CN113081909A - 黑云杉的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及黑云杉的新应用。本发明公开了黑云杉在制备助眠产品中的应用，本发明首次发现黑云杉提取物具有助眠功效，本发明黑云杉提取物可以缩短戊巴比妥钠诱导睡眠实验中小鼠的睡眠潜伏期时长，延长睡眠时间；增加失眠小鼠的体重；提高小鼠大脑海马区神经元数量；提高大脑各区域GABAARɑ1蛋白的表达量。

Description

黑云杉的新应用

技术领域

本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及黑云杉的新应用。

背景技术

随着生活压力的加大，人们的睡眠质量已得不到保证，已经严重影响到正常工作和学习。

目前，治疗失眠的方法主要有药物治疗和非药物治疗。药物治疗失眠是最有效的方法，但药物治疗还存在着药物依赖性、撤药反应等副作用。

非药物治疗主要有芳香疗法等，芳香疗法采用的药用成分主要为植物提取物。采用植物提取物的芳香疗法虽然治疗效果不如药物治疗效果快，但优势在于植物提取物纯天然，安全性高，几乎无药物依赖性、撤药反应等副作用。

黑云杉提取物具有抗菌、抗痉挛等作用。目前还未发现黑云杉提取物在助眠领域的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了黑云杉提取物在制备助眠产品中的应用，黑云杉提取物能有效缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间、提高大脑各区域神经元数量和GABAARɑ1蛋白的表达量，同时增加失眠小鼠的体重。

其具体技术方案如下：

本发明提供了黑云杉提取物在制备助眠产品中的应用。

本发明中，所述黑云杉提取物为黑云杉醇提物和/或黑云杉水提物。

优选地，所述黑云杉醇提物和黑云杉水提物均为黑云杉精油。

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中萃取的挥发性芳香油脂性液体，具有渗透性强和生物活性多样等特点，不同种类的精油有不同的功效。精油因其本身的天然特性和分子小、易进入人体达到特定效果的优点。因此，本发明所述黑云杉提取物优选为黑云杉精油。

本发明中，所述黑云杉提取物的原料取自黑云杉的叶、根、花、果实和茎中的一种或两种以上，优选取自黑云杉叶。

本发明采用戊巴比妥钠诱导睡眠时间试验，通过精油芳香疗法来检测精油对戊巴比妥钠睡眠实验小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间的影响。睡眠潜伏期即腹腔注射戊巴比妥钠后至翻正反射消失的时间，以PCPA模型组、空白对照组的数值为基准，各组别睡眠潜伏期缩短的幅度大小可以反映出精油助眠疗效好坏，睡眠时间也能较直观地表现出黑云杉精油的疗效好坏。结果显示本发明提供的黑云杉精油可以延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间，缩短睡眠潜伏时间。

进一步地，本发明采用尼氏染色检测实验小鼠神经元的数目。结果显示本发明提供的黑云杉精油可以提高小鼠大脑海马体区的正常神经元数量。

GABA即γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)，是中枢神经系统(CNS)中主要的抑制性神经递质，在睡眠中起着重要作用，是许多临床治疗失眠药物的重要靶点之一。而相关研究指出，镇静药物是通过GABAA受体的正向调节而增强-氨基丁酸(GABA)反应，即GABA受体，如GABAARɑ1可以一定程度上反映出药物舒眠安眠作用的强弱。

进一步地，本发明采用石蜡切片免疫组化检测小鼠大脑组织中GABAARɑ1蛋白的表达情况。结果显示本发明提供的黑云杉精油可以显著提高大脑组织中GABAARɑ1蛋白的表达。

进一步地，本发明还对小鼠造模前后、治疗前后的小鼠体重进行了测试。结果显示本发明提供的黑云杉精油治疗后，失眠小鼠的体重显著回升。

本发明中，所述黑云杉提取物在所述助眠产品中的质量含量为0.001％～10％。

本发明还提供了一种助眠产品，包括黑云杉提取物。

本发明中，所述黑云杉提取物为黑云杉精油。

本发明中，所述助眠产品的给药方式为闻吸、涂抹或香薰，优选为闻吸。

本发明中，所述助眠产品中黑云杉提取物的有效剂量为625μL/天/kg～2500μL/kg/天，优选为625μL/天/kg、1250μL/天/kg或2500μL/天/kg。

本发明中，所述助眠产品为日化产品。所述日化产品优选为化妆品、护肤品或洗护用品，具体为爽肤水、乳液、精华、面霜、精油、洗发水和护发素、香薰、蜡烛等。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明首次发现黑云杉提取物具有助眠功效，本发明黑云杉提取物可以缩短戊巴比妥钠诱导睡眠实验中小鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠时间；增加失眠小鼠的体重；提高小鼠大脑海马区神经元数量；提高大脑各区域GABAARɑ1蛋白的表达量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的各组小鼠睡眠潜伏期的测试结果图；

