CN113082000B

CN113082000B - Bs固体脂质纳米递药系统的制备方法及应用

Info

Publication number: CN113082000B
Application number: CN202110478685.0A
Authority: CN
Inventors: 曹思思; 史磊; 张向辉; 单林; 杨清; 陆金莹; 王欢
Original assignee: Harbin Vocational and Technical College
Current assignee: Harbin Vocational and Technical College
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN113082000A

Abstract

本发明公开了一种BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：S01，制备有机相；S02，制备水相；S03，制备含药有机相，并用注射器在1000rpm的磁力搅拌的条件下、以1滴/秒的速度将含药有机相连续注入水相中，注射完毕后磁力搅拌1.5h，获得混合相；S04，低温固化1h，低温固化时在1000rpm磁力搅拌下加入5mg/mL的酪蛋白乳糖钠NaCas‑Lac水溶液作为混合相的稳定剂。本发明还公开了BS固体脂质纳米递药系统在制备肝靶向试剂以及长循环试剂中的应用。本发明采用乳化溶剂蒸发法制备的固体脂质纳米粒溶液，粒径较小(≤120nm)，分布窄且均匀，Zeta电位绝对值较大，包封率和载药量高。

Description

BS固体脂质纳米递药系统的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及BS固体脂质纳米递药系统的制备方法及应用，属于制药技术领域。

背景技术

中药为中华民族的生存和繁衍做出了不可磨灭的贡献。在人类回归大自然的国际潮流中，人们对自身的保健意识不断提高，世界各国对包括中药在内的天然药物日益重视。统计数据显示，全球范围内约有80％的人群把天然药物作为其日常保健医疗手段，全球包括中药在内的植物药销售额正以每年10％的增幅递增，而部分西方发达国家市场植物药的年增长率更是超过了20％，远远超过了化药的增长速度。

随着纳米技术在药物研发领域的不断渗透和影响，以纳米中药、天然药物为代表的研发工作已经具备了一定理论基础和实践的可行性。在国外，纳米技术早已经应用到植物药的开发上，美FDA登记的有关紫杉醇的11个在研制剂中，涉及纳米制剂的就有7个。在国内，作为中药资源丰富的国家，我国政府和科技人员十分重视将纳米技术引入中药领域，从而带来全新的中药制备方法和工艺，加速传统中药向产业化、现代化、国际化发展的步伐。目前，纳米中药主要研究黄酮、皂苷、萜类、挥发油和甾体类等药理作用明确和现有产品市场占有率较高的药物，适应证主要为心脑血管疾病、癌症、风湿性疾病、骨质疏松等。与化学药物相比，我国在中药纳米制剂的研究和应用尚处于发展阶段，但也已取得了一些令人瞩目的成绩。目前已有注射用紫杉醇脂质体、益肝灵纳米粒口服液(灯盏花素)、注射用熊果酸纳米脂质体、康莱特注射液(薏苡仁油脂肪乳)等多个采用纳米技术研制的新药上市或进人临床。

目前，对中药纳米制剂的研究多集中在单味药的单一成分上，例如蓖麻毒蛋白、雷公藤内酯醇、紫杉醇、喜树碱、鸦胆子油等，这些药物的粒径要达到纳米级没什么问题。然而对于在中药中占大多数的植物药，之前常采用的方法就是将其超微粉碎后直接入药或进行提取处理，大多数植物药材是难以得到纳米级粉末的，必须通过现代制剂技术等手段实现中药的纳米化。中药组成复方后成分十分复杂，且作用具有多靶点性，中药单味药或复方经过纳米化处理将导致物理化学性质、功效、生物活性、毒副作用等产生变化。

药物纳米相态下功能有可能被加强，有可能被削弱，亦有可能被消除，还有可能呈现出新的功效，药物的毒副作用也有可能发生变化。此外，中医方剂中的君臣佐使法则是方剂配伍的基本理论，是在中医药学理论指导下派生而来的用于解释传统方剂结构关系和作用机制、创立和研制新方剂的重要原则。中药复方各药的配伍在作用上既不是简单的相加，也不是毒副作用机械的抵消，而是通过配伍使药物间发生复杂的相互作用，使之产生质的改变。将中药复方进行纳米化处理，是否会对方剂配伍中药味的君臣佐使关系产生影响，是否会发生吸收、分布、代谢、排泄、毒性过程的变化，是一个非常值得研究的基础问题。因此，对单味及复方中药如何进行纳米化是值得深入探讨的一个问题。

随着中药成分与机制研究的不断深入，越来越多的中药有效部位或多成分被发现具有较好的药理活性，中药多成分在治疗危害人类健康的重大疾病(心脑血管、肝病、肿瘤等)领域具有广阔的发展应用前景，并发挥了不可替代的治疗作用。但是，中药有效部位或多成分具有药理活性的同时，也存在诸多严峻的问题：如抗癌成分大都具有明显的毒副反应，治疗窗窄，如莪术油具有溶血不良反应，斑蝥有效部位对泌尿系统有强烈的刺激性、乌头总生物碱对神经系统具有毒性等；另一方面许多有效成分溶解度低(如齐墩果酸、葛根素等)、难吸收(如苦参素等)、半衰期短(如龙胆苦苷、丁香苦苷等)。中药多成分生物利用度低和安全性方面的问题已成为制约中药多成分临床应用的关键问题。如何解决这一问题，也成为制约中药递药系统发展的难点问题，迫切需要探索中药多成分新型递药系统制备方法，设计出适合中药多成分特点的现代递药系统，以提高中药多成分的治疗作用。

