脱氢胆固醇还原酶基因的干扰分子或基因编辑试剂；较佳地，所述干扰分子为以SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示序列的核酸制备的干扰分子；或所述基因编辑试剂为以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列的核酸制备的基于Cas9的试剂。
在另一优选例中，所述的病原微生物包括病毒；较佳地包括能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地包括：寨卡病毒，水疱性口炎病毒等DNA或RNA病毒。
在另一优选例中，所述的病毒包括：DNA病毒或RNA病毒。
在另一优选例中，所述的病毒不是埃博拉病毒、乙肝病毒
在另一优选例中，所述的抑制病原微生物为体内或体外抑制病毒或其他病原微生物。
在另一优选例中，所述的降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物为体内或体外降低胆固醇或降脂或调控相关胆固醇代谢产物。
在另一优选例中，所述的降低胆固醇或调控胆固醇代谢产物是降低外周血胆固醇或调控外周血胆固醇代谢产物(水平)；较佳地降低血清胆固醇或调控血清胆固醇代谢产物(水平)。
在另一优选例中，所述的降低胆固醇或调控胆固醇代谢产物是降低巨噬细胞的膜胆固醇或调控巨噬细胞中胆固醇代谢产物(水平)。
在另一优选例中，所述的病原微生物感染相关肝病、或高胆固醇或高脂相关肝病包括(但不限于)：高脂血症，高胆固醇血症，肝癌，脂肪肝，肝硬化，动脉粥样硬化。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物，所述7-脱氢胆固醇还原酶下调剂与药学上可接受的载体混合。
在本发明的另一方面，提供一种体外非治疗性抑制病原微生物的方法，包括：以7-脱氢胆固醇还原酶下调剂处理感染病原微生物的对象；较佳地，所述的对象包括(但不限于)：感染病原微生物的宿主、细胞、细胞培养物、场所、容器、器物。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，该药物组合物含有：7-脱氢胆固醇还原酶下调剂；以及至少一种有利于预防或治疗病原微生物感染的辅助药剂以及药学上可接受的载体；较佳地，所述预防或治疗病原微生物感染的辅助药剂包括(但不限于)阻断病毒自身复制的辅剂。
在本发明的另一方面，提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：将7-脱氢胆固醇还原酶下调剂、至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂与药学上可接受的载体混合；所述的药物组合物用于：预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制；促进I型干扰素IFN-β表达；降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物；和/或预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病。
在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制，促进I型干扰素IFN-β表达，降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物，和/或预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病的物质(即感兴趣的物质，包括潜在物质)的方法，包括：(1)用候选物质处理表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系；和(2)检测所述体系中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性，则表明该候选物质是感兴趣的物质(包括潜在物质)。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系；如果测试组中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是感兴趣的物质。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达7-脱氢胆固醇还原酶的细胞或细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的统计学上低于优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对7-脱氢胆固醇还原酶或其编码基因设计的小分子化合物，针对7-脱氢胆固醇还原酶或其编码基因所参与的信号通路或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗疾病有用的物质。
在另一优选例中，所述的病原微生物包括病毒；较佳地包括能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地包括：寨卡病毒，水疱性口炎病毒等DNA或RNA病毒。
在另一优选例中，所述7-脱氢胆固醇还原酶下调剂包括：特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物，特异性干扰7-脱氢胆固醇还原酶基因表达的干扰分子，特异性敲除7-脱氢胆固醇还原酶基因的基因编辑试剂，或特异性与7-脱氢胆固醇还原酶基因编码的蛋白结合的抗体或配体；更佳地，所述小分子化合物包括：他莫昔芬以及研发的特异性下调7-脱氢胆固醇还原酶活性的新型小分子化合物。
