CN113075188A - 一体化泪液分离检测装置及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一体化泪液分离检测装置及其制备方法，该装置采用一种表面增强拉曼光谱检测基底，其包括基底以及在所述基底表面依次层叠设置的二氧化硅微球层、金溅射层和金纳米粒子层。该表面增强拉曼光谱检测基底的下半部分为无活性的空间性二氧化硅阵列，可以贮存生物蛋白等污垢，而表面由纳米粒子和金溅射层构成高强度、高密度的SERS活性区域，可绑定与金有强相互作用的物质；从而克服了非目标物的非特异性吸附的问题，提高了检测的灵敏度和特异性。

Description

一体化泪液分离检测装置及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物样品检测技术领域，具体涉及一种一体化泪液分离检测装置及其制备方法。

背景技术

人的眼泪含有大量各种生化分子，包含蛋白质、盐类小分子、代谢产物等，通过快速和低成本的方法实现泪液中与疾病相关的生物标记物的识别对于日常医疗保健监测、临床诊断或生理功能研究具有重大意义。例如，泪液中的尿酸水平与血液中的尿酸呈强正相关。此外，眼睛的黄染和血液中的胆红素含量可作为黄疸的关键诊断指标。目前，泪液中生物标志物的分析和检测的手段主要是通过液相色谱-质谱和安培电化学传感器等。但是，这些方法所涉及的设备具有耗时长、体积大且成本高等缺点，从而阻碍对于泪液生物分子的即时诊断平台的构建。

表面增强拉曼散射(SERS)是一种快速和准确的提供分子的振动指纹信息的工具。其超灵敏和无标记分子特异性结合的特性促使SERS成为下一代的诊断技术。目前，SERS的检测目标的范围从有机小生物分子拓展至大分子，甚至细胞、微生物等。几种疾病生物标记物已通过样品分离和色谱纯化等方法处理后实现了唾液、尿液和血液等样品的SERS临床分析。但是，泪液中含量相比于其他生物体液极少，每次只可提取1-2μL，不适用常规的分离手段。当分析物离SERS活性表面太远时，其SERS性能急剧下降。在泪液中，盐类小分子和各种各样的蛋白与目标分析物竞争结合SERS衬底。这种竞争性吸附可认为是传感器的污染，阻止分析物到达SERS基底的“热点”区域，产生大量背景噪音，大大降低了测定的灵敏度和特异性，从而导致临床上假阳性或假阴性的产生。为了削弱非目标物的非特异性吸附的问题，同时促进目标分析物向SERS基底活性区域的扩散，创新的纳米表面分离方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一体化泪液分离检测装置及其制备方法，该装置应用一种单层的具有两面性质的周期性纳米球阵列作为分离传感平台；其下半部分为无活性的空间性二氧化硅阵列，可以贮存生物蛋白等污垢，而表面由纳米粒子和金层构成的高强度、高密度的SERS活性区域，可绑定与金有强相互作用的物质。从而克服了非目标物的非特异性吸附的问题，提高了检测的灵敏度和特异性。

为此，第一方面，本发明提供一种表面增强拉曼光谱检测基底，包括基底以及在所述基底表面依次层叠设置的二氧化硅微球层、金溅射层和金纳米粒子层。

进一步，所述二氧化硅微球层由单层二氧化硅微球组成。

进一步，所述二氧化硅微球的直径为50-1500nm，例如可为50-500nm、400-800nm、800-1200nm、1200-1500nm等；作为示例，所述二氧化硅微球的直径为50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm等。

进一步，所述金溅射层的厚度为10-200nm，例如可为10-100nm、200-180nm、50-190nm等；作为示例，所述金溅射层的厚度为10nm、20nm、50nm、80nm、100nm、130nm、150nm、180nm或200nm等。

进一步，所述金纳米粒子层由单层金纳米粒子组成。

进一步，所述金纳米粒子的直径为2-100nm，例如可为4-50nm；作为示例，所述金纳米粒子的直径为2nm、5nm、10nm、20nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。

进一步，所述基底为玻璃片、硅片、塑料片、钢片等。

本发明的第二方面，提供所述表面增强拉曼光谱检测基底的制备方法，包括：

(1)将聚四氟乙烯槽中充满去离子水，将二氧化硅微球分散液滴加到水面上，使水面完全被二氧化硅微球所覆盖，然后向水面加入表面活性剂；

(2)将基底浸入步骤(1)所述聚四氟乙烯槽的水面以下，向上提拉使所述二氧化硅微球转移至所述基底的表面，即得到修饰有二氧化硅微球层的基底；

(3)向所述二氧化硅微球层表面沉积金溅射层，即制备得到修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底；