随着纳米递药系统在药物研发领域的渗透和影响，将中药多成分制成纳米粒，或将水溶性小及难溶性的药物加工成纳米粒，可提高药物的靶向性和生物利用度，增加药物的稳定性，增强疗效，减少毒性和不良反应，还可使药物进入到机体各级微细的组织管道和病变组织细胞中，纳米递药系统大幅度提高药物的定位性、时效性和有效性，从而有效地控制和治疗疾病。

虽然纳米技术在中医药领域积累了不少成功经验，将中药多成分形成纳米递药系统，无疑面临着平衡包封和均衡释放的问题。这是因为中药有效成分具有多样性的特点，其结构、理化性质和溶解度也存在着差异。纳米递药系统的平衡包封是指将化学性质相同或化学性质存在差异的中药多成分采用一种或一种以上的方法，将多种成分同时包封于纳米粒中，能够使其达到数均粒径小 (100-150nm)、平衡包封率高(各成分均达到最大包封率并保持比例相对稳定)，从而实现多成分纳米递药，提高生物利用度的目的。

另外，释药速度和靶向性也与纳米药物的载体材料性质及粒径大小密切相关。只有不断调整中药多成分包封工艺，筛选适宜的载体材料，才能使中药多成分同步包载和释放。

固体脂质纳米递药系统包括固体类脂纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)和纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)。SLN是一类新型纳米载药系统，它以长链饱和脂肪酸、脂肪酸甘油酯等体内可以降解且具有良好生物相容性的天然或合成的类脂材料为载体，将药物包覆、分散或吸附于类脂核中，制成粒径为50-1000nm的固体胶粒。SLN选用的高熔点脂质(如长碳链的饱和脂肪酸甘油三酯)，在室温下通常呈固体，既具有聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏慢、可以控制药物的释放以及良好的靶向性等优点，又具有脂质体、乳剂毒性低、能大规模生产的优点。SLN主要适合于负载亲油性药物，也可将亲水性药物通过酯化等方法制成脂溶性强的前体药物后再制备SLN。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术存在的上述问题，提供一种 BS固体脂质纳米递药系统的制备方法及应用，以克服现有技术的不足之处。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：

S01，将重量比为1:2的单硬脂酸甘油酯GMS和大豆卵磷脂SL分散于无水乙醇中，单硬脂酸甘油酯GMS与无水乙醇的重量体积比为5:1，超声使其溶解形成有机相；

S02，量取适量0.3％泊洛沙姆F68水溶液，形成水相；0.3％泊洛沙姆F68 水溶液与无水乙醇的体积比为2:1；

S03，分别精密称取适量马钱子碱B和士的宁S溶于有机相中，马钱子碱 B和士的宁S的加入量均与单硬脂酸甘油酯GMS的质量比为1:25，获得含药有机相，并用注射器在1000rpm的磁力搅拌的条件下、以1滴/秒的速度将含药有机相连续注入水相中，注射完毕后磁力搅拌1.5h，获得混合相；

S04，低温固化1h，低温固化时在1000rpm磁力搅拌下加入5mg/mL的酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac水溶液作为混合相的稳定剂，酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac 水溶液的加入量与无水乙醇的体积比6:10；获得BS固体脂质纳米递药系统 BS-SLN；

S05，冻干，得到BS-SLN冻干样品。

所述低温固化的方法为：在冰水混合物中固化。

所述BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN的粒径≤120nm。

所述BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN的总包封率及总载药量分别大于 48％和1％。

BS固体脂质纳米递药系统的制备方法获得的BS固体脂质纳米递药系统在制备肝靶向试剂中的应用。

BS固体脂质纳米递药系统的制备方法获得的BS固体脂质纳米递药系统在制备长循环试剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明以SL、F68和酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac共同作为稳定剂，对Bru 和Str进行平衡包封。SL、F68和酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac联合使用时，固体脂质纳米粒较为稳定且粒径较小，并且可以抑制积聚、改善体系粘稠度，并兼具减毒安全的特点。

2.本发明以无水乙醇或甲醇为有机溶剂时，BS-SLN粒径均为约110nm左右，Zeta电位的绝对值较高，纳米粒分散均匀，且药物的包封率与载药量均较高。另外，考虑到所选择的有机溶剂应具有低毒安全且对沸点要求较低，易于通过减压系统去除等特点。综上考虑，本发明采用无水乙醇作为有机溶剂制备 BS-SLN。