在另一优选例中，所述干扰分子为以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的核酸制备的干扰分子；或所述基因编辑试剂为以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的核酸制备的基于Cas9的试剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、他莫昔芬通过促进I型干扰素IFN-β表达，抑制多种病毒感染；
a.LC/MS检测他莫昔芬处理的巨噬细胞中，胆固醇的含量；
b.Filipin III染色检测他莫昔芬处理的巨噬细胞中，细胞膜上的含量；
c.qPCR检测他莫昔芬处理的腹腔巨噬细胞中，病毒VSV感染介导的I型干扰素IFN-β表达；
d.荧光显微镜观察他莫昔芬处理的巨噬细胞中，病毒VSV-GFP的荧光强度；
e.流式细胞仪分析他莫昔芬处理的巨噬细胞中VSV-GFP阳性细胞的平均荧光强度；
f.qPCR检测他莫昔芬处理的A549细胞中，病毒ZIKV感染介导的I型干扰素IFN-β表达；
g.qPCR检测他莫昔芬处理的A549细胞中，病毒ZIKV的载量；
h.空斑试验检测他莫昔芬处理的A549细胞中，病毒ZIKV的滴度；
图2、他莫昔芬提高小鼠抵御病毒VSV的感染；
a.他莫昔芬和VSV-GFP病毒的给药流程；
b.LC/MC检测小鼠血清中胆固醇的含量；
c.ELISA检测VSV感染的小鼠血清中I型干扰素IFN-β蛋白的含量；
d.VSV感染的小鼠生存曲线；
e.病理切片观察肝脏中VSV-GFP的含量；
f.qPCR检测VSV感染的小鼠肝脏组织中VSV的载量。
图3、DHCR7缺失或抑制剂AY9944处理的巨噬细胞降低了胆固醇的含量并增强I型干扰素的产生，且效果强于他汀类药物的抗病毒功能。
a.LC/MS检测DHCR7缺失的小鼠腹腔巨噬细胞中胆固醇的含量；
b.Filipin III染色检测DHCR7缺失的小鼠腹腔巨噬细胞中，细胞膜上的含量；
c.qPCR检测DHCR7缺失的小鼠腹腔巨噬细胞中，病毒VSV感染介导的I型干扰素IFN-β表达；
d.荧光显微镜观察DHCR7缺失小鼠及野生型小鼠WT的腹腔巨噬细胞中，病毒VSV-GFP的荧光强度；
e.LC/MS检测AY9944处理的小鼠腔巨噬细胞中胆固醇的含量；
f.Filipin III染色检测AY9944处理的小鼠腔巨噬细胞中，细胞膜上的含量；
g.LC/MC检测AY9944处理的小鼠血清中胆固醇的含量；
h.qPCR检测AY9944和他汀类药物(Statin)处理的巨噬细胞中，病毒VSV感染介导的I型干扰素IFN-β表达。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)在I型干扰素IFN-β表达、病原微生物感染或血清胆固醇调控方面发挥着重要的生物学作用，因此DHCR7可作为病原微生物感染以及血清胆固醇调控研究的靶点。
DHCR7及其下调剂
DHCR7是参与胆固醇生物合成最后一步的酶，将7脱氢胆固醇(7-dehydrocholesterol，7DHC)转化成胆固醇。尽管本领域知晓DHCR7作为参与胆固醇合成最后一步的酶，但是参与胆固醇生物合成途径的酶较多，目前开发降脂的药物靶点集中在胆固醇合成源头的步骤，尚无报道DHCR7可以作为血清胆固醇或巨噬细胞的膜胆固醇的调控靶点。而且，本发明人意外地发现，靶向DHCR7抑制病毒复制的作用，比靶向胆固醇合成源头的酶(如他汀类药物靶向HMG-辅酶A还原酶)的作用更强，这是出乎意料的。
本发明人在研究中发现，他汀类药物具有一定的增强巨噬细胞抗病毒感染的功能，但是疗效有限。可能与这类药物从最上游步骤阻断胆固醇代谢，不光降低胆固醇，也降低多种胆固醇的前体或氧化型胆固醇等代谢产物(有些前体或可能发挥阻断病毒感染的功能，例如累积的氧化型胆固醇如25-羟基胆固醇被报道能阻断HBV和寨卡病毒的入侵)。因此本发明人首次提出从最下游的酶DHCR7入手。DHCR7能将7-脱氢胆固醇(7-DHC)转化为胆固醇，是胆固醇生物合成的最后一步。通过阻断DHCR7活性(包括但不限于Tamoxifen和AY9944)，提高I型干扰素生成、降低胆固醇和促进上游产物7-DHC的累积，从而有效地应用于临床制药，防治病毒感染、降胆固醇、防治HBV感染和高脂相关的肝癌。
本发明的具体实施方式中，证实了DHCR7下调剂，包括他莫昔芬(Tamoxifen)，能显著抑制病毒的感染，其抗病毒感染的效果优于他汀类药物(Statin)。并且，所述的他莫昔芬和靶向DHCR7的下调剂(包括AY9944或除AY9944以外的DHCR7下调剂)可以降低细胞内及膜上的胆固醇含量，促进I型干扰素IFN-β表达，并且发挥抑制病毒感染的作用。
本发明中确定了他莫昔芬和靶向DHCR7的下调剂对于血清中胆固醇水平的调控，这不同于局部组织或个别细胞类型上的胆固醇调控，而是针对机体血液循环系统的调控，显然这是更具有临床意义的。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种DHCR7基因或蛋白的下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制的组合物，制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物，制备降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物的组合物，和/或制备预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病的组合物。