图2为本发明实施例提供的各组小鼠睡眠时间的测试结果图；

图3为本发明实施例提供的各组小鼠脑组织切片尼氏染色海马区神经元显微镜图(标尺为50μm)；

图4为本发明实施例提供的各组小鼠海马体区正常神经元数目统计图；

图5本发明实施例提供的各组小鼠大脑组织免疫组化切片中GABAARɑ1蛋白表达显微镜图(标尺为50μm)；

图6为本发明实施例提供的各组小鼠大脑组织免疫组化切片中GABAARɑ1蛋白表达柱状图；

图7为本发明实施例提供的各组小鼠体重变化折线图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，黑云杉精油购自雅琪实业(上海)有限公司。

实施例1

本实施例采用氯苯丙氨酸(PCPA)建立小鼠失眠模型

小鼠适应性饲养一周后开始造模。对氯苯丙氨酸PCPA混悬液现配现用，600mgPCPA粉末溶于20mL含1％Tween80的生理盐水中，配制浓度为30mg/mL。除空白对照组外，其余组按小鼠体重0.1mL/10g用量进行腹腔注射，空白对照组给予腹腔注射同体积的含1％的Tween的生理盐水进行腹腔注射，连续注射2日。在最后一次腹腔注PCPA结束后26-30h，小鼠出现行为学变化(白天活动不停，兴奋性增加，易激怒，昼夜节律消失，饮水量、进食量均增加，睡眠时间明显减少)，表明失眠模型造模成功。

实施例2

本实施例对黑云杉精油助眠效果进行验证

1、采用戊巴比妥钠动物睡眠时间试验检测不同浓度黑云杉精油对睡眠小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响

测试黑云杉精油对巴比妥类药物诱导睡眠时长的影响，催眠药物一般能延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间。记录入睡时间和睡眠时间，比较各浓度精油嗅闻组与PCPA模型对照组之间的差异，检验差异显著性，睡眠时间延长，*P<0.05，表示该浓度精油具有显著的催眠作用，**P<0.01表示该浓度精油具有极显著的催眠作用。

1.1空白组小鼠未建立PCPA失眠模型，将PCPA失眠小鼠随机分为5组，动物分别嗅闻不同梯度浓度的黑云杉精油：低浓度组小鼠吸入体积为625μL/kg/天，中浓度组小鼠吸入体积为1250μL/kg/天，高浓度组小鼠吸入体积为2500μL/kg/天，空白组小鼠吸入含1％Tween80的生理盐水，体积均为2500μL/kg/天，每组中每只小鼠每天嗅闻30分钟；

1.2嗅闻30min结束后注射，用1mL规格的一次性无菌注射器，按小鼠体重0.1mL/10g，给所有组别小鼠腹腔注射戊巴比妥钠。

1.3小鼠腹腔注射操作：事先以注射针筒吸取欲注射的剂量。抓取小鼠，头部朝下腹部朝上，注射针头以30度角插入腹中线右侧。试着回抽针筒，如有血液或液体回流，表示不适当，需重新插入。缓缓将药剂推入。

1.4记录注射时刻(T.R)。注射后小鼠单独放入一个饲养箱内，指标评价：翻正反射消失标准：是指小鼠背部向下保持30s以上，并且1min内不再出现翻正反射为止。记录翻正反射消失的持续时间(翻正反射消失时间至翻正反射重复出现时间)和翻正反射消失的潜伏期。如果怀疑翻正反射是否真正恢复，于第一次翻正后立即重新背位放置，如在1min之内又自动翻过来则前一次的时间即为恢复时间，否则以第二次翻过来的时间为准。

1.4.1入睡潜伏期：为腹腔注射戊巴比妥钠后至翻正反射消失的时间。记录30min内每只小鼠翻正反射消失的时刻，表示小鼠入睡(T.S)。实验结果如图1所示。

1.4.2睡眠时间：即翻正反射消失至觉醒的时间。记录每只小鼠翻正反射恢复的时刻，表示小鼠睡醒(T.W)。计算出每只小鼠睡眠潜伏期(Sleep Latency)和睡眠时间(TotalSleep Time)，Sleep Latency＝T.S-T.R，Total Sleep Time＝T.W-T.S。实验结果如图2所示。

图1为本实施例各组小鼠睡眠潜伏期的测试结果图(与模型组相比，*P<0.05，表示显著，**P<0.01表示极显著)。从图1可以看出，各组别小鼠的睡眠潜伏期缩短幅度不一。相比于模型组，除地西泮阳性对照组以外，实验组低中高浓度黑云杉精油的治疗效果较好，其中，高浓度黑云杉治疗效果最佳。