3.本发明发现，搅拌速率过低，导致粒径所能承载药量降低，还可导致乳滴分散不均，表面的单体聚合物形成包裹囊，导致粒径较大，电位偏低；搅拌速率过高，由于所形成的脂质体膜刚度不强，导致粒径越大药物越易从纳米粒中泄漏出来，造成载药量不高，并且又会因碰撞频率增大而使粒子之间更易聚集而导致粒径的增大。综上所述，本发明筛选磁力搅拌速度为1000rpm，可以达到包封率和载药量的峰值，同时BS-SLN的粒径小，为110nm。

4.本发明采用乳化溶剂蒸发法制备的固体脂质纳米粒溶液，外观具有淡蓝色乳光，粒径较小(≤120nm)，分布窄且均匀，Zeta电位绝对值较大，包封率和载药量相较其他方法高(传统的沉淀法制备的固体脂质纳米粒均包封效果不佳，包封率及载药量不高，粒径较大，超过150nm)，在TEM观察纳米粒呈大小均匀的圆球形，并且该方法操作简单。

5.本发明中，Bru和Str的极性相似，由于Bru是在Str的基础上引入了两个甲氧基，Bru极性比Str大，Bru更易于与载体结合，所以Bru更易于被包载于纳米粒中，本发明确定的重量比为1:2的单硬脂酸甘油酯GMS和大豆卵磷脂SL，这个比例可以对Bru和Str进行平衡包封。

6.本发明纳米粒制备时，由于Bru和Str药对的两个成分间由于分子量、理化性质等差异较小，因此存在微弱的竞争关系。在有限的载体材料中，所包封的药物能力有限，因此改变药物用量及二者比例时，对两个成分的包封率及载药量都会有一定影响。

附图说明

图1为本发明的最大紫外吸收图谱；其中，A为马钱子碱；B为士的宁； C为空白-SLN；

图2为本发明的液相检测图谱；其中，从上到下依次为：空白-SLN、对照品和BS-SLN；

图3为本发明的BS-SLN冻干样品的图片；

图4为本发明的BS-SLN冻干样品的粒度分布图；

图5为本发明的BS-SLN冻干样品的Zeta电位分布图；

图6为本发明的BS-SLN冻干样品的透射电镜图；其中，TEM(×43000)；

图7为本发明的释药曲线；其中，A为BS-SLN；B为游离药物；

图8为本发明的组织样品液相检测图谱；其中，从上到下依次为：空白血浆、添加了对照品的小鼠血浆样品和BS-SLN小鼠血浆样品；

图9为本发明静脉注射FITC后观察心肌细胞的显影图；

图10为本发明静脉注射FITC后观察肝细胞的显影图；

图11为本发明静脉注射FITC后观察脾细胞的显影图；

图12为本发明静脉注射FITC后观察肺细胞的显影图；

图13为本发明静脉注射FITC后观察肾细胞的显影图；

图14为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后观察心肌细胞的显影图；

图15为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后观察肝细胞的显影图；

图16为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后观察脾细胞的显影图；

图17为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后观察肺细胞的显影图；

图18为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后观察肾细胞的显影图；

图19为本发明静脉注射FITC-BS-SLN后活体肝组织细胞的显影图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：称取GMS(50mg) -SL(100mg)分散于10mL无水乙醇中，超声使其溶解形成有机相。量取0.3％F68 水溶液20mL形成水相。分别精密称取约2mgBru和2mgStr对照品溶于有机相中，并将有机相用1mL注射器在1000rpm的磁力搅拌的条件下，以1滴/秒的速度将含药有机相连续注入水相中，注射完毕后磁力搅拌1.5h，获得混合相；低温固化1h，低温固化时在1000rpm磁力搅拌下加入5mg/mL的酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac水溶液6mL作为混合相的稳定剂，获得BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN；冻干，得到BS-SLN冻干样品。按照上述工艺制备所得的BS-SLN 冻干样品为具有淡蓝色乳光的液体，为长期保存保持BS-SLN的理化稳定性，对液体样品进行冻干，得到BS-SLN冻干样品。

1.马钱子碱和士的宁体外分析方法的建立

1.1吸收波长的考察

以甲醇为空白对照溶液，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，紫外吸收结果见图1。由图1可知，马钱子碱在265.7nm和301.2nm处有较大吸收峰，士的宁在224.4nm处有较大吸收峰，相应浓度的空白纳米粒基本无干扰，综合考虑，选择265nm为马钱子碱与士的宁的检测波长，可同时测定马钱子碱与士的宁。

1.2色谱条件

检测波长为265nm；流速为1.0mL/min；柱温设置30℃；进样量为10μL。等度洗脱，流动相：乙腈(21％)-[0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液与0.02mol/L KH₂PO₄的等量混合液(10％磷酸调pH2.8)](79％)。

1.3对照品溶液制备

分别称取马钱子碱Bru(4.40mg)、士的宁Str(2.70mg)对照品至25mL 容量瓶内，定容(甲醇溶解)，即得浓度为别为Bru 176.00μg/mL、Str 108.00μg/mL 的双对照品储备溶液。