(4)取金纳米粒子分散液，加入正己烷以形成油-水体系；向所述油-水体系滴加乙醇，形成金纳米粒子单层膜；

(5)将步骤(3)制备得到的修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底浸入步骤(4)所述的油-水体系的水层，向上提拉使所述金纳米粒子单层膜沉积于所述金溅射层上，即制备得到所述表面增强拉曼光谱检测基底。

进一步，步骤(1)中，所述二氧化硅微球分散液的液相包括甲醇和氯仿，所述甲醇和氯仿的体积比为0.1-10：1，优选为1-2：1-3。

进一步，步骤(1)中，所述二氧化硅微球分散液经过以下预处理：超声。通过超声处理，使得二氧化硅微球分散液更为均匀和稳定，防止二氧化硅微球沉积。进一步，所述超声的时间为0.1-3h，例如0.1h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h。

进一步，步骤(1)中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)溶液。在具体的实施方式中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1-50mg/mL，优选为20-50mg/mL，例如20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL等；所述十二烷基硫酸钠溶液的体积为0.005-0.2mL，例如0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.08mL、0.1mL、0.15mL、0.18mL、0.2mL等。

进一步，步骤(2)中，所述基底经过以下预处理：亲水处理。在具体的实施方式中，通过食人鱼溶液对所述基底进行亲水处理。

进一步，步骤(3)中，通过磁控溅射向所述二氧化硅微球层表面沉积金溅射层。在具体的实施方式中，所述磁控溅射的真空度为0.01-100MPa，优选为1-20MPa，例如2MPa、4MPa、8MPa、10MPa、15MPa、20MPa等；所述磁控溅射的功率为1-200W，优选为20-120W，更优选为40-100W，例如40W、50W、60W、70W、80W、90W、100W；所述磁控溅射的时间为0.1-100min，优选为1-10min，例如1min、2min、5min、8min、10min等。

进一步，步骤(5)中，所述修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底经过以下预处理：等离子清洗。在具体的实施方式中，所述等离子清洗的真空度为1-1000mTorr，优选为50-800mTorr，更优选为200-500mTorr，例如200mTorr、250mTorr、300mTorr、350mTorr、400mTorr、450mTorr、500mTorr等；所述等离子清洗的功率为1-200mW，优选为50-200mW，例如50mW、100mW、150mW、200mW等；所述等离子清洗的时间为0.1-100min，优选为1-10min，例如1min、2min、5min、7min、10min等。

本发明所述的二氧化硅微球、金纳米粒子可以自行制备或者直接购买市售产品，优选为采用本发明提供的方法进行制备。

进一步，所述二氧化硅微球的制备方法包括：制备包含氨水、去离子水和乙醇的混合溶液，向所述混合溶液逐滴加入正硅酸乙酯，在搅拌条件下进行反应，反应完成后依次进行离心、洗涤、分散于甲醇溶液，即制备得到所述二氧化硅微球的悬浮液。

进一步，所述正硅酸乙酯与所述混合溶液的体积之比为3-30：4-100；优选为5-20：4-60，例如当所述正硅酸乙酯的用量为10mL，所述混合溶液的体积为4mL、10mL或50mL。

进一步，在所述二氧化硅微球的制备方法中，所述反应在0-90℃条件下进行；优选为20-70℃，例如20℃、25℃、30℃、50℃或70℃等。所述反应的时间为2-24h；优选为5-18h。

进一步，所述分散于甲醇溶液的步骤采用超声分散。

进一步，在所述二氧化硅微球的制备方法中，所述离心的转速为2000-15000rpm，优选为3000-12000rpm；所述离心的时间为3-10min，优选为5-8min。

进一步，在所述二氧化硅微球的制备方法中，所述洗涤的溶剂可为乙醇；洗涤次数为一次或两次以上，优选为一次、两次或三次。

进一步，所述金纳米粒子的制备方法包括：配制包含二水合柠檬酸三钠、单宁酸和碳酸钾的还原液，在搅拌条件下将所述还原液加入氯金酸溶液中，在保温条件下继续搅拌至反应结束，经冷却后制备得到金纳米粒子溶胶；向所述金纳米粒子溶胶中加入丙酮，离心后收集沉淀物，将所述沉淀物分散于去离子水中，即制备得到所述金纳米粒子的分散液。