图2为本实施例各组小鼠睡眠时间的测试结果图(与模型组相比，*P<0.05，表示显著，**P<0.01表示极显著)。从图2可以看出，地西泮阳性对照组睡眠时间高于其它各组，在经过精油治疗后，相比于PCPA模型组，低中高浓度黑云杉精油组睡眠时间都有了不同程度的延长，效果显著。其中，低浓度和中浓度黑云杉精油治疗效果最显著，高浓度效果较显著。

图1和图2的结果说明低中高浓度的黑云杉精油能延长戊巴比妥钠诱导的的睡眠时间，证明黑云杉精油具有助眠效果。

2、尼氏染色检测各组小鼠神经元数量

2.1石蜡切片烤片：将恒温干燥箱的温度设置为60℃，烤片15min；

2.2二甲苯脱蜡：组织切片依次放入二甲苯I和二甲苯II中，各20min；

2.3梯度酒精至水：按照从高到低的浓度，将切片依次放入100％乙醇I和100％乙醇II，各10min；再放入95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇和70％乙醇，各5min；

2.4自来水清洗1次(2min/次)；双蒸水清洗2次(2min/次)；

2.5甲苯胺蓝染液：10min；

2.6染色结束后，进行水洗终止染色：自来水清洗1次(2min/次)；双蒸水清洗2次(2min/次)；

2.7酒精脱水：依次放入70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇，各5min；

2.8二甲苯透明：15min；

2.9显微镜镜检，图像采集分析。

图3为本实施例各组小鼠脑组织尼氏染色海马区神经元显微镜图；图4为本实施例各组小鼠海马体区正常神经元数目统计图。从图3～4可以看出，PCPA模型组小鼠海马区中的神经元细胞数与空白组相比有着明显的削减。低中高浓度黑云杉精油组相比模型组均表现出对海马区神经元数目不同程度增加的现象且呈现浓度依赖性，以黑云杉精油-高浓度组的疗效最为明显。

3、石蜡切片免疫组化检测各组小鼠大脑组织中GABAARɑ1蛋白的表达情况

3.1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ 5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

3.2抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3.3阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3.4血清封闭:在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是ft羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)

3.5加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(Anti-GABA A Receptor alpha 1 Rabbit pAb，GB11716,稀释比IHC 1:600-1:1500)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

3.6加二抗：玻片置于PBS(PH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG，GB23303,稀释比IHC1:200-1:500)覆盖组织，室温孵育50min。

3.7 DAB显色：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

3.8复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

3.9脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min--无水乙醇15min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

3.10显微镜镜检，图像采集分析。

图5为本实施例各组小鼠大脑组织免疫组化切片中GABAARɑ1蛋白表达显微镜图。图6为本实施例各组小鼠大脑组织免疫组化切片中GABAARɑ1蛋白表达柱状图(与模型组相比，*P<0.05，表示显著，**P<0.01表示极显著)。从图5和图6可以看出，相比于空白组，PCPA模型组小鼠大脑组织在海马体和大脑皮层区的GABAARɑ1蛋白表达显著降低；相比于PCPA模型组，中浓度和高浓度黑云杉精油组能显著提高海马体区中的GABAARɑ1蛋白表达量，其中，高浓度黑云杉精油组小鼠海马区GABAARɑ1蛋白表达量提高最显著。

4、对各组小鼠的体重进行测试

分别于造模前、造模后、治疗后，记录各组小鼠体质量变化情况，以反映造模前、造模后、治疗后小鼠的生理情况变化。将收集到的数据绘制成体质量变化率的折线图，折线图如图7所示。

图7为本实施例各组小鼠体重变化折线图。从图7可以看出，相比于空白组，小鼠PCPA造模后，体重显著降低；相比于PCPA模型组，采用地西泮和黑云杉精油治疗后，小鼠的体重折线出现不同程度的回升，实验组中的黑云杉低中高浓度组体重均回升较快。

综上所述，本发明实施例提供的黑云杉精油可以缩短小鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠时间；提高小鼠海马体神经元数量；提高大脑各区域GABAARɑ1蛋白的表达量。说明黑云杉精油具有催眠作用，且助眠效果显著。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.黑云杉提取物在制备助眠产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑云杉提取物为黑云杉醇提物和/或黑云杉水提物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑云杉提取物的原料取自黑云杉的叶、根、花、果实和茎中的一种或两种以上。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑云杉提取物在所述助眠产品中的质量含量为0.001％～10％。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述助眠产品为日化产品。

6.根据权利要求1至5任意一项所述的应用，其特征在于，所述黑云杉提取物为黑云杉精油。

7.一种助眠产品，其特征在于，包括黑云杉提取物。

8.根据权利要求7所述的助眠产品，其特征在于，所述黑云杉提取物为黑云杉精油。

9.根据权利要求7所述的助眠产品，其特征在于，所述助眠产品的给药方式为闻吸、涂抹或香薰。

10.根据权利要求7至9任意一项所述的助眠产品，其特征在于，所述助眠产品中黑云杉提取物的有效剂量为625μL/天/kg～2500μL/天/kg。

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