1.4供试品溶液的制备

精密称取50.00mg的单硬脂酸甘油酯(GMS)、100.00mg大豆卵磷脂(SL)、 1.77mgBru、1.64mg Str分散于10mL无水乙醇中，超声溶解形成有机相。有机相采用1mL注射器在磁力搅拌下注入到20mL含0.3％F68的水相中(65℃ 水浴加热)，注射完毕用磁力搅拌器搅拌1.5h并始终保持65℃水浴加热，低温固化1h，低温固化时在1000rpm磁力搅拌下加入5mg/mL的酪蛋白乳糖钠 NaCas-Lac水溶液6mL作为混合相的稳定剂，获得BS固体脂质纳米递药系统 BS-SLN；蒸发除去有机溶剂(终体积约为初始体积的1/3)，0.3％的F68定容至50mL，即得BS-SLN供试品溶液。Blank-SLN的制备方法与上述方法相同，即在制备过程中不加入对照品。

1.5标准曲线绘制

分别精密量取“对照品溶液制备”项下的对照品储备液1mL、2mL、3mL、 4mL、5mL于10mL容量瓶中，甲醇定容即得混合梯度标准溶液。Bru对照品浓度依次为17.60μg/mL，35.20μg/mL，52.80μg/mL，70.40μg/mL，88.00μg/mL； Str对照品浓度依次为10.80μg/mL、21.60μg/mL、32.40μg/mL、43.20μg/mL、 54.00μg/mL。

1.6测定

分别以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，制备标准曲线，马钱子碱线性方程为：Y＝23130X-643.7(R²＝0.9997)；士的宁线性方程为 Y＝35521X-4130.9(R²＝0.9995)。结果表明Bru在17.60～88.00μg/mL范围内， Str在10.80～54.00μg/mL范围内均呈良好的线性关系。

本发明的液相检测方法能够在同一条件下测定Bru和Str的同时，还能增大这两种物质的峰保留时间。

2.包封率的测定

2.1方法与结果

葡聚糖凝胶柱色谱法(GFC)按“1.4供试品制备”项下制备脂质纳米粒供试品，精密量取供试品溶液2mL，加到已经预先制备好的Sephadex G-50凝胶柱顶部，采用蒸馏水以流速1mL/min进行洗脱，每2mL溶液收集为一个样品，收集12mL～28mL洗脱液(即6～14样号样品)共16mL，量取该溶液适量加入加少量甲醇超声破乳，甲醇定容，该部分为脂质纳米粒部分；再收集 32mL～54mL体积的洗脱液为游离药物。通过分离先出柱的脂质纳米粒和后出柱游离药物，分离游离药物至50mL容量瓶中混合均匀，定容，过0.22μm微孔滤膜，采用HPLC法测定(进样10μL)，以游离药物的量计算包封率、载药量。

在实验操作过程中已知投药量以及辅料用量，通过以下公式计算包封率以及载药量。

包封率以及载药量计算公式为：

EE％为包封率，DL％为载药量，W_总为样品溶液中总的投药量，W_游离为样品溶液中游离药物的量，W_p为总的载体材料量。

采用上述葡聚糖凝胶柱色谱法分离游离药物3次，并计算包封率和载药量的平均值，包封率为40.66±0.67，RSD％＝1.65％；载药量为1.03±0.03， RSD％＝2.75％。

本发明的葡聚糖凝胶柱色谱法包封率高且偏差值较小，通过验证其方法可靠，所测得值接近真实值。

并且本发明的葡聚糖凝胶柱色谱法，Bru和Str的平均回收率分别为96.72％和96.00％，RSD％分别为1.51％和0.68％。通过实验测定表明，Sephadex G-50 凝胶柱回收率符合测定要求。

通过粒径分析仪检测本实验所确定包封方法制备的固体脂质纳米粒粒径为110nm。

3.方法与结果

3.1.外观形态

本发明采用特定的乳化溶剂挥发法进行样品制备，进行冻干得到BS-SLN 冻干样品，样品外观表面平整，质地疏松，形成外观规则且统一的固体粉末，具体见图3。

3.2.粒度分布与Zeta电位的测定

制备BS-SLN，将样品进行冻干，并用蒸馏水将样品稀释到一定体积，按指定时间超声处理，使纳米粒均匀分散，过滤处理(0.45μm微孔滤膜)，采用仪器进行粒径测定和Zeta电位测定，每个样品进行3次平行测定。通过测定结果可知，纳米粒冻干粉的粒径、Zeta电位和PDI值依次分别为122.70±2.11nm、 -30.9±1.16mV、0.22±0.01，粒径分布良好。结果见图4和图5。

3.3.透射电镜分析

制备BS-SLN冻干粉，加蒸馏水复溶，过滤处理(0.45μm微孔滤膜)，将滤液滴至覆有支持膜的铜网上自然晾干2～3min，用吸水纸除去表面吸附的水分，滴入浓度为2％的磷钨酸溶液，染色2～3min，自然晾干后，用透射电子显微镜观察BS-SLN的形态并拍照，结果见图6。如图6所示，BS-SLN具有实心圆球形状，透射电镜观察粒径测定大小与激光粒度测定仪测定结果相符。