进一步，氯金酸溶液的浓度为0.05-0.5mg/mL，例如约0.05mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等。

进一步，所述氯金酸溶液经过以下预处理：对所述氯金酸溶液进行超声，预热至所述保温的温度。

进一步，对所述氯金酸溶液进行超声的时间为0.1-1h，例如0.1-0.5h、0.3-0.8h等。

进一步，所述还原液中，所述二水合柠檬酸三钠的浓度为1-5mg/mL，例如约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL等；所述单宁酸的浓度为0.02-0.1mg/mL，例如约0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.045mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL等；所述碳酸钾的浓度为0.02-0.2mg/mL，例如约0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.13mg/mL、0.2mg/mL等。

进一步，所述保温的温度为20-150℃，优选为50-120℃；所述保温的时间为0.4-12h，优选为0.5-4h，更优选为0.5-1h。

进一步，将所述沉淀物分散于去离子水中的步骤采用超声分散。

进一步，在所述金纳米粒子的制备方法中，所述离心的转速为2000-15000rpm，优选为3000-12000rpm；所述离心的时间为3-10min，优选为5-8min。

进一步，在所述金纳米粒子的制备方法中，将所述沉淀物分散于去离子水之前，还包括以下步骤：对所述沉淀物进行洗涤。在具体的实施方式中，所述洗涤的溶剂可为乙醇；洗涤次数为一次或两次以上，优选为一次、两次或三次。

本发明的第三方面，提供一种一体化泪液分离检测装置，包括相对且间隔设置的第一基底和第二基底以及夹设在所述第一基底和第二基底之间的间隔件；所述第一基底和第二基底之间形成毛细腔；所述毛细腔具有至少一个进液口；

所述第一基底为本发明所述的表面增强拉曼光谱检测基底，所述金纳米粒子层与所述第二基底相对设置。

进一步，所述第二基底为玻璃片、硅片、塑料片、钢片等。

进一步，所述第一基底和/或所述第二基底在所述进液口处具有突出部，用于接触待测泪液。

进一步，所述突出部具有圆形、椭圆形、n角形构造，n为3或大于3的自然数；优选为三角形构造。

进一步，所述间隔件的高度为20-50μm，例如20μm、30μm、40μm、50μm等。

进一步，所述间隔件的数量为一个或两个以上；优选为两个，且所述毛细腔由第一基底、第二基底和两个间隔件围合形成。

进一步，所述毛细腔通过毛细作用吸引并容纳待测泪液。

进一步，所述一体化泪液分离检测装置还包括外壳，所述外壳在与所述第一基底相邻的一面上设有检测窗。

本发明的第四方面，提供本发明所述的表面增强拉曼光谱检测基底和/或本发明所述的一体化泪液分离检测装置在制备通过拉曼光谱检测法检测泪液的产品方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

对于传统的检测平台而言，待测体液——以泪液为例中的蛋白质或者盐类小分子容易非特异性吸附表面，污染检测基底表面，影响和降低目标物与检测基底表面的相互作用。由于远离SERS基底表面信号强度将呈指数性减弱，从而屏蔽信号输出。本发明提供了一种基于具有双面性质的光子晶体的分离检测平台，上层为组装的单层金纳米粒子薄膜，吸附可与金有相互作用的物质，包括静电作用和共价键作用等，可以提供吸附的相应物质的拉曼信号。而弱相互作用的物质则会通过结构的孔洞阵列渗入下去，对微量复杂体现实现初筛分离的目的，可以降低非目标物的干扰和影响。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为实施例1制备的表面增强拉曼光谱检测基底表面AuNPs-FON结构的扫描电镜图；