如本文所用，所述的DHCR7基因或蛋白的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂剂、阻滞剂、阻断剂等。
所述的DHCR7基因或蛋白的下调剂是指可降低DHCR7蛋白的活性、降低DHCR7基因或蛋白的稳定性、下调DHCR7蛋白的表达、减少DHCR7蛋白有效作用时间、或抑制DHCR7基因的转录和翻译的物质，这些物质可用于本发明，作为对于下调DHCR7有用的物质，从而可用于促进I型干扰素IFN-β表达、抑制病毒感染或调控血清或巨噬细胞的膜胆固醇水平。例如，所述的下调剂是：特异性下调(包括缺失或敲除)DHCR7的基因编辑试剂，特异性干扰DHCR7基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与DHCR7基因编码的蛋白结合的抗体或配体，等等。
作为本发明的优选方式，所述的下调剂是DHCR7特异性的基因编辑试剂，较佳地采用CRISPR/Cas9系统进行靶向的基因编辑，从而缺失DHCR7基因。缺失DHCR7基因的步骤可以包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9mRNA。作为本发明的优选方式，所述基因编辑试剂为以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的核酸制备的基于Cas9的试剂；本发明人观察到，采用所述基因编辑试剂，可良好地调控DHCR7，对于降低巨噬细胞的膜胆固醇、降低血清胆固醇水平、增加I型干扰素IFN-β、抑制病毒具有优异的效果。
作为本发明的优选方式，所述的下调剂是针对DHCR7的小分子化合物。本领域技术人员可以采用本领域的常规筛选方法，来进行这类小分子化合物的筛选。例如，所述的小分子化合物为AY9944或除AY9944以外的DHCR7下调剂，更具体地如他莫昔芬。
他莫昔芬为雌二醇竞争性拮抗剂，现有技术中被用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌的药物，其能与乳腺细胞的雌激素受体结合，其结构式为以下式(I)。
靶向DHCR7的下调剂AY9944的结构式为以下式(II)。
Figure BDA0002330650560000091
在本发明中，所述的他莫昔芬、靶向DHCR7的下调剂(包括AY9944或除AY9944以外的DHCR7下调剂)可以是纯净形式存在的式(I)或(II)所示的化合物，或以一定的纯度存在。本发明中还包括其异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)或(II)化合物相同或基本相同的功能。
本发明中，还包括与式(I)或(II)化合物具有相同或基本相同的母核结构的化合物，只要它们也具有与式(I)或(II)化合物相同或基本相同的功能。例如，在部分环结构上进行个别基团的替换后获得的化合物，就是括与式(I)或(II)化合物具有相同或基本相同的母核结构的化合物。
所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：与无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；
化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)或(II)的一种化合物，或化学结构式(I)或(II)的一个化合物所组成的盐或溶液。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。
本发明所述的下调剂还可以是干扰DHCR7的干扰分子，如siRNA、shRNA，所述干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰分子可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。作为本发明的优选方式，所述干扰分子为以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的核酸制备的干扰分子；本发明人观察到，采用所述干扰分子，可良好地调控DHCR7，对于降低巨噬细胞的膜胆固醇、降低血清胆固醇水平、增加I型干扰素IFN-β、抑制病毒具有优异的效果。
用途
本发明提供了他莫昔芬的新用途以及靶向DHCR7的下调剂的新药研发，用于：制备抑制胆固醇合成的组合物；制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物；制备预防、缓解或治疗病毒感染的组合物；或制备降脂降胆固醇的组合物；或防治病毒感染或高胆固醇相关肝癌的组合物。其中，所述的抑制病毒可以为体内抑制病毒或体外抑制病毒。本发明之前，他莫昔芬及靶向DHCR7的下调剂在抗病毒感染方面、降胆固醇方面、防治肝癌的应用尚未见报道。
在本发明中，在无特殊说明的情况下，使用的术语如“抑制病毒”通常是指抑制病毒的复制、入侵或感染等环节，从而降低宿主中病毒的滴度或感染。
本发明中，所述的病毒可以包括DNA病毒或RNA病毒。在本发明的一些优选方式中，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒。在本发明的具体实施方式中，所述的病毒包括：寨卡病毒(Zika Virus，简称ZIKV)、水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称VSV)等。
寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)，以蚊媒、无症状携带者及性途径传播，传播速度快，给人们的健康带来威胁。目前认为这些严重的神经系统表现是由孕妇宫内感染寨卡病毒从而发生小头症、自然流产以及胎盘功能不全导致的胎儿宫内生长受限。
水疱性口炎(Vesicular stomatitis)是由水疱性口炎病毒引起的一种急性热性人畜共患传染病。水疱性口炎是由病毒引起的人兽共患得传染性疾病，主要表现在口腔黏膜或在蹄冠部和趾间皮肤上发生水疱，出现泡沫一样的东西。患病动物主要是这种病的传染源。
他莫昔芬以及靶向DHCR7的下调剂也可被应用于如上具体列举的病毒以外的病毒。
通过使用化合物他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂，能够抑制上述病毒的感染，对宿主起到保护作用。在本发明的具体实施方式中，论证了他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂能在人来源细胞、小鼠来源细胞和病毒感染小鼠模型中抑制多种病毒的感染，并能预防和/或治疗甲型流感病毒、水疱性口炎病毒引起的死亡，对基础研究和临床应用均有重要的意义。
在本发明的具体实施方式中，论证了用他莫昔芬处理的细胞或靶向DHCR7的下调剂，通过抑制7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)的活性，下调胆固醇含量，累积7-脱氢胆固醇(7-DHC)从而促进I型干扰素IFN-β表达，降低胆固醇，抑制病毒的感染。因此，他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂作为药物可用于治疗：病原体感染疾病，高脂血症，高胆固醇血症，肝癌，脂肪肝，肝硬化，动脉粥样硬化，高血压。
本发明克服了现有治疗新发病原或高致病力病毒的药物有限的缺点，提供一种抵抗广谱病毒感染的新方法，具有临床治疗的价值和应用前景。本发明创新性通过阻断胆固醇合成最后一步的关键酶DHCR7的活性的老药他莫昔芬或者新型下调剂，相对于阻断HMG-COA还原酶的他汀类药物，避免影响众多合成胆固醇前体的代谢物，更有效降低胆固醇、提高抗病毒感染的功能。
组合物
如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物、饮食补充剂或保健品组合物，只要它们含有他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂作为预防、缓解或治疗病毒感染的活性成分。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。所述药学上可接受的载体可以为存在于药物组合物中的并非活性组分的任何成分，因此包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料、着色剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。
本发明的药物组合物的适用对象可以为常见的易受病毒感染的人或哺乳动物，包括灵长类动物(如人或猴)、啮齿类动物(如鼠)或者猫、狗、猪等哺乳动物。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。根据治疗状况，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。给药的方法可以为常规的方式，如腹腔注射或静脉注射等。给药的剂量可以为本领域常规的剂量(有效量)，可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重和性别来确定。例如，对于雄鼠，7-8周龄，体重20-22g的C57小鼠，他莫昔芬的用量可以为25mg/kg体重(腹腔注射)。本领域技术人员可以根据给药的具体方式将他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂制备成不同的剂型。
当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。因此，本发明的药物组合物中，还可包括至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂。
药物筛选
在得知了DHCR7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)在I型干扰素IFN-β表达、病原微生物感染或血清胆固醇调控方面发挥着重要的生物学作用后，可以基于该特征来筛选感兴趣的物质，所述物质能够(或潜在地能够)：预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制，促进I型干扰素IFN-β表达，降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物，和/或预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病。经过筛选后，可从所述感兴趣的物质中找到真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达DHCR7的体系；和检测所述体系中DHCR7的表达或活性；若所述候选物质可抑制DHCR7的表达或活性，则表明该候选物质是感兴趣的潜在物质。