3.4.体外释药性能考察

本发明选用pH7.4 PBS作为释放溶液介质进行释放度考察，本发明选用动态透析法用以研究纳米粒的释放度。操作过程如下：精密称取已经制备好的 BS-SLN样品冻干粉置于指定体积的pH7.4PBS溶液中溶解，得到BS-SLN PBS 试液；移液器精密量取BS-SLN PBS试液5mL，转入已预处理的透析袋内，将透析袋的两端系紧并放入100mL大烧杯中，透析袋外液为50mL pH7.4 PBS溶液，整个烧杯采用避光保存，并置于恒温(37±0.5℃)水浴振荡器中以100rpm恒速振摇，分别于指定时间点(0.25h-144h，具体时间点见表1)吸取1mL透析外液，吸取后补充同等条件(温度、浓度)释放液。并每隔12h更换一次透析释放液，以保证在整个采用样周期条件的一致性，避免对实验产生影响。

取得的释放液样品采用HPLC法进行测定，用来检测释放介质中含药量，并累积计算各时间点BS-SLN的释放率，以累积释药百分率(Y)对时间(X) 作图，绘制纳米粒的释药曲线。另外，精密量取“1.4供试品制备”项下供试品溶液中的游离药物，含药量通过计算与上述制备样品相同的药液体积，于 pH7.4的PBS溶液中定容至5mL转入处理好的透析袋内，同上操作。计算各样品的累积释药百分数见表1，累积释放率(Y)对时间(X)绘制体外释药曲线，结果示意图见图7。各时间点累积释放率(Q)的计算公式为：

式中C_t为在各时间点测得释放介质中的药物浓度(mg/mL)，W为投入药物的总重量(mg)，V₀为释放介质的总体积，V为每次取样的体积。

表1 BS-SLN的体外释药表(n＝3)

由表1和图7可见，在0.5h，BS游离药物中Bru和Str释放度分别约为 55％、35％，BS-SLN中Bru和Str的释放度分别约为9％和14％；在4h时，游离药物中两药的释放度Bru小于78％，Str小于88％，而BS-SLN药对的释放度，Bru小于27％，Str小于36％；在8h时，游离药物两药释放度达到90％以上，而BS-SLN药对中两药的释放度在36％～45％之间；96h时，BS-SLN药对中两药的释放度已恒定在70％以上，游离药物中两药的释放度已于8h恒定；在144h时，BS-SLN药对中两药的释放度中的Bru为78％左右，Str为87％左右。由此可见，将Bru和Str制成BS-SLN后，具有可控的缓释效果。另外，由于药物自身属性原因，导致释放率存在差异，Str释放速率较快，在同一时间点Str的累积释放量大于Bru的累积释放量，分析原因可能是因为Str的极性比Bru小，更易于从脂质纳米粒中释放。

通过释放曲线，则清楚地反映了药物从BS-SLN中释放突释和缓释行为。释放实验的初期药物表现突释的现象，随后释药曲线趋于平稳。从释药曲线可以推断，固体脂质纳米粒由脂质构成的骨架结构，这种结构可以溶于溶液，而药物以分子或微晶形态分散于骨架中。由于固体脂质纳米粒的颗粒很小，导致比表面积大(表面能大)，药物极易吸附在于纳米粒表面，或沉淀于基质表面，从而产生了释放曲线初级阶段的药物突释现象。在纳米乳冷却过程中，温度持续降低，药物在水相(表面活性剂溶液)中溶解度呈现先降低，之后重新被分配到基质中，当温度升高到基质熔点时，含药的固态核逐渐形成。当温度继续下降过程中，药物被进一步由水相分配到基质相中，直到晶核达到极限(不再容纳药物分子)，此时的药物主要集中在以溶液形式存在的颗粒外层，其余过量的药物只能附在颗粒表面上，因此就如图7所示产生突释现象。药物具有持续且缓慢释放的特征，这就说明了药物的释放速率是由刚性基质扩散的时间所决定的。

综上所述，BS-SLN特性研究结果表明，纳米粒冻干前为淡蓝色具有乳光溶体，冻干后为质地疏松的白色固体粉末，冻干前后粒径、Zeta电位、包封率与载药量基本无变化。在透射电镜下BS-SLN呈完整的实心圆球形状，性状良好。BS-SLN的释放具有缓释效果，Str的释放速率大于Bru的释药速率。

4.药动学参数

大鼠尾静脉注射BS-SLN和BS溶液后，体内行为均符合二室模型。BS-SLN 中Bru的T_1/2(α)、T_1/2(β)分别是BS中Bru的1.22倍和1.80倍，AUC值是BS中 Bru的5.31倍，存在显著性差异(P<0.01)，血浆清除率仅为BS溶液中Bru的 0.33倍，有显著差异(P<0.01)。而BS-SLN中Str的T_1/2(α)、T_1/2(β)为BS中Str 的1.06倍和2.55倍，AUC值为4.01倍，差异显著(P<0.05)，血浆清除率仅为BS溶液中Str的0.32，差异显著(P<0.01)。由此可见，将Bru和Str制备成纳米粒后，其药物代谢动力学参数明显改变，并能显著延长大鼠体内二者的半衰期和滞留时间，清除率显著降低，AUC值增大，提高了两药物的生物利用度，发挥长效作用。