图2为实施例1制备的表面增强拉曼光谱检测基底表面不同位点间AuNPs-FON结构的拉曼重现性；

图3为本发明提供的一体化泪液分离检测装置示意图；

图4为图3所示的一体化泪液分离检测装置的爆炸图；

其中，1-第一基底，11-第一突出部，2-第二基底，21-第二突出部，3-第一间隔件，4-第二间隔件，5-第一外壳部件，6-第二外壳部件，7-检测窗；

图5为实施例4中对泪液进行检测的拉曼光谱图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

以下实施例所用仪器信息：

扫描电子显微镜(SEM)：日本日立公司的S-4800。

拉曼光谱仪：Horiba公司的LabRAM HR Evolution。

实施例1

(1)二氧化硅微球的合成

将10mL氨水、6mL去离子水和50mL乙醇混合后在30℃的油浴锅恒温预热数分钟，之后将10mL正硅酸乙酯逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，溶液颜色逐渐变为浅白色，经过12h后可以获得800nm的二氧化硅微球。反应结束后，取出并以4000rpm的转速离心10min以去除未反应的原料，再将离心管管底沉淀物分散至甲醇溶液中，离心操作重复三次以进一步提纯；最后超声分散在甲醇溶液中配成质量分数5％的二氧化硅微球悬浮液。配制好的悬浮液需存放在4℃的冰箱中保存防止微球聚集。

(2)玻璃片的亲水处理

将玻璃片切成2×1cm²的大小，在去离子水中超声去掉表面杂质。用浓硫酸和30％过氧化氢以7:3的比例配置成食人鱼溶液，将清洗干净后的玻璃片放入其中并在90℃的恒温箱中放置30min，食人鱼溶液在玻璃片表面上修饰羟基使玻璃片表面超亲水。亲水处理后分别利用乙醇和水洗净残留在玻璃表面的食人鱼溶液，最后将玻璃片放置在乙醇中备用。

(3)二氧化硅微球层的修饰

准备一个特氟龙水槽，并在特氟龙水槽中装满去离子水，将一块干净的玻璃片斜靠在特氟龙水槽的窄边。聚四氟乙烯因其超疏水的性质，在加满水的水槽中继续利用滴管滴加去离子水，可使水平面略高于特氟龙水槽的边缘，在水面上组装的薄膜可以高于水槽边缘。将步骤(1)制备好的5wt％的二氧化硅微球悬浮液以2:3(v:v)的比例和氯仿混合并超声几分钟防止微球聚沉，得到二氧化硅微球分散液。随后用10μL的移液枪吸取二氧化硅微球分散液逐滴滴加在玻璃片上，使其顺着玻璃片滑落至水面，由于氯仿的蒸发作用将二氧化硅微球铺散在水面上。当滴加到一定程度时，二氧化硅微球铺满整个水面，此时滴加2wt％的SDS，水面上的二氧化硅微球在外力作用下自组装成单层膜。将步骤(2)经亲水处理过的玻璃片浸入水中，向上提拉，得到修饰有二氧化硅微球层的基底(密堆积的二氧化硅微球单层膜)。

(4)金纳米粒子的合成

将1mL氯金酸溶液(1wt％)加入79mL去离子水中超声5min，并在60℃恒温油浴锅中预热5min并给予剧烈搅拌。将1mL二水合柠檬酸三钠(4wt％)，0.1mL单宁酸(1wt％)和0.15mL碳酸钾(50mM)加入18.85mL去离子水中配制成还原液。将所述还原液迅速加入预热好的氯金酸溶液中并在相同温度下剧烈搅拌1h，溶液由淡黄变成酒红色。反应结束后，将生成物在室温下进行冷却，得到金纳米粒子溶胶。将30mL丙酮加入所述金纳米粒子溶胶中并以10000rpm的转速进行离心10min，将得到的沉淀物重新超声分散于去离子水中，即制备得到金纳米粒子分散液。

(5)AuNPs-FON结构的合成

将步骤(3)制备得到的修饰有二氧化硅微球层的基底在室温下风干后，利用磁控溅射仪(真空度4MPa，总功率80W)在二氧化硅微球层上沉积一层厚度为100nm的金层，即制备得到修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底。

取新鲜的步骤(4)制备得到的金纳米粒子分散液4mL放置进小烧杯中，向烧杯中滴加2mL正己烷，由于正己烷不溶于水，便形成油-水界面。在油-水体系中滴加一定量的乙醇，乙醇改变了金纳米粒子表面电荷量，使金纳米粒子被提取出来并吸附在油水界面上自组装，形成肉眼可见的金色反光的金纳米粒子单层膜。将修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底放入等离子体清洗机以450mTorr的真空度和150mW的能量清洗3min，去除表面有机物并增强亲水性。然后将处理后的修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底浸入油水体系的水层，缓慢向上提拉使金纳米粒子单层膜沉积于金溅射层表面，得到表面为AuNPs-FON结构的表面增强拉曼光谱检测基底。对该结构进行扫描电镜成像，成像结果如图1所示，二氧化硅微球的直径为500nm，金溅射层厚度为100nm，金纳米粒子的直径为10nm。