所述的表达DHCR7的体系较佳地是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达DHCR7的细胞；或可以是重组表达DHCR7的细胞。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到DHCR7的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达DHCR7的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定真正有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的感兴趣的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制DHCR7的表达和活性，进而感兴趣有用的物质。
综上所述，本发明的主要技术进步在于：提供了一种防治病毒及/或降低胆固醇及/或防治肝癌的药物及其应用。揭示了他莫昔芬和靶向7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)的抑制剂对于抑制病毒及/或降低胆固醇具有非常优异的效果，用于抗病毒感染、感染相关或高脂相关肝癌。并且，所述的他莫昔芬、DHCR7的抑制剂可促进细胞或宿主I型干扰素IFN-β表达，降低胆固醇的水平。本发明提供了抵抗多种病毒感染及/或降低胆固醇的新途径，在抗病毒感染、感染相关或高脂相关肝癌具有良好的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
(1)细胞、动物及试剂
A549细胞来自中国科学院细胞库，目录号为TCHu150。
C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
小鼠由中国科学院上海生化细胞所SPF动物房饲养(Protocol No.IBCB0057)。所有动物试验均在中国科学院上海生化细胞所实验动物服务中心完成，且获得了中国科学院上海生化细胞所伦理委员会(批号)的许可。
他莫昔芬或靶向DHCR7的下调剂(包括但不限于AY9944)购自APExBIO公司，货号为B5965。
寨卡病毒(GZ01/2016strain)和水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称VSV)来自于上海大学。
(2)RNA抽提、反转录和实时定量PCR
RNA抽提：细胞处理后，收集细胞，用PBS洗涤一次，加入1ml Trizol裂解，室温放置5min，加入200μl氯仿，剧烈Vortex，室温放置3分钟，12000rpm，4℃离心15min，取上层水相(上层液体，约500μl)加入等体积的异丙醇，室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min，加入1mL 75％乙醇洗涤一次，12000rpm，4℃离心5min。去上清，用小tip吸干液体，气干沉淀5-10min，加入20μl ddH2O(DEPC处理过)溶解混匀后，Nanodrop测定RNA浓度。RNA于-80℃保存。除非另外说明，其中的室温指“20℃”。
反转录：首先将1μg RNA和100ng Oligo(dN6)混合，用DEPC水调至14μl。70℃孵育10min，迅速冰浴2min，然后加入4μl反转录酶缓冲液(5X)，1μl M-MLV反转录酶，1μl 10mMdNTP，用DEPC水调至20μl。37℃孵育1h，72℃10min灭活反转录酶活性。反转录产物加入180μl去离子水，即可作为qPCR反应cDNA模板。
实时定量PCR：qPCR反应体系为20μl：3.2μl去离子水，10μl SYBR-Green MasterMix，6μl稀释后的cDNA模板，0.8μl正向和反向引物(各10μM)。反应程序为：95℃3min；95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，读荧光值，共计40个循环；95℃1min；55℃1min；55℃～98℃熔解，每5sec温度升高5℃，同时读荧光值。
Q-PCR引物序列如表1。
表1
Figure BDA0002330650560000151
(3)DHCR7敲减的小鼠腹腔巨噬细胞或Cas9敲除巨噬细胞或Cas9条件性敲除小鼠的建立
下列序列用于构建Cas9敲除巨噬细胞：
DHCR7 sgRNA set1，5′-GACTGCCCCCGCATTGGATA-3’(SEQ ID NO:1)；DHCR7 sgRNAset2，5′-CCCGCATTGGATATAGCTAC-3’(SEQ ID NO:2)。
下列序列用于制备siRNA以及构建DHCR7敲减的小鼠腹腔巨噬细胞：
mDhcr7 siRNA-1：sense：5’-GUGGUUUGACUUCAAGCUG-3’和antisense:5’-CACCAAACUGAAGUUCGAC-3’(SEQ ID NO:3)；
mDhcr7 siRNA-2：sense：5’-CUAUAUGAUGGGAAUUGAG-3’和antisense：5’-GAUAUACUACCCUUAACUC-3’(SEQ ID NO:4)。
Cas9条件性敲除小鼠的建立：Dhcr7第四个外显子两端加上loxP位点，构建Dhcr7条件性敲除小鼠(cKO)。然后Dhcr7fl/-小鼠与LyzM-Cre+/+小鼠交配，获得在髓系包括巨噬细胞中特异性敲除Dhcr7基因的小鼠即Dhcr7fl/flLyzM-Cre+/-。