5.生物样品中Bru和Str分析方法的建立

5.1.色谱条件

检测波长为265nm；流速为1.0mL/min；柱温设置30℃；进样量为10μL。等度洗脱，流动相：乙腈(21％)-[0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液与0.02mol/LKH₂PO₄的等量混合液(10％磷酸调pH2.8)](79％)。

5.2.样品处理方法

5.2.1.萃取溶剂的选择

氨水预处理后加入氯仿再处理，所得回收率为87％～96％之间，效果最佳。

5.2.2.组织样品处理方法

分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾作为组织样品，以生理盐水清洗样品表面残留血液，用滤纸将表面吸干，精密进行称重，加入生理盐水1mL，将组织样品快速匀浆制备成匀浆液。取组织样品匀浆液0.5mL于10mL尖底离心管中，加入氨水50μL后涡旋30s进行预处理，之后加萃取溶剂氯仿2.5mL涡旋3min。将所得样品超声20min充分萃取，静置一小时。低温离心5min，转数为 5000r/min。将下层氯仿溶液全部吸取留用。将上层血浆液另取出置于离心管中，再加1mL氯仿重复萃取，以上步骤重复操作，取下层氯仿溶液与第一次留用的氯仿溶液合并后，37℃水浴，氮气吹干。加100μL甲醇涡旋2min复溶后，过0.22μm微孔滤膜，进样50μL。所得峰面积代入标准曲线，计算组织样品中各时间点的药物浓度。

5.2.3专属性考察

分别制备小鼠心、肝、脾、肺、肾的空白组织匀浆液和空白血浆，加标准品的组织匀浆液以及尾静脉注射后的血浆和各组织匀浆液，具体操作按照5.2.2 项下“样品处理方法”进行，HPLC法分析，进样量50μL，得到色谱图。结果见图8。由检测得到的小鼠各组织和空白血浆样品的液相色谱图可知，样品处理方法理想，液相条件的选择适宜，血浆及组织样品中内源性物质对Bru和 Str的检测没有影响，因此本方法的保留时间合适，专属性良好，符合生物样品中药物的检测。

本实验应用HPLC建立了小鼠组织中Bru和Str浓度的测定方法，各组织中的内源性物质对检测不构成干扰，方法的回收率、精密度符合检测要求，结果表明，本实验所建立的方法灵敏度高，专属性强，可用于生物样品中Bru和 Str的测定。

5.3.线性回归方程

5.3.1.对照品溶液的配制

制备Bru和Str对照品溶液：分别精密称取10mg的Bru和Str的标准品，置于100mL的容量瓶中，配制标准品溶液浓度为100.00μg/mL。分别将精密量取的标准品储备液置于容量瓶中，加入适量甲醇稀释至刻度，浓度为 0.05μg/mL、0.10μg/mL、1.20μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL的系列标准溶液备用。

5.3.2.小鼠生物样品线性回归方程

精密吸取200μLBru和Str系列标准溶液，置于10mL的尖底离心管中，分别精密加入100μL的心、肝、脾、肺、肾空白组织匀浆液，涡旋5min使其充分混合，20min超声后，按照5.2.2项下“样品处理方法”进行操作，进样量为50μL，记录色谱图。纵坐标为峰面积，横坐标为各个浓度C(μg/mL)，以加权最小二乘法进行线性回归运算，得到标准曲线方程。由表2可知，心、肝、脾、肺、肾测定的线性范围均为：0.05μg/mL～5.00μg/mL。

表2不同小鼠组织匀浆液中的Bru和Str标准曲线

本实验应用HPLC建立了小鼠组织中Bru和Str浓度的测定方法，各组织中的内源性物质对检测不构成干扰，方法的回收率、精密度符合检测要求，结果表明，本实验所建立的方法灵敏度高，专属性强，可用于生物样品中Bru和Str的测定。

6.小鼠体内分布研究

本部分研究选取小鼠为试验动物，给药途径为尾静脉注射，小鼠体内药物的含量测定采用HPLC法，配制Bru和Str生理盐水溶液作为对照组，研究 BS-SLN在小鼠体内组织的分布情况，并通过参数来评价BS-SLN的靶向性。

6.1.实验方法

将60只昆明小鼠随机分为两组，即BS-SLN组和BS生理盐水组，实验动物给药前禁食不禁水。于12h后采用尾静脉注射给药，给药剂量10mg/kg。

于尾静脉注射给药后0.08、0.42、1、2、3h将小鼠脱臼处死，快速取出心、肝、脾、肺、肾，将其用生理盐水洗净表面残留的血迹，并将表面水分用滤纸吸干，按5.2.2项下要求进行操作，制备实验所需的组织样品，按之前建立的 HPLC色谱条件进行分析。