实施例2

(1)二氧化硅微球的合成

将8mL氨水、7mL去离子水和600mL乙醇混合后在60℃的油浴锅恒温预热数分钟，之后将8mL正硅酸乙酯逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，溶液颜色逐渐变为浅白色，经过12h后可以获得1000nm的二氧化硅微球。反应结束后，取出并以3000rpm的转速离心5min以去除未反应的原料，再将离心管管底沉淀物分散至甲醇溶液中，离心操作重复两次以进一步提纯；最后超声分散在甲醇溶液中配成质量分数2.5％的二氧化硅微球悬浮液。配制好的悬浮液需存放在4℃的冰箱中保存防止微球聚集。

(2)玻璃片的亲水处理

将玻璃片切成1.5×2cm²的大小，在去离子水中超声去掉表面杂质。用浓硫酸和30％过氧化氢以7:3的比例配置成食人鱼溶液，将清洗干净后的玻璃片放入其中并在90℃的恒温箱中放置15min，食人鱼溶液在玻璃片表面上修饰羟基使玻璃片表面超亲水。亲水处理后分别利用乙醇和水洗净残留在玻璃表面的食人鱼溶液，最后将玻璃片放置在乙醇中备用。

(3)二氧化硅微球层的修饰

准备一个特氟龙水槽，并在特氟龙水槽中装满去离子水，将一块干净的玻璃片斜靠在特氟龙水槽的窄边。聚四氟乙烯因其超疏水的性质，在加满水的水槽中继续利用滴管滴加去离子水，可使水平面略高于特氟龙水槽的边缘，在水面上组装的薄膜可以高于水槽边缘。将步骤(1)制备好的2.5wt％的二氧化硅微球悬浮液以1:1(v:v)的比例和氯仿混合并超声几分钟防止微球聚沉，得到二氧化硅微球分散液。随后用10μL的移液枪吸取二氧化硅微球分散液逐滴滴加在玻璃片上，使其顺着玻璃片滑落至水面，由于氯仿的蒸发作用将二氧化硅微球铺散在水面上。当滴加到一定程度时，二氧化硅微球铺满整个水面，此时滴加5wt％的SDS，水面上的二氧化硅微球在外力作用下自组装成单层膜。将步骤(2)经亲水处理过的玻璃片浸入水中，向上提拉，得到修饰有二氧化硅微球层的基底(密堆积的二氧化硅微球单层膜)。

(4)金纳米粒子的合成

将1.5mL氯金酸溶液(1.2wt％)加入79mL去离子水中超声5min，并在120℃恒温油浴锅中预热5min并给予剧烈搅拌。将1.5mL二水合柠檬酸三钠(4wt％)，1mL单宁酸(1wt％)和0.5mL碳酸钾(40mM)加入18mL去离子水中配制成还原液。将所述还原液迅速加入预热好的氯金酸溶液中并在相同温度下剧烈搅拌0.5h，溶液由淡黄变成酒红色。反应结束后，将生成物在室温下进行冷却，得到金纳米粒子溶胶。将50mL丙酮加入所述金纳米粒子溶胶中并以5000rpm的转速进行离心5min，将得到的沉淀物重新超声分散于去离子水中，即制备得到金纳米粒子分散液。

(5)AuNPs-FON结构的合成

将步骤(3)制备得到的修饰有二氧化硅微球层的基底在室温下风干后，利用磁控溅射仪(真空度8MPa，总功率50W)在二氧化硅微球层上沉积一层厚度为100nm的金层，即制备得到修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底。

取新鲜的步骤(4)制备得到的金纳米粒子分散液5mL放置进小烧杯中，向烧杯中滴加1mL正己烷，由于正己烷不溶于水，便形成油-水界面。在油-水体系中滴加一定量的乙醇，乙醇改变了金纳米粒子表面电荷量，使金纳米粒子被提取出来并吸附在油水界面上自组装，形成肉眼可见的金色反光的金纳米粒子单层膜。将修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底放入等离子体清洗机以300mTorr的真空度和100mW的能量清洗5min，去除表面有机物并增强亲水性。然后将处理后的修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底浸入油水体系的水层，缓慢向上提拉使金纳米粒子单层膜沉积于金溅射层表面，得到表面为AuNPs-FON结构的表面增强拉曼光谱检测基底。