(4)空斑实验检测VSV和ZIKA病毒的滴度
对于VSV病毒，铺0.25×105个293T细胞于12孔板里过夜孵育。对于ZIKA病毒，铺2×105个Vero细胞于12孔板里过夜孵育。待细胞长密后用PBS清洗细胞一次，待检测的细胞上清梯度稀释，与细胞孵育3小时；弃上清然后PBS洗一次，用含有0.75％低熔点琼脂糖和含2％FBS的DMEM培养基再孵育细胞4天。用结晶紫染色后对空斑进行计数。
(5)显微镜和流式细胞仪检测VSV-GFP的强度
小鼠巨噬细胞用10uM的他莫昔芬预处理2h，然后VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞，12小鼠后荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的强度并收集细胞通过流式细胞仪检测VSV-GFP阳性细胞的平均荧光强度。
(6)冰冻切片
取VSV-GFP病毒感染12小时后的新鲜肝脏组织用包埋剂OTC包埋，放在-80℃。待切片的时候，提前放在-20℃，冰冻切片机切片。片子用PBS洗一遍，DAPI染色，封片，荧光显微镜下观察GFP的情况。
(7)LC/MS
取小鼠血清，皂化剂37℃处理30分钟，有机试剂萃取脂类物质，液相色谱质谱检测胆固醇含量。
(8)动物实验
对于VSV-GFP的感染，他莫昔芬(25mg/kg，腹腔注射)对C57BL/6小鼠进行预处理，连续三天给药后感染非死剂量VSV-GFP病毒(1×106PFU/g，静脉注射)或致死剂量VSV-GFP病毒(1×107PFU/g，静脉注射)。
(8)统计学分析
本发明人利用GraphPad Prism 6软件对所有数据进行了统计分析。组间比较用非配对t检验分析，生存曲线分析。确定p<0.05为有显著性差异(*)；p<0.01为有显著性差异(**)，p<0.001为有显著性差异(***)，p<0.0001为有显著性差异(****)。
实施例1、7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂他莫昔芬在体外有效抑制VSV和ZIKV病毒的感染
为了检测他莫昔芬对细胞内及细胞膜上胆固醇的影响，本发明人用10um的他莫昔芬处理小鼠原代腹腔巨噬细胞，利用LC/MS检测手段以及Filipin III(结合膜上胆固醇)染色胆固醇的含量。
为了检测他莫昔芬对宿主细胞I型干扰素IFN-β表达的调控作用，用10um的他莫昔芬处理小鼠原代腹腔巨噬细胞，经病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞6小时，qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。
为了检测他莫昔芬对VSV病毒的清除能力，10um的他莫昔芬处理小鼠原代巨噬细胞2小时后，经病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞12小时，荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的荧光强度，并通过流式细胞仪检测VSV-GFP阳性巨噬细胞的平均荧光强度。
对于ZIKV病毒，用10um的他莫昔芬处理A549细胞2小时后，用ZIKV(MOI 5)病毒感染细胞。30小时后，收集细胞做qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。
为了检测他莫昔芬对ZIKV病毒的清除情况，用10um的他莫昔芬处理A549细胞2小时后，用ZIKV(MOI 0.1)病毒感染细胞。48小时后，分别收集细胞和上清做qPCR和病毒滴度检测寨卡病毒的载量。
实验结果表明，与对照组(Vehicle)相比，他莫昔芬能够明显降低巨噬细胞内以及膜上的胆固醇含量(图1a和1b)，此外他莫昔芬显著促进I型干扰素IFN-β的产生(图1c)，并明显地抑制VSV-GFP的复制(图1d和1e)；他莫昔芬对于寨卡病毒ZIKV的感染，显著地促进A594细胞对于ZIKV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图1f)，同时也能有效抑制ZIKV病毒在A549细胞中的复制(图1g)，并降低病毒的载量(图1h)。
实施例2、他莫昔芬提高动物抵御致死性剂量VSV病毒的感染
用他莫昔芬(25mg/kg，腹腔注射)或等量溶剂(Vehicle)对C57BL/6小鼠进行预处理，连续3天给药后。一部分小鼠取外周血检测血清中胆固醇含量。另一部分小鼠感染致死剂量的VSV-GFP病毒(1×107PFU/g，静脉注射)，实验流程如图所示(图2a)。感染3小时后，尾静脉采血50ul，检测I型干扰素IFN-β的蛋白含量。每天观察病征和死亡情况，直到感染后6天。Log-rank(Mantel-Cox)分析比较对照组或他莫昔芬处理组小鼠在经VSV毒感染后的存活情况。通过病理切片检测肝脏组织中病毒的复制并通过用qPCR检测病毒的载量。
实验结果显示，与对照组相比：他莫昔芬处理组，小鼠血清中胆固醇含量明显减少(图2b)；感染病毒3小时后血清中I型干扰素IFN-β的蛋白含量是显著增加(图2c)，同时小鼠的存活能力更强(图2d)，肝脏中VSV-GFP的含量是显著降低的(图2e和2f)。
实施例3、DHCR7缺失或抑制剂AY9944处理的巨噬细胞降低了胆固醇的含量并增强I型干扰素的产生，且效果强于他汀类药物的抗病毒功能
为了检测DHCR7的缺失对巨噬细胞胆固醇的影响，取小鼠腹腔巨噬细胞，利用LC/MS检测手段以及Filipin III(结合膜上胆固醇)染色胆固醇的含量。