6.2.实验结果

6.2.1.各组织中的药物实测浓度

按照实验设计将两组小鼠分别尾静脉注射给予BS-SLN和BS生理盐水，给药后测定设定时间点心、肝、脾、肺、肾中Bru和Str浓度。Bru和Str的经时浓度变化的结果见表3至表6。由此可知，小鼠给药后Bru和Str两药的浓度以肝脏为最高，药物浓度最低的组织为心；与BS生理盐水组相比，BS-SLN 组药物的浓度较高，且衰减速度显著减慢。BS溶液组与BS-SLN组比较说明， BS-SLN组的肝靶向性很强，给予BS-SLN后，药物在肝组织中快速富集，较少分布于其他组织中。可见，BS-SLN有效保证了Bru和Str被体内酶类等物质破坏而显示出一定的缓释作用。

表3小鼠静脉注射BS-SLN后血浆和组织中Bru的浓度(n＝6)

表4小鼠静脉注射BS-SLN后血浆和组织中Str的浓度(n＝6)

表5小鼠静脉注射BS后血浆和组织中Bru的浓度(n＝6)

表6小鼠静脉注射BS后血浆和组织中Str的浓度(n＝6)

6.2.2.靶向性评价

本实验以相对摄取率(Relative uptake efficiency，RUE)、峰浓度比值(C_e) 以及相对靶向率(Relative targeting efficiency，RTE)作为指标进行靶向性评价。

6.2.2.1.峰浓度比值C_e

峰浓度比值(C_e)为载药纳米粒与对照制剂在各组织中峰浓度的比值。 C_e＝(C_max)_SLN/(C_max)_solution，其中C_e为峰浓度，C_SLN和C_solution分别表示纳米粒和对照制剂溶液。与BS生理盐水组相比，BS-SLN组在肝脏的峰浓度比值Ce为 1.41，表明将药物制成纳米粒可显著提高肝组织内药物的含量，而其他组织Ce 值均小于肝组织的Ce值，说明肝脏为蓄积纳米药物的重要组织。

6.2.2.2.相对摄取率RUE

相对摄取率(Relative uptake efficieney，RUE)定义为体内各组织或器官中的载药制剂与单纯药物溶液的药时曲线下面积的比值，反映了将药物制成制剂后药物在组织或器官中吸收的影响。RUE＝AUC_SLN/AUC_solution，AUC_SLN表示载药纳米粒在靶器官中药时曲线下面积，AUC_solution表示药物溶液在靶器官中药时曲线下面积。RUE值愈大摄取能力愈强。实验结果表明，BS-SLN可显著提高肝组织中药物的RUE值，其值可达1.98，可见，经过药物制成纳米制剂可增强其在肝组织的摄取率。在其他组织中RUE值小于1.20，则表明肝脏为最大的靶器官。

6.2.2.3.相对靶向率RTE

相对靶向率(Relative targeting efficiency，RTE)是相对于对照制剂药物在组织中的分布比率。当RTE＞0时，相比于对照制剂，组织中药物的分布提高，即制剂的靶向效率提高。AUC_总＝AUC_肝+AUC_脾+...+AUC_肺， RTE＝[(AUC_靶器官/AUC_总)SLN-(AUC_靶器官/AUC_总)对照制剂]/(AUC_靶器官/AUC _总)对照制剂；AU_靶器官表示同一制剂在各靶器官中的药-时曲线下面积；AUC_总表示同一制剂药-时曲线下面积的总和。表7显示，BS-SLN可明显提高药物在肝组织中的靶向效率，其RTE值可达5.07％。同时，载药纳米粒也明显降低了药物在心、肾、脾、肺的靶向性。由此可见，载药纳米粒也明显降低了药物对其他器官或组织的毒副作用。

表7小鼠静脉注射BS-SLN和BS对照制剂后靶器官中BS的靶向性

本发明制备的BS-SLN属于被动靶向制剂，这种被动靶向性受粒径的影响较大，粒径在100～200nm范围的纳米粒可到达肝枯否细胞溶酶体中；粒径过大导致纳米粒被RES吞噬，到达网状内皮细胞丰富的肝和脾组织；粒径50～ 100nm的粒子可进入肝实质细胞；粒径小于50nm的纳米粒则可穿透肝、胰、肠、胃的毛细管内皮，或通过淋巴传递到达骨髓和脾脏细胞，甚至能够穿过血脑屏障进入脑组织；粒径小于10nm微粒则可富集于骨髓。本发明所制备 BS-SLN的粒径在110nm左右，表明其具有良好的肝靶向性和缓释作用，对于临床上治疗肝脏相关的疾病具有重要的意义。

7.基于FIVE技术的靶向性研究

荧光内窥式激光共聚焦成像系统(Fluorescence In Vivo Endomicroscopy，FIVE)可以完成活体动物体内细胞水平的实时监测。

7.1实验方法

7.1.1 FITC-BS-SLN制备

加热条件下将5mgFITC荧光物质充分溶解于有机相中，按纳米粒载药方法包载FITC荧光物质，制备得到FITC-BS-SLN纳米粒，将预制好的纳米粒通过葡聚糖凝胶柱，将纳米粒部分截留，游离FITC弃掉，即得到实验所需的荧光纳米粒。