实施例3

本实施例提供一种一体化泪液分离检测装置，参照图3和图4，该装置包括相对且间隔设置的第一基底1和第二基底2以及夹设在所述第一基底1和第二基底2之间的间隔件；所述第一基底1和第二基底2之间形成毛细腔；所述毛细腔具有至少一个进液口；所述第一基底1为实施例1或实施例2制备得到的表面增强拉曼光谱检测基底，所述金纳米粒子层与所述第二基底2相对设置。当所述进液口接触泪液后，所述毛细腔通过毛细作用吸引并容纳待测泪液。

在优选的实施例中，所述第一基底1和所述第二基底2在所述进液口处分别具有第一突出部11和第二突出部21，用于接触待测泪液。所述第一突出部11和第二突出部21可以为圆形、椭圆形、n角形构造，n为3或大于3的自然数。在优选的实施例中，为三角形构造，当采用该构造时，将所述突出部接触待测泪液，所述毛细腔即可通过毛细作用吸引并容纳待测泪液。可根据实际需要调整第一基底1和第二基底2的尺寸规格，在一具体实施例中，所述第一基底1和第二基底2的尺寸规格为1cm×2cm。

在优选的实施例中，所述间隔件的数量为两个，分别为第一间隔件3和第二间隔件4；且所述毛细腔由第一基底1、第二基底2、第一间隔件3和第二间隔件4围合形成。可以根据实际需要调整间隔件的高度，只要使第一基底1和第二基底2之间能够形成具有毛细吸引作用的毛细腔即可。所述第一间隔件3和第二间隔件4的高度可为20-50μm，在一实施例中为40μm。

在优选的实施例中，该一体化泪液分离检测装置还包括由第一外壳部件5和第二外壳部件6围合形成的外壳，所述外壳在与所述第一基底1相邻的一面上设有检测窗7。可以根据实际需要调整检测窗7的尺寸规格，在一实施例中，检测窗7的尺寸规格为0.2cm×0.2cm。通过检测窗7，可以直接将该一体化泪液分离检测装置进行拉曼光谱检测。

实施例4

对20名出现黄疸症状的患者和10名健康人进行泪液成分检测，具体步骤如下：

首先滴加氧氟沙星于眼睛中，轻眨眼睛使得氧氟沙星与泪液混合充分；然后将图3所示的一体化泪液分离检测装置的突出部放在外眼睑处，即可采集泪液；随后将该一体化泪液分离检测装置进行拉曼光谱检测。检测结果如图5所示。根据图5，黄疸病人的拉曼光谱在1495cm^-1存在着较强的拉曼峰，而正常人1495cm^-1几乎没有信号且在510cm^-1处具有拉曼峰，检测的灵敏度高、特异性较好，无干扰峰。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种表面增强拉曼光谱检测基底，其特征在于，包括基底以及在所述基底表面依次层叠设置的二氧化硅微球层、金溅射层和金纳米粒子层。

2.如权利要求1所述的表面增强拉曼光谱检测基底，其特征在于，所述二氧化硅微球层由单层二氧化硅微球组成；优选地，所述二氧化硅微球的直径为50-1500nm；

优选地，所述金溅射层的厚度为10-200nm；

优选地，所述金纳米粒子层由单层金纳米粒子组成；优选地，所述金纳米粒子的直径为2-100nm；

优选地，所述基底为玻璃片、硅片、塑料片或钢片。

3.权利要求1或2所述的表面增强拉曼光谱检测基底的制备方法，其特征在于包括：

(1)将聚四氟乙烯槽中充满去离子水，将二氧化硅微球分散液滴加到水面上，使水面完全被二氧化硅微球所覆盖，然后向水面加入表面活性剂；

(2)将基底浸入步骤(1)所述聚四氟乙烯槽的水面以下，向上提拉使所述二氧化硅微球转移至所述基底的表面，即得到修饰有二氧化硅微球层的基底；

(3)向所述二氧化硅微球层表面沉积金溅射层，即制备得到修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底；