为了检测DHCR7的缺失对巨噬细胞抗病毒功能的影响，取DHCR7缺失及WT小鼠腹腔巨噬细胞，经病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞6小时，qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。感染12小时，荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的荧光强度。
为了检测DHCR7的抑制剂AY9944对巨噬细胞胆固醇的影响，取小鼠腹腔巨噬细胞，利用LC/MS检测手段以及Filipin III(结合膜上胆固醇)染色胆固醇的含量。为了检测DHCR7的抑制剂AY9944对小鼠血清中胆固醇的影响，AY9944(25mg/kg，腹腔注射)或等量溶剂(Vehicle)对C57BL/6小鼠进行预处理，连续3天给药后，采血利用LC/MS检测血清中胆固醇的含量。
为了比较不同胆固醇抑制剂对宿主细胞I型干扰素IFN-β产生的影响，本发明人用10um的AY9944和10um的Statin分别处理小鼠原代巨噬细胞，经病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞6小时，qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。
实验结果显示，与WT相比，DHCR7缺失的巨噬细胞中或细胞膜上的胆固醇含量是降低的(图3a和3b)；病毒的感染能显著促进I型干扰素IFN-β的表达并抑制病毒的复制(图3c和3d)。DHCR7的抑制剂AY9944也显著降低巨噬细胞中或细胞膜上的胆固醇含量(图3e和3f)，以及小鼠血清中的胆固醇含量(图3g)。
此外，在促进I型干扰素IFN-β的产生上，DHCR7的抑制剂AY9944明显优于HMGCR的抑制剂他汀类药物(Statin)(图3h)。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
上海大学
<120> 阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用
<130> 19A398
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 1
gactgccccc gcattggata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 2
cccgcattgg atatagctac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 3
gugguuugac uucaagcug 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 4
caccaaacug aaguucgac 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 5
tcacctacag ggcggacttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 6
tctctgctcg gaccaccatc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 7
ttggcaagta tgctaagtca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 8
aggacttgag atactcacga a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 9
ggtcagcgtc ctctctaata aacg 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 10
gcaccctagt gtccactttt tcc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 11
cgttgacatc cgtaaagacc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 多核苷酸(Polynucleotide)
<400> 12
taggagccag agcagtaatc 20

Claims (16)

1.7-脱氢胆固醇还原酶下调剂的用途，用于：
制备预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制的组合物；
制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物；
制备降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物的组合物；和/或
制备预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂包括：
特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物；
特异性干扰7-脱氢胆固醇还原酶基因表达的干扰分子；
特异性下调7-脱氢胆固醇还原酶基因的基因编辑试剂；或