7.1.2实验操作过程

离体组织细胞检测

选取健康昆明种小鼠24只，雌雄各半，随机分为FITC溶液组和 FITC-BS-SLN组。实验动物于给药前12h禁食不禁水，给药方式为尾静脉注射，注射剂量为10mg/kg。各组在5min，25min，60min及120min处死动物，取心、肝、脾、肺和肾组织细胞检测。

活体肝组织细胞实时监测

选取健康昆明种小鼠12只，雌雄各半，随机分为FITC溶液组和 FITC-BS-SLN组。实验前禁食不禁水，均腹腔注射2％戊巴比妥钠(0.1mL/20g) 使小鼠深度麻醉后，尾静脉注射给药(10mg/kg)。通过小鼠肝脏部位做微创手术，将共聚焦显微镜探针置于肝脏组织中，各实验组在60min，90min，120min， 180min，240min进行实时拍照。

7.1.3实验结果

7.1.3.1离体组织细胞观测

采用荧光内窥式激光共聚焦成像系统观测给予FITC溶液和FITC-BS-SLN 后，在预设时间点各组织细胞的照片进行定性分析，由图9～图13可知，FITC 溶液组荧光较弱，除肝肾细胞清晰外其它细胞轮廓不清晰，且1h后所有细胞荧光均完全消失，说明FITC代谢较快，对组织测定干扰较小，可用于荧光标记BS-SLN。图14～图18表明，FITC-BS-SLN可分布于心、肝、脾、肺及肾等组织细胞，在肝、肾、脾细胞的荧光强度明显高于肺及心细胞的荧光强度，且随着时间的延长，同一组织细胞的荧光强度有显著的变化。荧光强弱的差异也定性的表明BS-SLN具有良好的肝靶向性。

7.1.3.2活体肝组织细胞实时监测

采用荧光内窥式共聚焦成像系统，在预设时间点对肝细胞进行实时定位图像采集，由图19可知，给药5min后细胞间隙有荧光出现，但肝细胞轮廓清晰可见，说明纳米粒到达肝脏于细胞间质之间，尚未进入细胞内部；在给药25min 后，FITC-BS-SLN开始跨膜转移到细胞内部：先是紧贴细胞外壁，再是一半进入细胞一半留在细胞间质呈现跨膜状态，最后整个纳米粒紧贴细胞内壁完成跨膜；当给药60min后，大部分FITC-BS-SLN成功转移至肝细胞内部，图中亮点即为FITC-BS-SLN而细胞边界清晰，说明大多数纳米粒成功转移至胞内；在给药120min后，FITC-BS-SLN在肝细胞内大量聚集，有些亮点开始模糊。此后监测时间内，FITC-BS-SLN在细胞内大量聚集并逐渐消散，但细胞边界清晰，说明消散(纳米粒分解)在细胞内部完成。由此可见，BS-SLN不仅可以递药于肝组织，还可以将药物输送到肝细胞内。

小鼠尾静脉注射FITC-BS-SLN后，荧光强度随时间的推移逐渐增强，纳米粒则逐渐由细胞外进入细胞内，数量也有增加的趋势。因此，本实验不仅证实了纳米粒可到达肝脏，更能进入到肝细胞内部。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S02，量取适量0.3%泊洛沙姆F68水溶液，形成水相；0.3%泊洛沙姆F68水溶液与无水乙醇的体积比为2:1；

S03，分别精密称取适量马钱子碱B和士的宁S溶于有机相中，马钱子碱B和士的宁S的加入量均与单硬脂酸甘油酯GMS的质量比为1:25，获得含药有机相，并用注射器在1000rpm的磁力搅拌的条件下、以1滴/秒的速度将含药有机相连续注入水相中，注射完毕后磁力搅拌1.5h，获得混合相；

S04，低温固化1h，低温固化时在1000rpm磁力搅拌下加入5mg/mL的酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac水溶液作为混合相的稳定剂，酪蛋白乳糖钠NaCas-Lac水溶液的加入量与无水乙醇的体积比6:10；获得BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN；

S05，冻干，得到BS-SLN冻干样品；

BS-SLN冻干样品的PDI值为0.22±0.01。

2.根据权利要求1所述的BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述低温固化的方法为：在冰水混合物中固化。

3.根据权利要求1所述的BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN的粒径≤120nm。

4.根据权利要求1所述的BS固体脂质纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述BS固体脂质纳米递药系统BS-SLN的总包封率及总载药量分别大于48% 和1%。

5.根据权利要求1所述的BS固体脂质纳米递药系统的制备方法获得的BS固体脂质纳米递药系统在制备肝靶向试剂中的应用。

6.根据权利要求1所述的BS固体脂质纳米递药系统的制备方法获得的BS固体脂质纳米递药系统在制备长循环试剂中的应用。