(4)取金纳米粒子分散液，加入正己烷以形成油-水体系；向所述油-水体系滴加乙醇，形成金纳米粒子单层膜；

(5)将步骤(3)制备得到的修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底浸入步骤(4)所述的油-水体系的水层，向上提拉使所述金纳米粒子单层膜沉积于所述金溅射层上，即制备得到所述表面增强拉曼光谱检测基底。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述二氧化硅微球分散液的液相包括甲醇和氯仿，所述甲醇和氯仿的体积比为0.1-10：1；

优选地，步骤(1)中，所述二氧化硅微球分散液经过以下预处理：超声；优选地，所述超声的时间为0.1-3h；

优选地，步骤(1)中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠溶液；优选地，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1-50mg/mL，体积为0.005-0.2mL；

优选地，步骤(2)中，所述基底经过以下预处理：亲水处理；优选地，通过食人鱼溶液对所述基底进行亲水处理；

优选地，步骤(3)中，通过磁控溅射向所述二氧化硅微球层表面沉积金溅射层；优选地，所述磁控溅射的真空度为0.01-100MPa；优选地，所述磁控溅射的功率为1-200W；优选地，所述磁控溅射的时间为0.1-100min；

优选地，步骤(5)中，所述修饰有二氧化硅微球层和金溅射层的基底经过以下预处理：等离子清洗；优选地，所述等离子清洗的真空度为1-1000mTorr；优选地，所述等离子清洗的功率为1-200mW；优选地，所述等离子清洗的时间为0.1-100min。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅微球的制备方法包括：制备包含氨水、去离子水和乙醇的混合溶液，向所述混合溶液逐滴加入正硅酸乙酯，在搅拌条件下进行反应，反应完成后依次进行离心、洗涤、分散于甲醇溶液，即制备得到所述二氧化硅微球的悬浮液；

优选地，所述正硅酸乙酯与所述混合溶液的体积之比为3-30：4-100；

优选地，在所述二氧化硅微球的制备方法中，所述反应在0-90℃条件下进行；所述反应的时间为2-24h。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述金纳米粒子的制备方法包括：配制包含二水合柠檬酸三钠、单宁酸和碳酸钾的还原液，在搅拌条件下将所述还原液加入氯金酸溶液中，在保温条件下继续搅拌至反应结束，经冷却后制备得到金纳米粒子溶胶；向所述金纳米粒子溶胶中加入丙酮，离心后收集沉淀物，将所述沉淀物分散于去离子水中，即制备得到所述金纳米粒子的分散液；

优选地，氯金酸溶液的浓度为0.05-0.5mg/mL；

优选地，所述氯金酸溶液经过以下预处理：对所述氯金酸溶液进行超声，预热至所述保温的温度；优选地，对所述氯金酸溶液进行超声的时间为0.1-1h；

优选地，所述还原液中，所述二水合柠檬酸三钠的浓度为1-5mg/mL；所述单宁酸的浓度为0.02-0.1mg/mL；所述碳酸钾的浓度为0.02-0.2mg/mL；

优选地，所述保温的温度为20-150℃；所述保温的时间为0.4-12h。

7.一种一体化泪液分离检测装置，其特征在于，包括相对且间隔设置的第一基底和第二基底以及夹设在所述第一基底和第二基底之间的间隔件；所述第一基底和第二基底之间形成毛细腔；所述毛细腔具有至少一个进液口；

所述第一基底为权利要求1或2所述的表面增强拉曼光谱检测基底，所述金纳米粒子层与所述第二基底相对设置。

8.如权利要求7所述的一体化泪液分离检测装置，其特征在于，所述第一基底和/或所述第二基底在所述进液口处具有突出部，用于接触和采集待测泪液；

优选地，所述突出部具有圆形、椭圆形或n角形构造，n为3或大于3的自然数；

优选地，所述间隔件的高度为20-50μm；

优选地，所述间隔件的数量为一个或两个以上；

优选地，所述毛细腔通过毛细作用吸引并容纳待测泪液。

9.如权利要求7所述的一体化泪液分离检测装置，其特征在于，所述一体化泪液分离检测装置还包括外壳，所述外壳在与所述第一基底相邻的一面上设有检测窗。

10.权利要求1或2所述的表面增强拉曼光谱检测基底和/或权利要求7-9任一项所述的一体化泪液分离检测装置在制备通过拉曼光谱检测法检测泪液的产品方面的应用。

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