特异性与7-脱氢胆固醇还原酶基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂是特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物，其包括：AY9944或除AY9944以外的DHCR7下调剂；较佳地包括：他莫昔芬。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的7-脱氢胆固醇还原酶下调剂是靶向缺失7-脱氢胆固醇还原酶基因的干扰分子或基因编辑试剂；较佳地，所述干扰分子为以SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的核酸制备的干扰分子；或所述基因编辑试剂为以SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示序列的核酸制备的基于Cas9的试剂。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，其特征在于，所述的病原微生物包括病毒；较佳地包括能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地包括：寨卡病毒，水疱性口炎病毒等DNA或RNA病毒。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的降低胆固醇或调控胆固醇代谢产物是降低外周血胆固醇或调控外周血胆固醇代谢产物；较佳地降低血清胆固醇或调控血清胆固醇代谢产物；或
所述的降低胆固醇或调控胆固醇代谢产物是降低巨噬细胞的膜胆固醇或调控巨噬细胞中胆固醇代谢产物。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的病原微生物感染相关肝病、或高胆固醇或高脂相关肝病包括：高脂血症，高胆固醇血症，肝癌，脂肪肝，肝硬化，动脉粥样硬化。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物，所述7-脱氢胆固醇还原酶下调剂与药学上可接受的载体混合。
9.一种体外非治疗性抑制病原微生物的方法，其特征在于，包括：以7-脱氢胆固醇还原酶下调剂处理感染病原微生物的对象；较佳地，所述的对象包括：感染病原微生物的宿主、细胞、细胞培养物、场所、容器、器物。
10.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有：
7-脱氢胆固醇还原酶下调剂；以及
至少一种有利于预防或治疗病原微生物感染的辅助药剂以及药学上可接受的载体；较佳地，所述预防或治疗病原微生物感染的辅助药剂包括阻断病毒自身复制的辅剂。
11.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：将7-脱氢胆固醇还原酶下调剂、至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂与药学上可接受的载体混合；所述的药物组合物用于：
预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制；
促进I型干扰素IFN-β表达；
降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物；和/或
预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病。
12.一种筛选预防、缓解或治疗病原微生物感染或抑制病原微生物复制，促进I型干扰素IFN-β表达，降低胆固醇或降脂或调控胆固醇代谢产物，和/或预防、缓解或治疗病原微生物感染相关肝病，或高胆固醇或高脂相关肝病的物质的方法，包括：
(1)用候选物质处理表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系；和
(2)检测所述体系中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性，则表明该候选物质是感兴趣的物质。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达7-脱氢胆固醇还原酶的体系；
如果测试组中7-脱氢胆固醇还原酶的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是感兴趣的物质。
14.如权利要求9～13任一所述，其特征在于，所述的病原微生物包括病毒；较佳地包括能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地包括：寨卡病毒，水疱性口炎病毒等DNA或RNA病毒。
15.如权利要求9～11任一所述，其特征在于，所述7-脱氢胆固醇还原酶下调剂包括：特异性抑制7-脱氢胆固醇还原酶的小分子化合物，特异性干扰7-脱氢胆固醇还原酶基因表达的干扰分子，特异性敲除7-脱氢胆固醇还原酶基因的基因编辑试剂，或特异性与7-脱氢胆固醇还原酶基因编码的蛋白结合的抗体或配体；更佳地，所述小分子化合物包括：他莫昔芬以及研发的特异性下调7-脱氢胆固醇还原酶活性的新型小分子化合物。
16.如权利要求15所述，其特征在于，所述干扰分子为以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的核酸制备的干扰分子；或所述基因编辑试剂为以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的核酸制备的基于Cas9的试剂。
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